CircFoxo3调节miR-130a-5p/TEAD1轴对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡影响的实验研究

目的探讨环状RNA叉头框蛋白O3(CircFoxo3)调节miR-130a-5p/TEA域转录因子1(TEAD1)轴对心力衰竭(HF)大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法将SD大鼠分为对照组、HF组、si-NC组、si-CircFoxo3组、agomir NC组、miR-130a-5p agomir组、si-CircFoxo3+antagomir NC组、si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir组,每组18只。除对照组外,其他组大鼠均通过腹腔注射盐酸阿霉素的方法构建HF大鼠模型。建模成功后进行药物处理,每3 d给药一次,持续3周。应用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测心肌组织中CircFoxo3、miR-130a-5p表达水平。应用彩色多普勒超声仪检测大鼠左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清人基质裂解素2(ST_(2))、N端脑钠肽前体(NT-pro BNP)水平。应用HE染色、Masson染色检测大鼠心肌组织病理变化和心肌纤维化情况。通过TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。应用Western blot法检测大鼠心肌组织TEA域转录因子1(TEAD1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验验证CircFoxo3与miR-130a-5p、miR-130a-5p与TEAD1的关系。结果与对照组比较,HF组大鼠心肌组织病理损伤、心肌纤维化严重,LVESD、LVEDD水平上升,心肌组织CircFoxo3及TEAD1、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,血清ST_(2)、NT-pro BNP水平升高,心肌细胞凋亡率升高,LVEF、miR-130a-5p和Bcl-2蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与HF组、si-NC组比较,si-CircFoxo3组大鼠心肌组织病理损伤减轻,LVESD、LVEDD水平降低,心肌组织CircFoxo3及TEAD1、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,血清ST_(2)、NT-pro BNP水平降低,心肌细胞凋亡率降低,LVEF、miR-130a-5p及Bcl-2蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与HF组、agomir NC组比较,miR-130a-5p agomir组大鼠心肌组织病理损伤、心肌纤维化有所改善,LVESD、LVEDD水平降低,心肌组织TEAD1、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,血清ST_(2)、NT-pro BNP水平降低,心肌细胞凋亡率降低,LVEF、miR-130a-5p及Bcl-2蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-CircFoxo3组、si-CircFoxo3+antagomir NC组比较,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir组大鼠心肌组织病理损伤、心肌纤维化加剧,LVESD、LVEDD水平升高,心肌组织TEAD1、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,血清ST_(2)、NT-pro BNP水平升高,心肌细胞凋亡率升高,LVEF、miR-130a-5p、Bcl-2蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。CircFoxo3与miR-130a-5p、miR-130a-5p与TEAD1存在靶向关系。结论沉默CircFoxo3可能通过海绵化上调miR-130a-5p来抑制TEAD1表达,进而抑制HF大鼠心肌细胞凋亡。

miR-130a-5p靶向Runx2对牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响及其调控机制研究

目的:探究miR-130a-5p靶向Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)对牙槽骨成骨细胞(Alveolar osteoblast,AOB)增殖、凋亡、成骨分化的影响及其机制。方法:将AOB分为NC组、miR-NC组、miR-130a-5p组、miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组。双荧光素酶报告验证miR-130a-5p对Runx2、Sonic hedgehog(SHH)的调控关系;CCK-8及EdU染色检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡能力;ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力;RT-qPCR检测miR-130a-5p、Runx2、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1(Gli1)mRNA水平;Western Blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein,Bax)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Runx2、SHH、Gil1水平。结果:miR-130a-5p靶向调控Runx2、SHH。过表达miR-130a-5p后,细胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率降低,细胞凋亡率升高,成骨分化能力降低,miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高,Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。过表达miR-130a-5p和Runx2或过表达miR-130a-5p和SHH可减弱过表达miR-130a-5p对细胞增殖、凋亡、成骨分化的影响。结论:miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化,并促进AOB凋亡,其可能通过抑制SHH信号通路发挥作用。

LncRNAFEZF1-AS1通过miR-130a-5p/CCND1轴促进非小细胞肺癌发展的分子机制研究

目的探讨FEZF1-AS1通过miR-130a-5p/CCND1轴促进非小细胞肺癌(NSCLC)发展的分子机制。方法利用TCGA数据库分析FEZF1-AS1在NSCLC中的表达,qRT-PCR检测其在NSCLC癌组织与癌旁组织以及NSCLC细胞系中的表达,并分析其与临床特征的关系。利用数据库预测FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p的结合位点以及hsa-miR-130a-5p与CCND1的结合位点;应用CCK8、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验检测FEZF1-AS1、hsa-miR-130a-5p对肺癌细胞系增殖、侵袭、迁移能力的影响;双荧光素酶报告实验验证FEZF1-AS1与hsa-miR-130a-5p以及hsa-miR-130a-5p与CCND1存在结合;将H1299、H358分别分为si-NC组、si-FEZF1-AS1组、si-FEZF1-AS1+NC inhibitor组、si-FEZF1-AS1+hsa-miR-130a-5p inhibitor组,应用Western blot检测CCND1的蛋白表达水平,明确FEZF1-AS1/hsa-miR-130a-5p是否通过ceRNA机制调控了CCND1的表达。结果FEZF1-AS1在NSCLC中呈高表达,且在NSCLC癌组织中的表达量明显增高(P<0.05),高表达与NSCLC的淋巴结转移有关,在H1299、H358细胞系中的表达量也显著增高(P<0.05);敲减FEZF1-AS1降低了NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力(P<0.05);hsa-miR-130a-5p与FEZF1-AS1、CCND1之间存在结合(P<0.05);hsa-miR-130a-5p影响NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力(P<0.05);si-FEZF1-AS1降低了CCND1蛋白表达,hsa-miR-130a-5p inhibitor逆转了si-FEZF1-AS对CCND1的敲减作用(P<0.05)。结论FEZF1-AS1在NSCLC组织中高表达,且与淋巴结转移有关,促进了NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭,并通过miR-130a-5p/CCND1轴促进了非小细胞肺癌的发展。

lncRNA MAGI2-AS3靶向调控miR-130a-5p对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的影响

目的:探讨lncRNA MAGI2-AS3靶向miR-130a-5p调控柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的分子机制。方法:对照组,用不含药物、病毒的DMEM处理H9C2细胞48 h。CVB3组,用含有100倍半数组织培养感染剂量CVB3的DMEM处理H9C2细胞48 h(感染)。CVB3+sh-NC组,H9C2细胞转染sh-NC慢病毒后感染CVB3。CVB3+sh-MAGI2-AS3组,H9C2细胞转染sh-MAGI2-AS3慢病毒后感染CVB3。CVB3+miR-NC组,H9C2细胞转染miR-NC后感染CVB3。CVB3+miR-130a-5p组,H9C2细胞转染miR-130a-5p mimic后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-NC共转染H9C2细胞后感染CVB3。sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组,sh-MAGI2-AS3、抗miR-130a-5p共转染H9C2细胞后感染CVB3。qRT-PCR检测MAGI2-AS3、miR-130a-5p相对表达量;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测TNF-α、IL-6分泌水平;双荧光素酶报告实验验证MAGI2-AS3与miR-130a-5p靶向关系;Western blot检测Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量。结果:与对照组比较,CVB3组MAGI2-AS3相对表达量、细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,而miR-130a-5p相对表达量、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。分别与CVB3+sh-NC组、CVB3+miR-NC组相比,CVB3+sh-MAGI2-AS3组、CVB3+miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。MAGI2-AS3可靶向调控miR-130a-5p表达。与sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组比较,sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:沉默MAGI2-AS3可通过上调miR-130a-5p而抑制细胞凋亡、炎症反应,进而减轻CVB3诱导的H9C2细胞损伤。

lncRNA MEG3靶向miR-130a-5p调控人视网膜色素上皮细胞损伤的研究

目的探讨lncRNA MEG3在年龄相关性黄斑变性(AMD)患者中的表达及其靶向miR-130a-5p对人视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的影响。方法选取2020年6月至2021年8月永州职业技术学院附属医院收治的AMD患者38例以及同期的健康体检者38例,收集其空腹静脉血,qRT-PCR检测其血清lncRNA MEG3表达水平。不同浓度(0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L)过氧化氢(H2O2)处理人RPE细胞系ARPE-19细胞构建RPE细胞损伤模型,并检测lncRNA MEG3在H2O2处理的ARPE-19细胞中表达。双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验分析lncRNA MEG3与miR-130a-5p的靶向关系。ARPE-19细胞分为对照组(常规培养,不进行任何特殊处理)、H2O2组(200μmol/L H2O2处理24 h)、Vector组(转染pcDNA3.1-NC 24 h后200μmol/L H2O2处理24 h)、lncRNA MEG3组(转染pcDNA3.1-lncRNA MEG324 h后200μmol/L H2O2处理24 h)、lncRNA MEG3+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-NC 24 h后200μmol/L H2O2处理24 h)、lncRNA MEG3+miR-130a-5p组(共转染pcDNA3.1-lncRNA MEG3和miR-130a-5p mimics 24 h后200μmol/L H2O2处理24 h),qRT-PCR检测各组细胞中lncRNA MEG3、miR-130a-5p表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,2,7-二氯二氢代荧光黄二醋酸(DCFH-DA)荧光探针法、硫代巴比妥酸(TBA)法、水溶性四唑盐1(WST-1)法分别检测各组细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,ELISA法检测各组细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、β-淀粉样蛋白(Aβ)水平,Western blot检测各组细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)通路相关蛋白表达。结果与健康体检者比较,lncRNA MEG3在AMD患者血清中呈低表达(P<0.05)。与0μmol/L H2O2处理组比较,100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L H2O2处理ARPE-19细胞均可降低细胞存活率以及下调细胞中lncRNA MEG3表达水平(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实lncRNA MEG3与miR-130a-5p存在靶向关系。过表达lncRNA MEG3通过下调miR-130a-5p表达提供了H2O2诱导的ARPE-19细胞存活率、SOD水平及Nrf2、HO-1蛋白表达水平,降低了细胞凋亡率及ROS、MDA、IL-6、TNF-α、Aβ水平(P<0.05)。结论lncRNA MEG3在AMD患者血清中呈低表达,上调lncRNA MEG3可靶向负调控miR-130a-5p表达,激活Nrf2/HO-1通路,减轻人RPE细胞氧化应激和炎症反应,保护细胞免受损伤。

lncRNA LINC00173通过调节miR-130a-5p抑制骨肉瘤发生发展的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00173通过调控miR-130a-5p抑制骨肉瘤发生发展的分子机制。方法:体外培养人骨肉瘤细胞系MG-63,分别将LINC00173过表达载体质粒或空载质粒转染至MG-63细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染效率,采用细胞计数法(CCK-8)和Transwell实验分析MG-63细胞增殖、侵袭和迁移能力,双荧光素酶报告基因实验和qPCR检测LINC00173和miR-130a-5p的靶向调控关系。同时过表达LINC00173和miR-130a-5p,并检测MG-63细胞增殖、侵袭和迁移能力。结果:qPCR检测结果显示,与Mock组比较,pc-LINC00173组LINC00173在MG-63细胞中的表达量明显升高(P<0.01)。转染48 h和72 h后,pc-LINC00173组细胞增殖活力均低于Mock组和pcDNA组(P<0.01)。Transwell检测结果显示,pc-LINC00173组与Mock组比较侵袭和迁移细胞数明显减少(P<0.05)。LINC00173与miR-130a-5p之间存在特异性结合位点,与miR-NC组比较,转染miR-130a-5p mimics能够抑制LINC00173-Wt细胞的相对荧光素酶活性(P<0.01),与Mock组和pcDNA组比较,pc-LINC00173组MG-63细胞中miR-130a-5p的表达量均降低(P<0.01)。与pc-LINC00173组和pc-LINC00173+miR-NC组比较,pc-LINC00173+miR-130a-5p组MG-63细胞中miR-130a-5p的表达明显升高,吸光度值明显升高,侵袭和迁移细胞数明显增多(P<0.01)。结论:LINC00173能够抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移,其作用机制可能与靶向抑制miR-130a-5p的表达有关。

circSMAD2靶向miR-130a-5p/Twist调控肝细胞癌EMT的机制

目的验证SMAD2内源性非编码RNA(circSMAD2)能否靶向miR-130a-5p/Twist调控肝细胞癌(HCC)上皮间质转化(EMT)抑制肝癌转移。方法对肿瘤组织及癌旁组织进行测序分析,寻找差异基因,并分析其在肝癌细胞系和组织中的表达。为了探索circSMAD2、miR-130a-5p在体外的功能,分别对circSMAD2、miR-130a-5p进行高低表达,应用Transwell、伤口愈合、集落形成、细胞计数试剂盒(CCK)-8、荧光素酶报告基因法、免疫印迹等实验来确定circSMAD2、miR-130a-5p与Twist的相关性。结果circSMAD2在HCC细胞系和肿瘤组织表达均低于正常肝细胞和正常肝组织。circSMAD2表达水平越高,HCC患者临床预后越好。circSMAD2敲低显著促进HCC细胞侵袭增殖。HePG2、Hcclm3细胞miR-130a-5p组24、48 h抑制率、24 h迁移率、侵袭率、细胞活力、Vimentin蛋白表达明显低于NC mimics组,E-cadherin蛋白明显高于NC-mimics组(P<0.05,P<0.01),与NC mimics组比较,miR-130a-5p组中Twist表达明显下降(P<0.05,P<0.01)。miR-130a-5p与Twist在肝癌细胞中的表达水平呈负相关(r=-0.5849,P=0.022)。与NC mimics组比较,circSMAD2组miR-130a-5p表达量明显上调,侵袭率、Twist mRNA及蛋白表达量下调(P<0.05,P<0.01);与circSMAD2组比较,circSMAD2+si-miR-130a-5p组miR-130a-5p表达量明显下调,侵袭率、Twist mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01)。与NC mimics组比较,circSMAD2组24 h时细胞抑制率明显降低(P<0.05);与circSMAD2组比较,circSMAD2+si-miR-130a-5p组24 h时细胞抑制率明显升高(P<0.05)。结论circSMAD2是一个全新的参与肝癌进展的circRNA。circSMAD2通过miR-130a-5p/Twist轴抑制HCC的进展。

益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠miR-126a-5p及VEGF信号通路的影响

目的探讨益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p(miR-126a-5p)及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的影响。方法30只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法均分为假手术组、模型组和中药组。模型组、中药组均制备脊髓型颈椎病模型。中药组给予益气活血通络方灌胃,假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,均为12周。各组干预结束后进行大鼠行为学测试,测定机械性刺激阈值和热刺激回缩时间。处死大鼠,HE染色观察各组椎间盘软骨终板结构的差异。TUNEL染色观察大鼠椎间盘纤维环细胞变化。实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠椎间盘纤维环组织miR-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法检测大鼠椎间盘纤维环组织VEGF蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠椎间盘血管芽数目减少,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏明显、大量凋亡且细胞密度降低;模型组和中药组机械性刺激阈值降低,热刺激回缩时间缩短,miR-126a-5p水平降低,VEGF mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,中药组大鼠椎间盘血管芽数目增加,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏减轻,大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡减少且细胞密度增加,机械性刺激阈值升高,热刺激回缩时间延长,miR-126a-5p水平增加,VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的机制可能与上调miR-126a-5p、下调VEGF表达有关。

骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

胡黄连提取物通过miR-26a-5p/NF-κB通路影响缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激的实验研究

目的:探究胡黄连提取物通过miR-26a-5p/NF-κB通路影响缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡和氧化应激的作用。方法:通过缺氧/复氧(H/R)诱导H9C2细胞建立心肌细胞损伤模型,细胞分为空白对照组、模型组、胡黄连提取物低浓度(250μg/mL)组、胡黄连提取物中浓度(500μg/mL)组、胡黄连提取物高浓度(1000μg/mL)组、miR-NC组、miR-26a-5p组、anti-miR-NC+胡黄连提取物高浓度组、anti-miR-26a-5p+胡黄连提取物高浓度组。CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡;Western Blot检测cleaved Caspase-3、Bax、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达;ELISA检测MDA、SOD、CAT水平;qRT-PCR检测miR-26a-5p表达。结果:与空白对照组比较,模型组细胞凋亡率、MDA、p-NF-κB/NF-κB水平及cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,细胞增殖能力、SOD、CAT水平及miR-26a-5p表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,胡黄连提取物可显著降低缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡率及MDA、p-NF-κB/NF-κB水平和cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达,显著升高细胞增殖能力及SOD、CAT水平和miR-26a-5p表达(P<0.05)。抑制anti-miR-26a-5p可逆转胡黄连提取物对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激的影响。结论:胡黄连提取物可能通过调控miR-26a-5p/NF-κB通路抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。

黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

Linc01419调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖与侵袭

目的:探讨长链非编码RNA Linc01419对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制。方法:通过UALCAN软件(https://ualcan.path.uab.edu/)分析TCGA数据库中Linc01419在膀胱癌组织与正常膀胱组织中的表达差异;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Linc01419在不同膀胱癌细胞系、22例经病理证实为膀胱癌的手术患者的肿瘤组织及癌旁正常膀胱组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)实验和Transwell小室侵袭实验检测敲低Linc01419表达对膀胱癌细胞增殖与侵袭的影响;采用双荧光素酶报告基因检测法分析Linc01419与miR-34a-5p及miR-34a-5p与E2F3之间的靶向调控关系。结果:UALCAN数据库分析显示相较正常膀胱组织,Linc01419在膀胱癌组织中显著高表达(P<0.001);RT-qPCR分析结果显示相较癌旁正常膀胱组织,Linc01419在22例膀胱癌组织中表达明显上调(P<0.001),与UALCAN数据库分析结果一致;Linc01419在4株膀胱癌细胞中的表达明显高于正常膀胱上皮细胞(P<0.01);敲低Linc01419表达,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及N-cadherin、PCNA蛋白的表达,而显著促进E-cadherin的蛋白表达(P<0.05);miR-34a-5p过表达对膀胱癌细胞具有类似的抑制作用;双荧光素酶报告基因实验、RIP及Pull-down实验证实Linc01419可靶向结合miR-34a-5p,而后者进一步介导了对E2F3的靶向调控;抑制miR-34a-5p表达,可显著削弱Linc01419沉默对膀胱癌细胞生物学行为及E-cadherin、N-cadherin、PCNA、E2F3表达的影响。结论:Linc01419在膀胱癌中异常高表达,其通过调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖和侵袭,很可能是膀胱癌发生、发展过程中的一个重要环节。

miR-25a-5p促进乳腺癌蒽环类药物治疗所致的心肌损伤

目的:探讨蒽环类药物诱导心肌毒性的机制和新的治疗靶点。方法:106例乳腺癌患者根据超声心动图检查鉴别出肿瘤治疗相关心功能障碍,分为心功能障碍组及对照组。通过微阵列技术高通量筛选两组患者差异表达miRNA。体外构建蒽环类药物诱导H9C2心肌细胞损伤模型,通过调控miR-25a-5p的表达,观察miR-25a-5p在蒽环类药物诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用。结果:乳腺癌患者中9例发生肿瘤治疗相关心功能障碍,并从两组患者中鉴定出9个差异表达的miRNA。其中8个miRNA在体外模型中进一步得到验证,尤其是miR-25a-5p。通过上调miR-25a-5p,可进一步加重蒽环类药物诱导心肌细胞氧化损伤。结论:miR-25a-5p促进蒽环类药物诱导的心肌损伤,可能是新的生物标志物及治疗靶点。

NONHSAT248596.1内源性竞争miR-146a-5p调控骨关节炎软骨退变的机制

背景:目前已有针对lncRNA\miRNA\mRNA的共表达网络对骨关节炎发生发展调控机制的研究,课题组前期研究已通过数据库筛选出符合条件的NONHSAT248596.1和miR-146a-5p,尚缺乏体内实验来验证上述调控机制。目的:探究NONHSAT248596.1在基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴介导体内骨关节炎软骨退变进程中对miR-146a-5p发挥的竞争性内源性RNA调控作用。方法:取36只新西兰兔,通过向右侧后肢膝关节注射基质细胞衍生因子1溶液建立骨关节炎模型,采用随机数字表法分4组,lncRNA组、miRNA组、ceRNA组、对照组分别向造模膝关节内注射NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p+NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体及空慢病毒载体。造模第4,8,12周,取膝关节软骨组织和软骨下骨组织进行相关检测。结果与结论:①苏木精-伊红与番红O固绿染色显示,4组软骨组织都有不同程度的退变表现,造模第4周时,lncRNA组软骨组织中的软骨细胞肿胀、细胞极性消失,细胞外基质破坏,出现表层糜烂、裂缝形成和软骨组织局部或全层缺失,并随时间延长软骨损伤程度逐渐加重,4组中miRNA组关节软骨炎症进展最缓慢;②qRT-PCR检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量高于其他3组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量低于其他3组(P<0.05);造模后第8,12周,miRNA组软骨组织中的NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量低于ceRNA组、对照组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);③Western Blot检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量始终低于其他3组(P<0.05);miRNA组造模后第8,12周软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);④结果表明,miR-146a-5p作为NONHSAT248596.1的作用靶点会受到其竞争性内源性RNA的作用造成活性被抑制,NONHSAT248596.1作用于miR-146a-5p后调控基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴,影响骨关节炎软骨组织中基质金属蛋白、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达,造成细胞外基质的降解及蛋白多糖的丢失。

LncRNA MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA/B介导结直肠癌细胞免疫逃逸

目的:探究长链非编码RNA母系表达基因8(LncRNA MEG8)通过靶向miR-15a-5p调控MHCⅠ类相关蛋白A/B(MICA/B)介导的结直肠癌(CRC)细胞免疫逃逸机制。方法:RT-qPCR、Western blot检测CRC组织和细胞系MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平;双荧光素酶实验验证MEG8对miR-15a-5p的调控关系;采用脂质体转染法将NC、MEG8、miR-NC、miR-15a-5p分别或共转染至SW480、SW620细胞,记为NC组、MEG8组、MEG8+miR-NC组、MEG8+miR-15a-5p组;将NK细胞分别与SW480、SW620细胞共培养;ELISA检测共培养液中TNF-α、IFN-γ水平;CCK-8、EdU染色、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR、Western blot检测细胞MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平。结果:与癌旁组织或正常结肠上皮细胞相比,CRC组织和细胞系中MEG8、MICA、MICB、NKG2D mRNA和蛋白水平降低,miR-15a-5p水平升高(P<0.05)。MEG8靶向调控miR-15a-5p。共培养体系中,与NC组相比,MEG8组细胞MICA、MICB、NKG2D蛋白水平、共培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平明显升高,培养1 d、2 d、3 d后,OD值、EdU阳性率、迁移和侵袭细胞数明显降低(P<0.05);过表达miR-15a-5p能部分逆转过表达MEG8对细胞MICA、MICB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ水平和增殖、侵袭转移能力的影响(P<0.05)。结论:MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA、MICB表达,促进NK细胞活性,抑制CRC细胞免疫逃逸。

miR-550a-5p诊断非小细胞肺癌脊柱骨转移的价值

目的探究微小RNA(miR)-550a-5p诊断非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)脊柱骨转移的价值,为临床防治提供参考。方法选取2019年1月~2023年1月承德医学院附属医院收治的62例存在脊柱骨转移NSCLC患者,44例无脊柱骨转移NSCLC患者,根据磁共振成像或CT检查证实,分别纳入脊柱骨转移组、无脊柱骨转移组。检测比较两组血清miR-550a-5p、肺肿瘤标志物[癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19可溶性片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)]、骨代谢标志物[Ⅰ型胶原吡啶交联氨基末端肽(NTx)、骨转异性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、Ⅰ型胶原羧基末端肽(typeⅠcollagen carboxy-terminal cross-linked peptide,ICTP)]水平,比较不同临床特征NSCLC患者血清miR-550a-5p水平,分析NSCLC脊柱骨转移分级与血清miR-550a-5p水平的相关性,受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-550a-5p对NSCLC脊柱骨转移的诊断价值。结果脊柱骨转移组血清miR-550a-5p、CEA、NSE、CYFRA21-1、BALP、ICTP、NTx水平均高于无脊柱骨转移组(P<0.05);脊柱骨转移组不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期、骨转移数量、淋巴结转移、骨相关事件、伴骨痛症状等临床特征NSCLC患者miR-550a-5p水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同骨转移分级NSCLC患者血清miR-550a-5p、NSE、BALP、CEA、ICTP、CYFRA21-1、NTx水平比较差异有统计学意义(P<0.05),随骨转移分级增加血清miR-550a-5p水平、肺肿瘤标志物、骨代谢标志物均呈升高趋势。Spearman相关性分析显示,血清miR-550a-5p水平与骨转移分级、CEA、NSE、CYFRA21-1、BALP、ICTP、NTx均呈正相关(P<0.05);血清miR-550a-5p、肺肿瘤标志物、骨代谢标志物联合诊断的AUC值0.941(95%CI:0.878~0.978)(P<0.05),大于肺肿瘤标志物、骨代谢标志物联合诊断的AUC值0.902(95%CI:0.829~0.951)。结论miR-550a-5p应用于NSCLC脊柱骨转移诊断的价值较高,其水平与骨转移分级、肺肿瘤标志物、骨代谢标志物联系密切,加入miR-550a-5p可提高诊断价值。

miR-125a-5p通过靶向STAT3减轻戊四唑诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应

目的:探讨miR-125a-5p通过靶向信号转导与转录激活因子3(STAT3)对戊四唑(PTZ)诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应的影响。方法:采用PTZ点燃法建立大鼠癫痫模型,并将其随机分为6组:Con组、PTZ组、PTZ+agomir NC组、PTZ+miR-125a-5p agomir组、PTZ+miR-125a-5p agomir+pcDNA组和PTZ+miR-125a-5p agomir+pc-STAT3组,评价miR-125a-5p对大鼠癫痫持续时间、潜伏期、惊厥次数和严重程度的影响。qRT-PCR检测miR-125a-5p和STAT3 mRNA表达;改良神经系统严重程度评分(mNSS)、开场实验和Rotarod测试评价癫痫大鼠的神经功能;Morris水迷宫实验评价癫痫大鼠的认知功能;免疫染色观察海马CA1和CA3区域神经元凋亡;ELISA检测海马组织炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18)水平;Western blot检测海马组织中STAT3蛋白表达;双荧光素酶实验验证miR-125a-5p和STAT3的关系。结果:在PTZ诱导的癫痫大鼠中,miR-125a-5p表达上调,STAT3表达下调,且miR-125a-5p靶向抑制STAT3表达。与PTZ组相比,PTZ+miR-125a-5p agomir组癫痫大鼠的潜伏期缩短,癫痫评分降低,癫痫发作时间和次数减少,mNSS降低,掉落潜伏期及外围区域的移动距离、开放区域的总距离延长,逃避潜伏期显著降低,穿越平台次数及停留在目标象限的时间和游泳距离均增加,海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18表达降低,CA3和CA1区的NenN+细胞增多(P<0.05);STAT3过表达可逆转miR-125a-5p agomir对癫痫大鼠神经功能障碍及炎症反应的缓解作用(P<0.05)。结论:miR-125a-5p通过靶向下调STAT3,减轻PTZ诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应。

miR-146a-5p miR-155-5p在寻常型银屑病不同体液外泌体中的表达

目的 探讨外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达及意义。方法 采用超速离心法提取40例寻常型银屑病患者血浆、唾液和尿液中外泌体,利用投射电镜观察外泌体形态,并提取RNA,利用核酸测定仪检测RNA浓度,RT-qPCR检测miR-146a-5p、miR-155-5p的表达水平。结果 外泌体外形呈现圆形或椭圆形,直径均在60~200 nm;外泌体RNA在银屑病患者血浆、唾液、尿液中的浓度分别为3.9 ng/μl、61.6 ng/μl、0.57 ng/μl;外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达分别为血浆(0.01±0.002)、(0.06±0.002),尿液(1.03±0.02)、(0.95±0.08),唾液(0.02±0.00)、(0.18±0.01)。结论 外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者不同体液中存在表达性差异,从微观角度研究银屑病,有利于为今后的诊断、治疗及发病机制的研究提供科研依据。

血清miR-200a-3p与miR-30a-5p表达在心力衰竭诊断及预后评估中的价值

目的分析血清中微小核糖核酸200a-3p(miR-200a-3p)和微小核糖核酸30a-5p(miR-30a-5p)表达在心力衰竭(HF)诊断以及HF患者预后评估中的价值。方法前瞻性选取内蒙古医科大学附属医院2018年4月~2020年4月期间收治的HF患者131例为研究对象(HF组),同时期健康体检志愿者131例为对照组;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平;采用Spearman相关分析血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p水平与HF患者病情严重程度的相关性;采用ROC曲线分析血清miR-200a-3p和miR-30a-5p对HF的诊断价值;采用Logistic回归分析HF患者预后的影响因素;采用Kaplan-Meier生存分析血清miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平与HF患者预后的关系。结果与对照组相比,HF组血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);轻度HF、中度HF和重度HF患者血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平依次升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Spearman相关分析显示,血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平与HF患者病情严重程度呈正相关(r_(s)=0.442,r_(s)=0.564,均P<0.05);ROC曲线分析结果显示,miR-200a-3p和miR-30a-5p联合诊断HF较miR-200a-3p和miR-30a-5p单一指标诊断效果更好(P<0.05);Logistic回归分析结果发现,NT-proBNP、LVEF、LVEDD、miR-200a-3p和miR-30a-5p是HF患者预后的影响因素(Waldχ^(2)=4.321~128.193,P<0.05);Kaplan-Meier生存分析结果显示,血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p高表达患者3年生存率低于miR-200a-3p和miR-30a-5p低表达患者(均P<0.05)。结论HF患者血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平显著升高,二者与HF的发生及患者预后相关。

miR-34a-5p/PLCD3轴调控骨关节炎进展的机制

背景:目前已有针对miRNA/mRNA轴调节骨关节炎疾病进程的分子机制研究。先前生物信息学研究发现具有临床预测价值的mRNA(磷脂酶Cδ3:phospholipase C delta 3,PLCD3)及其靶向miRNA(miR-34a-5p),尚缺实验验证其调控骨关节炎的具体作用及机制。目的:探讨miR-34a-5p/PLCD3轴对骨关节炎进展的调控作用及机制。方法:选择15例膝骨关节炎患者的滑膜为骨关节炎组,同时选择同期因创伤致髌骨骨折行内固定术的15例年轻患者的健康滑膜为对照组,Real-time PCR法检测滑膜中PLCD3及miR-34a-5p的表达。通过细胞转染的方法,将人滑膜关节炎成纤维细胞(human fibroblast like synovial cells-osteoarthritis,HFLS-OA)进行处理,并分为miR-34a-5p模拟物组、pCDH-PLCD3组、miR-34a-5p模拟物+pCDH-PLCD3组、miR-34a-5p抑制剂组、si-PLCD3组、miR-34a-5p抑制剂+si-PLCD3组,通过Real-time PCR法检测PLCD3和miR-34a-5p表达的关系;通过CCK-8法、细胞划痕实验检测各组HFLS-OA细胞活力及细胞迁移的影响;使用Western Blot法检测凋亡标记蛋白表达水平;使用ELISA法检测炎症因子的表达。结果与结论:①PLCD3是miR-34a-5p的直接靶标,同时PLCD3和miR-34a-5p表达水平呈负相关。②PLCD3上调会促进HFLS-OA细胞的增殖并抑制细胞迁移,而miR-34a-5p上调会显著抑制HFLS-OA细胞的活性并增强细胞迁移;miR-34a-5p过表达使HFLS-OA细胞Casp3和Casp9蛋白水平显著升高,而PLCD3过表达则表现出相反趋势。③PLCD3过表达显著增加了HFLS-OA细胞白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达,而miR-34a-5p模拟物则表现出保护活性。④结果说明,miR-34a-5p/PLCD3轴可能通过调节滑膜细胞的炎症过程或凋亡来影响骨关节炎的进展。