尿石素A通过活化miR-136介导的Sirt1信号通路减轻呼吸道合胞病毒诱导的新生小鼠肺部感染

目的探讨尿石素A(UA)治疗呼吸道合胞病毒(RSV)引起的新生小鼠肺部感染的疗效及作用机制。方法将Babl/c小鼠(5~7 d)随机分为5组(n=10):正常对照(Control)组、RSV感染(RSV)组、低剂量UA(UA-L)组、中剂量UA(UA-M)组、高剂量UA(UA-H)组。BEAS-2B细胞同样分为Control组、RSV组、UA-L组、UA-M组和UA-H组。除正常对照组外,其余4组小鼠或细胞均给予RSV感染。RSV感染2 h后,UA-L组、UA-M组和UA-H组小鼠分别腹腔注射2.5、5和10 mg/kg的UA,1次/d,连续注射2周;UA-L组、UA-M组和UA-H组细胞分别用2.5、5和10μmol/L的UA处理48 h。HE染色评价肺组织病理学改变。收集支气管肺泡灌洗液用于炎症细胞计数和炎症因子检测。炎症、细胞活力、凋亡和自噬分别采用酶联免疫吸附实验、CCK-8实验、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记实验、流式细胞术、Western blotting和免疫荧光染色检测。qRT-PCR检测miR-136和Sirt1 mRNA的表达,双荧光素酶报告基因系统验证miR-136和Sirt1的相互关系。结果与Control组相比,RSV感染组小鼠肺组织病理评分、病毒荷载量、TUNEL阳性细胞数、LC3-II/I、Beclin-1和miR-136表达及BALF中总细胞数、炎症细胞数和炎症因子含量显著升高(P<0.0001),而p62和Sirt1表达显著减少(P<0.0001);与RSV组相比,UA处理则呈剂量依赖性逆转上述检测指标值(P<0.05)。与Control组相比,RSV组BEAS-2B凋亡细胞数、LC3B阳性细胞数及miR-136表达明显增多,Sirt1表达减少(P<0.01);与RSV组相比,UA处理剂量依赖性地减弱上述指标的改变(P<0.01)。与miR-NC组相比,miR-136组Sirt1-WT的荧光素酶活性显著降低,Sirt1表达减少(P<0.001),Sirt1-MUT的荧光素酶活性不变(P>0.05)。与RSV+UA组相比,RSV+UA+miR-136组和RSV+UA+Ex527组炎症因子含量和凋亡细胞数明显增加(P<0.05),LC3B表达显著减少(P<0.0001);miR-136与Ex527共处理进一步改变上述指标值(P<0.05)。结论UA通过活化miR-136介导的Sirt1信号通路减轻RSV诱导的新生小鼠肺部感染。

CircNRIP1调节miR-136-5p/RAC1轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡和化疗耐药性的影响

目的探讨CircNRIP1调节miR-136-5p/Ras相关C3肉毒素底物1(RAC1)轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡和化疗耐药性的影响。方法qRT-PCR法检测正常乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌MCF-7细胞和紫杉醇(PTX)耐药细胞株MCF-7/PTX中CircNRIP1、miR-136-5p、RAC1 mRNA表达。将MCF-7/PTX细胞分为CK组(正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、si-CircNRIP1组(转染si-CircNRIP1)、si-CircNRIP1+inhibitorNC组(转染si-CircNRIP1和inhibitorNC)、si-CircNRIP1+miR-136-5pinhibitor组(转染si-CircNRIP1和miR-136-5p inhibitor)。CCK-8法检测各组细胞增殖率;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;qRT-PCR法检测各组细胞CircNRIP1、miR-136-5p、RAC1 mRNA表达;Western blot检测各组细胞Ki-67、Bax、Bcl-2、RAC1蛋白表达量;双荧光素酶实验验证miR-136-5p与CircNRIP1、RAC1的靶向关系。结果与正常乳腺上皮细胞MCF10A相比,MCF-7和MCF-7/PTX细胞中CircNRIP1、RAC1的表达升高(P<0.05),而miR-136-5p的表达降低(P<0.05);与MCF-7细胞相比,MCF-7/PTX细胞中CircNRIP1、RAC1的表达升高(P<0.05),miR-136-5p的表达降低(P<0.05)。与CK组和si-NC组相比,si-CircNRIP1组MCF-7/PTX细胞增殖率,CircNRIP1和RAC1 mRNA表达,Bcl-2、Ki-67、RAC1蛋白表达降低(P<0.05),细胞凋亡率、miR-136-5p和Bax表达升高(P<0.05)。敲低miR-136-5p表达可减弱沉默CircNRIP1对MCF-7/PTX细胞的抑制作用(P<0.05)。双荧光素酶实验证实miR-136-5p与CircNRIP1和RAC1存在靶向关系。结论沉默CircNRIP1表达可抑制MCF-7/PTX细胞恶性生物学行为,降低其PTX耐药性,可能与调控miR-136-5p/RAC1轴有关。

circ-ERBB2通过抑制miR-136-5p维持乳腺癌中的HER2下游信号促进曲妥珠单抗耐药

目的:探讨circ-ERBB2/miR-136-5p轴是否参与曲妥珠单抗耐药乳腺癌的耐药性分子机制。方法:qPCR法检测曲妥珠单抗敏感和耐药乳腺癌组织,以及HER2^(-)和HER2^(+)乳腺癌组织中circ-ERBB2和miR-136-5p的表达水平。建立小鼠异种移植瘤模型,评估敲低/过表达circ-ERBB2联合过表达/敲低miR-136-5p对乳腺癌细胞成瘤性及对曲妥珠单抗耐药性的影响。生物信息学和双荧光素酶报告基因分析circ-ERBB2与miR-136-5p的序列互作位点。CCK-8细胞增殖能力测定敲低/过表达circ-ERBB2联合过表达/敲低miR-136-5p以及给予曲妥珠单抗治疗对于乳腺癌常规或曲妥珠单抗耐药BT-474(Trast-resist)细胞增殖能力的影响。Western blot法检测敲低/过表达circ-ERBB2联合过表达/敲低miR-136-5p后,对常规或BT-474(Trast-resist)细胞内HER2、p-Akt、p-ERK1/2表达水平的影响。结果:与曲妥珠单抗敏感乳腺癌组织相比,曲妥珠单抗耐药乳腺癌组织中circ-ERBB2的表达水平显著升高,miR-136-5p表达水平显著降低(P<0.01)。无论激素受体表达为阳性或是阴性,与HER2^(-)乳腺癌组织相比,在HER2^(+)乳腺癌组织中circ-ERBB2表达显著上调,miR-136-5p表达水平被显著抑制(P<0.01)。敲低circ-ERBB2的表达或过表达miR-136-5p均能够抑制BT-474(Trast-resist)细胞增殖及其胞内HER2、p-Akt和p-ERK1/2的表达水平(P<0.01)。结论:circ-ERBB2能够通过抑制miR-136-5p参与维持乳腺癌中的HER2下游信号并促进曲妥珠单抗耐药。

CircTRAF3调节miR-136-5p/NMT1轴对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨CircTRAF3调节miR-136-5p/NMT1轴对鼻咽癌(NPC)细胞恶性生物学行为的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测人NPC细胞系5-8F、HONE-1、CNE-2、HNE-1以及鼻咽上皮细胞系NP69中CircTRAF3、miR-136-5p表达及NMT1蛋白表达;将HONE-1分为NC组、si-NC组、si-CircTRAF3组、si-CircTRAF3+inhibitor NC组、si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor组。双荧光素酶报告基因实验检测CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1关系;qRT-PCR检测各组HONE-1细胞中CircTRAF3、miR-136-5p表达;Western blot检测各组HONE-1细胞中NMT1蛋白表达;MTT法检测HONE-1细胞增殖;流式细胞术检测HONE-1细胞凋亡;Transwell检测HONE-1细胞侵袭、迁移能力;荷瘤小鼠模型验证CircTRAF3对HONE-1移植瘤的影响。结果CircTRAF3靶向调控miR-136-5p/NMT1轴;在HONE-1、CNE-2、HNE-1、5-8F中CircTRAF3、NMT1高表达,miR-136-5p低表达,且HONE-1差异最显著,因此,以HONE-1为研究对象。与NC组、si-NC组相比,si-CircTRAF3组CircTRAF3、NMT1水平、OD490值、迁移、侵袭细胞数量显著下调(P<0.05),miR-136-5p表达量、HONE-1细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与si-CircTRAF3组、si-CircTRAF3+inhibitor NC组相比较,si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor组NMT1水平、OD490值、迁移、侵袭细胞数量显著上升(P<0.05),miR-136-5p表达量、HONE-1细胞凋亡率显著下降(P<0.05);NC组、si-NC组小鼠肿瘤细胞排列密集,边界清晰;与NC组、si-NC组相比,si-TRAF3组肿瘤重量降低(P<0.05),肿瘤细胞排列疏松,胞核固缩,细胞碎片增多;与si-TRAF3组、si-TRAF3+anti-NC组相比,si-TRAF3+anti-miR-136-5p组肿瘤重量增加(P<0.05)。结论沉默CircTRAF3可能通过上调miR-136-5p来抑制NMT1表达,进而抑制HONE-1细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡。

miR-136通过抑制PPP2R2A表达调控胃癌细胞SGC7901凋亡

目的:检测miR-136对胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响及其机制。方法:分别利用MTT实验和Annex in V-PI实验检测转染miR-136 inhibitor的胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡。利用western blot和双荧光素酶报告基因技术检测miR-136的靶基因。结果:抑制miR-136表达可以明显抑制SGC7901细胞增殖和诱导其凋亡。miR-136能够与PPP2R2A mRNA 3'-UTR区结合。结论:抑制miR-136表达能够促进PPP2R2A蛋白表达,进而引起胃癌细胞凋亡。

阿魏酸钠通过miR-136-5p对ox-LDL诱导内皮细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨阿魏酸钠对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 将人脐静脉内皮细胞株EA.HY926分为对照组、ox-LDL组、不同浓度阿魏酸钠组、miR-NC+ox-LDL组、miR-136-5p+ox-LDL组、anti-miR-NC+ox-LDL组、anti-miR-136-5p+ox-LDL组、阿魏酸钠+miR-NC+ox-LDL组、阿魏酸钠+miR-136-5p+ox-LDL组。CCK-8检测细胞活性,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western blot法检测细胞Ki67、MMP2、MMP9、p-p65、p-IкBα蛋白表达,RT-qPCR法检测miR-136-5p表达。结果 ox-LDL可诱导内皮细胞的增殖、迁移和侵袭。阿魏酸钠处理后,ox-LDL诱导的内皮细胞中Ki67蛋白表达升高,细胞活性升高,MMP2、MMP9蛋白表达升高,迁移和侵袭细胞数升高,miR-136-5p表达降低(P<0.05)。抑制miR-136-5p表达可促进ox-LDL诱导的内皮细胞增殖、迁移和侵袭。过表达miR-136-5p逆转了阿魏酸钠对ox-LDL诱导的内皮细胞增殖、迁移和侵袭的作用。阿魏酸钠可降低内皮细胞p-p65、p-IкBα蛋白表达(P<0.05),而过表达miR-136-5p逆转了阿魏酸钠对p-p65、p-IкBα蛋白表达的抑制作用。结论 阿魏酸钠可能通过下调miR-136-5p表达抑制NF-κB信号通路,进而抑制内皮细胞的增殖、迁移和侵袭。

MiR-136通过下调靶基因ITGAV表达抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移的分子机制

目的:分析miR-136对骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞生物学行为的调控机制研究,揭示miR-136在OS中的作用及其机制。方法:检测OS组织和癌旁正常组织中miR-136和整合素αV亚基(integrin subunit alpha V,ITGAV)的表达;采用TargetScan和双荧光素酶报告基因实验、反转录PCR和蛋白质印迹法证实ITGAV是否为miR-136的靶基因;采用CCK-8法、流式细胞法和细胞划痕试验检测miR-136和ITGAV对MG63细胞增殖、周期和迁移的影响。构建OS小鼠模型验证miR-136以及ITGAV对体内肿瘤生长的影响。结果:在OS癌组织中,miR-136明显降低,而ITGAV的表达则明显升高。miR-136能特异性结合ITGAV的3'-UTR并负调控ITGAV。细胞实验结果显示:ITGAV组可以提高OS细胞MG63和U2OS增殖、S期细胞比例以及迁移能力,而miR-136组可抑制OS细胞MG63和U2OS增殖、S期细胞比例以及迁移能力,而miR-136+ITGAV组可以逆转miR-136组对MG63和U2OS细胞增殖、S期细胞比例以及迁移能力的抑制效果。OS小鼠模型显示:miR-136在裸鼠体内具有抑制OS生长的作用,ITGAV在miR-136 mimic组中的表达较对照组明显降低,而在miR-136 inhibitor组中出现相反的效果。结论:MiR-136的异常表达可能与OS有关,miR-136通过靶向调控ITGAV的表达,从而抑制OS细胞的生物学行为以及体内肿瘤生长,提示miR-136可能具有抑制OS的作用。

lncRNA GAS5靶向调控miR-136对高糖诱导的人肾小管上皮细胞中炎性和纤维化因子表达影响及机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)生长抑制特异性转录本5(GAS5)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)中炎性和纤维化因子表达影响,并探讨其机制是否与调控miR-136表达有关。方法将体外培养的HK-2细胞分为正常对照(NC)组、高糖(HG)组、HG+Si-NC组、HG+Si-GAS5组、HG+miR-NC组、HG+miR-136组、HG+Si-GAS5+anti-miR-NC组、HG+Si-GAS5+anti-miR-136组。采用实时定量PCR分析GAS5和miR-136表达量。蛋白质印迹法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白1(FN1)蛋白表达水平。酶联免疫吸附测定法分析白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白表达水平。结果与NC组比较,HG组HK-2细胞GAS5以及α-SMA、FN1、TNF-α和IL-6蛋白表达显著升高(P<0.05),miR-136表达显著降低(P<0.05)。与HG+Si-NC组比较,HG+Si-GAS5组HK-2细胞α-SMA、FN1、TNF-α和IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05)。与HG+miR-NC组比较,HG+miR-136组HK-2细胞α-SMA、FN1、TNF-α和IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05)。与HG+Si-GAS5+anti-miR-NC组比较,HG+Si-GAS5+anti-miR-136组HK-2细胞α-SMA、FN1、TNF-α和IL-6蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论干扰GAS5通过上调miR-136表达可抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎性和纤维化因子表达。

circ0091581靶向miR-136对皮肤鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的 circ_0091581是否通过miR-136参与皮肤鳞状细胞癌(CSCC)的发生过程尚不清楚。文章旨在探讨circ_0091581对CSCC细胞生物学行为的影响及其可能作用机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测CSCC组织与癌旁组织中circ_0091581、miR-136的表达量;体外培养人CSCC细胞SCL-1,实验分组:si-NC组、si-circ_0091581组、miR-NC组、miR-136组、si-circ_0091581+anti-miR-NC组、si-circ_0091581+anti-miR-136组;甲基噻唑基四唑(MTT)法、平板克隆形成实验、Transwell实验与流式细胞术分别检测细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡;双荧光素酶报告实验检测circ_0091581与miR-136的靶向关系。结果 circ_0091581在CSCC组织中的表达量(2.45±0.37)较癌旁组织(0.93±0.16)增多(P<0.05),miR-136在CSCC组织中表达量(0.43±0.06)较癌旁组织(0.99±0.11)降低(P<0.05)。与转染si-NC比较,转染si-circ_0091581后细胞克隆形成、迁移能力减低(P<0.01),细胞增殖抑制、凋亡能力增强(P<0.01);与转染miR-NC比较,转染miR-136 mimics后细胞克隆形成、迁移能力减低(P<0.01),细胞增殖抑制、凋亡能力增强(P<0.01);circ_0091581可靶向调控miR-136的表达;共转染si-circ_0091581、anti-miR-136可减弱转染si-circ_0091581对细胞生物学行为的作用。结论 干扰circ_0091581表达可通过靶向调控miR-136表达而减弱CSCC细胞增殖、克隆形成及迁移能力,并可诱导细胞凋亡。

miR-182、miR-136-5p表达与局部晚期口腔鳞癌患者TPF诱导化疗疗效的相关性分析

目的分析miR-182、miR-136-5p表达与局部晚期口腔鳞癌患者TPF诱导化疗疗效的相关性分析。方法选择局部晚期口腔鳞癌患者76例,将其纳入病例组。另于同期选择体检健康的受试者76例,将其纳入对照组。问卷调查患者的年龄、性别、分期、肿瘤部位、临床分级、病理分化程度、吸烟史和饮酒史。检查miR-182、miR-136-5p表达情况,统计TPF诱导化疗1年生存时间。分析比较局部晚期口腔鳞癌患者miR-182、miR-136-5p表达情况,并探讨其与病理特征和预后的关系。结果病例组患者miR-182阳性表达率低于对照组(P<0.05),miR-136-5p阳性表达率高于对照组(P<0.05)。miR-182、miR-136-5p阳性表达情况与年龄、肿瘤部位、分期、分级、吸烟和饮酒有关P<0.05)。miR-182阳性表达患者生存时间为10.25个月,阴性表达患者生存时间为5.68个月。miR-136-5p阳性表达患者生存时间为6.57个月,阴性生存时间为9.97个月。miR-182阳性表达与预后呈正相关(P<0.05),miR-136-5p阳性表达与预后呈负相关(P<0.05)。结论miR-182、miR-136-5p表达与局部晚期口腔鳞癌患者TPF诱导化疗预后和临床特征关系密切,其中miR-182阳性表达有利于患者预后,而miR-136-5p阳性表达不利于预后。

miR-127和miR-136在转基因克隆绵羊胎盘中的表达分析及其靶基因的鉴定

克隆动物胎盘发育缺陷是造成动物克隆效率低下的一个重要原因。目前认为克隆胎盘发育异常通常是由于一些基因表达的异常所致,与表观遗传修饰有关。microRNA是一种重要的表观遗传修饰方式,对动物胚胎发育和胎盘的形成有着重要的调控作用。为研究miR-127和miR-136在克隆动物胎盘中的表达情况及其与克隆动物发育缺陷的关系,本实验运用荧光定量PCR分析了死亡克隆绵羊胎盘和同期普通绵羊胎盘组织中miR-127和miR-136的相对表达量,并鉴定了miR-127和miR-136的靶基因及靶基因在胎盘中的表达情况。结果显示,miR-127和miR-136在克隆绵羊胎盘中的表达量分别增加了3.1和2.8倍。EGFP荧光敲除实验证实,胎盘发育相关基因Rtl1是miR-127和miR-136的靶基因,同时定量PCR分析发现Rtl1基因在克隆绵羊胎盘中的表达量降低了3/5。结果说明,miR-127和miR-136在克隆胎盘中的异常表达可导致Rtl1基因的低表达,这很可能是导致克隆动物死亡的一个重要原因。

长链非编码RNA CRNDE通过下调miR-136-5p表达并上调MCM5表达促进U937细胞增殖并抑制其凋亡

目的 探究长链非编码RNA结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)对U937细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其作用机制。方法 首先通过基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库分析CRNDE在急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中的表达水平;实时荧光定量PCR检测AML细胞系miR-136-5p、 CRNDE及微小染色体维持蛋白5(MCM5)的mRNA表达水平。构建敲低CRNDE的慢病毒载体并转染U937细胞,设为敲低CRNDE组(sh-CRNDE组)和阴性对照组(sh-NC组);分别转染miR-136-5p模拟物(miR-136-5p mimic)和miR-136-5p抑制物(miR-136-5p inhibitor)对U937细胞中的miR-136-5p进行过表达和敲低,设为miR-136-5p过表达组(miR-136-5p-mimic)、过表达阴性对照组(NC-mimic)、 miR-136-5p敲低组(miR-136-5p-inhibitor)和敲低阴性对照组(NC-inhibitor)。CCK-8法和细胞计数试验检测CRNDE和miR-136-5p对细胞增殖的影响,流式细胞术检测CRNDE和miR-136-5p对细胞周期和凋亡的影响。实时荧光定量PCR检测miR-136-5p、 CRNDE及MCM5的mRNA表达,Western blot法检测MCM5、 P53、 B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白A2(cyclin A2)的蛋白表达水平。结果 CRNDE在AML患者骨髓和细胞系中高表达。敲低CRNDE可以上调miR-136-5p,抑制MCM5 mRNA和蛋白表达,抑制细胞增殖,促进凋亡并使细胞周期阻滞在G1期。过表达miR-136-5p也可抑制MCM5核酸和蛋白水平表达。而敲低miR-136-5p则可以逆转以上作用。结论 CRNDE通过下调miR-136-5p和上调MCM5表达,进而促进U937细胞增殖并抑制其凋亡。

miR-136对胶质瘤U251细胞生物学功能的影响

目的:初步探讨miR-136对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:选取胶质瘤U251细胞系,分别转染miR-136 mimic(模拟物组)和miR-136模拟物阴性对照(对照组),采用qRT-PCR法检测转染效率,观察2组细胞miR-136表达差异;显微镜下观察转染24 h后细胞密度,并拍照记录;CCK-8法检测转染后细胞增殖活性;Transwell和划痕实验分别检测转染后细胞侵袭及迁移能力;检索miRnada生物信息学数据库,预测并分析miR-136下游靶基因;qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中FZD4 mRNA和FZD4蛋白的表达。结果:与对照组相比,模拟物组细胞miR-136表达水平明显升高(P<0.05);转染24 h之后,模拟物组细胞密度低于对照组;CCK-8检测显示模拟物组细胞增殖活性较对照组明显降低(P<0.05);Transwell和划痕实验显示模拟物组细胞侵袭和迁移能力较对照组降低;miRnada数据库分析显示FZD4是miR-136的下游靶基因;与对照组相比,模拟物组FZD4 mRNA和FZD4蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05)。结论:miR-136可能通过靶向调控FZD4基因的表达抑制胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和转移。

miR-136-5p调控白细胞介素17刺激星形胶质细胞后A20蛋白的表达

背景:研究表明,miR NA在脊髓的发育、脊髓可塑性和脊髓损伤后的病理改变中均发挥着至关重要的调节作用。目的:分析miR-136-5p调控白细胞介素17刺激小鼠星形胶质细胞对A20蛋白表达的影响。方法:体外培养C57BL/6小鼠星形胶质细胞并进行免疫荧光染色鉴定。用白细胞介素17(100μg/L)分别刺激小鼠星形胶质细胞0,3,6,12,24 h,行RT-PCR检测白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA的相对表达量,以确定白细胞介素17最佳刺激时间,用不同质量浓度的白细胞介素17(10,20,50,100,200μg/L)刺激6 h,行RT-PCR检测白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA的表达量以确定白细胞介素17最佳刺激浓度。采用白细胞介素17(50μg/L)刺激小鼠星形胶质细胞6 h后,行RT-PCR检测星形胶质细胞产生的miR-136-5p及A20 mRNA的表达含量,并用Western blot检测A20蛋白的表达水平。此外,构建miR-136-5p表达抑制(miR-136-5p-inhibition)的慢病毒表达载体,转染小鼠星形胶质细胞,再次行白细胞介素17刺激并检测miR-136-5p、A20 mRNA及A20蛋白表达水平。结果与结论:(1)白细胞介素17刺激小鼠星形胶质细胞6 h后,miR-136-5p-inhibition抑制组与空白组相比,miR-136-5p表达显著降低(P<0.05);(2)经白细胞介素17(50μg/L)刺激6 h后,各组内A20 mRNA及A20蛋白的表达较刺激前明显降低(P<0.05);miR-136-5p-inhibition抑制组的A20 mRNA及A20蛋白表达与空白组相比显著升高(P<0.05),空白对照组与转染阴性对照组比较蛋白相对表达量没有显著性差异(P>0.05);(3)结果提示,miR-136-5p对白细胞介素17刺激的星形胶质细胞表达A20蛋白可产生影响。

过表达miR-136调控E2F1对宫颈癌细胞增殖凋亡的作用及其机制

目的探讨过表达miR-136对宫颈癌细胞增殖凋亡的作用及其机制。方法利用RT-qPCR检测miR-136和E2F1在宫颈癌He La细胞中的表达,以脂质体转染miR-136 mimics至He La细胞,噻唑蓝(MTT)法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western印迹检测细胞中B细胞淋巴病/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和E2F1蛋白表达。结果与正常上皮293T细胞相比,miR-136在宫颈癌He La细胞中表达显著降低,E2F1表达显著升高(P<0. 01);转染miR-136 mimics 48 h后,与对照组相比,miR-136 control组中miR-136的相对表达量、细胞增殖率、细胞凋亡率、Bcl-2、Bax和E2F1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0. 05);而miR-136 mimics组中miR-136的相对表达量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达量显著升高,细胞增殖率、Bcl-2、和E2F1蛋白表达量显著降低(P<0. 01)。转染siRNA-E2F1 48 h后,细胞的增殖凋亡趋势与上调miR-136表达结果一致。结论 miR-136在宫颈癌细胞中呈现低表达,上调其表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与E2F1有关。

miR-136-5p靶向MIEN1对宫颈癌细胞侵袭和迁移的调节及机制研究

目的探究miR-136-5p通过靶向作用迁移侵袭增强因子(MIEN1),对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的影响及其机制。方法收集宫颈癌石蜡包埋组织块及癌旁组织20例,RT-PCR检测MIEN1和miR-136-5p基因表达水平并分析MIEN1和miR-136-5p基因表达的相关性。荧光素酶报告基因实验检测miR-136-5p和MIEN1的相互作用。宫颈癌细胞SiHa分为SiHa、miR-136-5p mimic、pC-MIEN1和pC-MIEN1+miR-136-5p组,转染相应的miRNA或载体,划痕法检测细胞迁移,Transwell法检测细胞侵袭,Western blotting检测MIEN1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、Twist、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白表达水平。结果与正常组织比较,宫颈癌组织中MIEN1基因表达明显升高(2.27±0.67,P<0.01),miR-136-5p表达明显降低(0.35±0.13,P<0.01),且MIEN1和miR-136-5p表达水平呈负相关(r=-0.771,P<0.01)。在荧光素酶报告实验中,与MIEN1 WT+mimic NC组比较,MIEN1 WT+miR-136-5p mimic组荧光素酶活性明显降低(0.34±0.05,P<0.01)。在细胞实验中,与SiHa组比较,miR-136-5p mimic组MIEN1(0.22±0.03)、N-cadherin(0.13±0.03)、Twist(0.19±0.03)、MMP-9(0.14±0.03)、NF-κB p65(0.28±0.04)蛋白表达水平及p-AKT/AKT比率(0.15±0.03)明显降低,E-cadherin(0.82±0.09)蛋白表达明显升高(P<0.01),并且细胞迁移[(23.0±5.1)%]和侵袭能力(42±5)明显降低(P<0.01);pC-MIEN1组MIEN1(1.06±0.09)、N-cadherin(0.59±0.07)、Twist(0.76±0.08)、MMP-9(0.72±0.08)、NF-κB p65(1.48±0.13)蛋白表达水平及p-AKT/AKT比率(0.56±0.06)明显升高,E-cadherin(0.17±0.03)蛋白表达明显降低(P<0.01),并且,细胞迁移[(81.5±9.0)%]和侵袭能力(228±19)明显升高(P<0.01);与pC-MIEN1组比较,pC-MIEN1+miR-136-5p组MIEN1(0.53±0.06)、N-cadherin(0.31±0.04)、Twist(0.36±0.05)、MMP-9(0.40±0.06)、NF-κB p65(0.89±0.11)蛋白表达水平及p-AKT/AKT比率(0.33±0.06)明显降低(P<0.01),E-cadherin(0.67±0.09)蛋白表达明显升高(P<0.01),并且细胞迁移[(52.0±7.5)%]和侵袭能力(97±11)明显降低(P<0.01)。结论miR-136-5p可通过靶向作用于MIEN1抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移,其机制可能与抑制AKT/NF-κB信号通路有关。

基于CRISPR/Cas9技术构建猪miR-136基因编辑载体

为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。

IRX5促进肝癌细胞的侵袭迁移及其与miR-136-5p靶向关系的验证

目的探讨易洛魁族同源盒基因5(IRX5)对肝癌细胞侵袭与迁移的影响,并验证其与miR-136-5p的靶向关系。方法取对数生长期肝癌SMMC7721细胞,过表达IRX5实验设空载质粒(pcDNA3.1)组和过表达IRX5(pcDNA3.1-IRX5)组,敲低IRX5实验设阴性对照(sh-NC)组和敲低IRX5(sh-IRX5)组。采用Western blot验证IRX5过表达和敲低效率;采用划痕实验和Transwell实验检测IRX5对肝癌细胞迁移与侵袭的影响;采用miRanda、Targetscan生物信息学软件预测IRX5结合的miRNA和位点;构建野生型和突变型IRX53′UTR双荧光素酶报告基因质粒,采用酶切、基因测序方法鉴定重组质粒是否构建成功。取对数生长期293T细胞,设野生型质粒+阴性对照(IRX5-3′UTR-Wt+NC)组和野生型质粒+miR-136-5p(IRX5-3′UTR-Wt+miR-136-5p)组,突变型质粒+阴性对照(IRX5-3′UTR-Mut+NC)组和突变型质粒+miR-136-5p(IRX5-3′UTR-Mut+miR-136-5p)组,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果过表达IRX5组IRX5蛋白表达水平、细胞迁移及侵袭数量均高于空载质粒组,敲低IRX5组IRX5蛋白表达水平、细胞迁移及侵袭数量均低于阴性对照组(均P<0.05)。成功构建IRX5基因3′UTR野生型和突变型双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶实验结果显示,IRX5-3′UTR-Wt+miR-136-5p组双荧光素酶活性低于IRX5-3′UTR-Wt+NC组(P<0.01),IRX5-3′UTR-Mut+miR-136-5p组与IRX5-3′UTR-Mut+NC组差异无统计学意义。结论IRX5可促进肝癌细胞的侵袭与迁移,IRX5是miR-136-5p的一个靶基因,miR-136-5p可能通过IRX5的3′UTR抑制肝癌细胞的侵袭与迁移。

芦笋皂苷调控circ_0001361/miR-136对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

目的考察芦笋皂苷是否通过调控circ_0001361/miR-136影响结肠癌细胞的增殖、凋亡。方法将结肠癌SW1116细胞分为对照组、芦笋皂苷L、M、H组(芦笋皂苷浓度分别为45 mg/L、90 mg/L、180 mg/L)、si-NC组(转染si-NC)、si-circ_0001361组(转染si-circ_0001361)、芦笋皂苷H+pcDNA组(芦笋皂苷180 mg/L+转染pcDNA)、芦笋皂苷H+pcDNA-circ_0001361组(芦笋皂苷180 mg/L+转染pcDNA-circ_0001361)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组SW1116细胞的抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞克隆形成,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,qRT-PCR检测circ_0001361和miR-136表达。利用荧光素酶报告基因检测分析circ_0001361和miR-136的靶向关系。结果与对照组比较,芦笋皂苷L组、芦笋皂苷M组、芦笋皂苷H组SW1116细胞的抑制率、凋亡率、Bax蛋白、miR-136表达量逐渐增加,克隆数、Bcl-2蛋白、circ_0001361表达量逐渐减少(P<0.05),且芦笋皂苷L组、芦笋皂苷M组、芦笋皂苷H组3组间比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。抑制circ_0001361后,si-circ_0001361组SW1116细胞抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达量较si-NC组增加,克隆数、Bcl-2蛋白表达量较si-NC组降低(P<0.05)。circ_0001361靶向调控miR-136的表达。芦笋皂苷H+pcDNA-circ_0001361组SW1116细胞抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达量低于芦笋皂苷H+pcDNA组,克隆数、Bcl-2蛋白表达量高于芦笋皂苷H+pcDNA组(P<0.05)。结论芦笋皂苷通过下调circ_0001361靶向miR-136,抑制结肠癌SW1116细胞的增殖和诱导凋亡。

miR-136-5p靶向P4HB抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

目的观察miR-136-5p对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并探究其机制。方法运用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测肾癌组织和肾癌细胞中miR-136-5p、脯氨酰4-羟化酶、β-多肽(Prolyl 4-hydroxylase,β-polypeptide,P4HB)的表达。脂质体法将miR-NC、miR-136-5p mimics、pcDNA、pcDNA-P4HB、miR-136-5p mimics+pcDNA、miR-136-5p mimics+pcDNA-P4HB转染至ACHN细胞。细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK8)法、侵袭实验(Transwel)小室实验检测肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭情况。荧光素酶报告基因实验检测细胞的荧光活性。结果与正常组织和正常细胞比较,癌组织和癌细胞中miR-136-5p的表达显著降低,P4HB的表达显著升高。过表达miR-136-5p的肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低,而过表达P4HB的肾癌细胞则具有相反的结果。miR-136-5p明显抑制野生型P4HB细胞的荧光活性。此外,过表达P4HB联合过表达miR-136-5p明显逆转过表达miR-136-5p对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论miR-136-5p可抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制与靶向P4HB相关,可为肾癌的早期诊断、治疗提供新方向。