LncRNAHOTAIR靶向miR-17-5p/TXNIP对狼疮性肾炎进展的机制研究

目的探讨长链非编码RNA同源盒基因转录反义RNA(LncRNAHOTAIR)靶向miR-17-5p/硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)对狼疮性肾炎(LN)进展的机制。方法取60只MRL/lpr雌性小鼠,随机分为模型组、LncRNAHOTAIR敲低组、miR-17-5p agomir组、阴性对照组和LncRNAHOTAIR敲低+miR-17-5p antagomir组,每组12只,另取12只C57BL/6J雌性小鼠作为对照组,检测各组小鼠肾功能、免疫器官指数;以HE染色实验检测各组小鼠肾组织病理形态;以酶联免疫吸附测定(ELASA)法测定各组小鼠血清抗双链DNA(dsDNA)、免疫细胞因子免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;以实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)和免疫印迹法检测各组小鼠肾组织LncRNAHOTAIR、miR-17-5p及TXNIP表达。以双荧光素酶报告基因实验检测小鼠肾小球系膜细胞中LncRNAHOTAIR对miR-17-5p、miR-17-5p对TXNIP的靶向调节。结果与对照组比较,模型组小鼠肾组织发生严重病理损伤,胸腺指数、脾脏指数、miR-17-5p表达降低(P<0.05),尿蛋白浓度、血尿素氮(BUN)、血清抗dsDNA及IgG、IL-6、MCP-1、TNF-α、肾组织LncRNAHOTAIR及TXNIP表达升高(P<0.05)。与模型组比较,Ln⁃cRNAHOTAIR敲低组、miR-17-5p agomir组小鼠肾组织病理损伤减轻,胸腺指数、脾脏指数、miR-17-5p表达升高(P<0.05),尿蛋白浓度、BUN、血清抗dsDNA及IgG、IL-6、MCP-1、TNF-α、肾组织LncRNAHOTAIR及TXNIP表达降低(P<0.05)。下调miR-17-5p可减弱敲低LncRNAHOTAIR组对模型组小鼠各指标的作用。结论敲低LncRNAHOTAIR可通过上调miR-17-5p而降低TXNIP表达,进而减少LN小鼠免疫炎性因子产生,增强其免疫功能,抑制体内炎症发生发展,最终减轻小鼠肾组织损伤并改善其肾功能。

lncRNA KCNQ1OT1通过miR-499a-5p/TXNIP调控缺氧心肌细胞活性和凋亡的机制

目的探讨长链非编RNA(lncRNA)、KCNQ1重叠转录物(KCNQ1OT)1对缺氧心肌细胞活性和凋亡的影响及分子机制。方法将心肌细胞随机分为对照(NC)组、缺氧预处理(HPC)组、si-NC+HPC组、si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组、miR-NC+HPC组、miR-499a-5p+HPC组、si-硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)+HPC组、pcDNA-NC+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组、pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC组;用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p和TXNIP mRNA的表达水平;Western印迹法检测蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别检测MDA含量和细胞SOD活性;双荧光素酶报告实验检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p、TXNIP之间的靶向关系。结果心肌梗死患者血清及缺氧诱导的心肌细胞中lncRNA KCNQ1OT1表达水平显著升高(P<0.05)。下调lncRNA KCNQ1OT1、下调TXNIP或上调miR-499a-5p后,心肌细胞H9C2中CyclinD1表达、细胞活性、SOD活性显著升高,Cleaved-caspase-3表达、细胞凋亡率、MDA含量显著降低(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1通过靶向miR-499a-5p调控TXNIP表达。过表达TXNIP可以逆转lncRNA KCNQ1OT1下调对缺氧诱导的心肌细胞H9C2的影响。结论下调lncRNA KCNQ1OT1可能通过miR-499a-5p/TXNIP轴抑制缺氧诱导心肌细胞凋亡和氧化应激,促进细胞存活。

环状RNA-SCAF8通过miR-93-5p/TXNIP通路促进血管内皮细胞焦亡

目的:探究环状RNA(circRNA)-SR相关CTD相关因子8(SCAF8)在高糖环境下对血管内皮细胞焦亡发挥的作用及机制。方法:将来源于人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、高糖对照组分别置于5、33 mmol/L葡萄糖浓度的细胞培养基培养,RNA对照组、circRNA-SCAF8抑制组、微RNA(miR)-93-5p过表达组和miR-93-5p抑制组分别在高糖环境下加入无功能siRNA、circRNA-SCAF8抑制分子、miR-93-5p过表达分子和miR-93-5p抑制剂。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、流式细胞术和Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色法检测细胞存活率和焦亡率,采用蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法检测凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、Gasdermin D蛋白(GSDMD)、NOD样受体家族蛋白3(NLRP-3)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子表达,采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circRNA-SCAF8、miR-93-5p和TXNIP的基因表达,采用荧光原位杂交法定位circRNA-SCAF8和miR-93-5p,采用双荧光素酶实验验证miR-93-5p与上下游分子的靶向调控关系。结果:与RNA对照组比较,circRNASCAF8抑制组和miR-93-5p过表达组细胞存活率升高(均P<0.01),细胞焦亡率降低(均P<0.01),TXNIP、NLRP-3、caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子的表达量显著减少(均P<0.05);抑制circRNA-SCAF8后miR-93-5p的表达量显著增加(P<0.01),过表达miR-93-5p后circRNA-SCAF8的表达有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。miR-93-5p通过与circRNA-SCAF8的3'UTR区结合下调circRNA-SCAF8表达,miR-93-5p通过与TXNIP的3'UTR区结合下调TXNIP表达。circRNA-SCAF8和miR-93-5p均位于细胞质中,在细胞中高度关联。qRT-PCR结果显示,过表达或抑制miR-93-5p后,TXNIP的相对表达量较RNA对照组分别增加或减少(均P<0.05),证明miR-93-5p可调控TXNIP基因表达。结论:circRNASCAF8/miR-93-5p/TXNIP通路可能参与调控高糖环境下血管内皮细胞焦亡。

MiR-16-5p靶向TXNIP调控脂多糖诱导的心肌细胞的氧化应激和凋亡

心肌细胞损伤与多种心血管疾病的发生发展有关,而氧化应激和细胞凋亡是造成心肌损伤的重要原因。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)可调控细胞氧化还原状态,并诱导氧化应激的产生,最终可诱导炎症或细胞凋亡。miR-16-5p能抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症反应和A549细胞损伤。但TXNIP是否受miR-16-5p的调控还鲜有报道。本实验旨在研究miR-16-5p与TXNIP的关系,以及miR-16-5p是否通过结合TXNIP影响心肌细胞氧化应激和凋亡。通过TargetScan数据库预测到TXNIP与miR-16-5p存在结合位点。双荧光素酶报告结果验证miR-16-5p靶向调控TXNIP。转染miR-16-5p过表达载体和TXNIP抑制表达载体后,用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,细胞凋亡率(10.44±1.13 vs 29.65±2.87,P<0.01)、(13.54±1.33 vs 29.14±2.76,P<0.01)均降低。采用丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒分别检测丙二醛含量和SOD、GSH-Px活力。结果显示,miR-16-5p组丙二醛含量降低(13.58±1.55 vs 42.18±4.69,P<0.01),SOD活力(79.68±7.65 vs 34.87±3.49,P<0.01)、GSH-Px活力(687.99±35.42 vs 376.48±29.87,P<0.01)升高;si-TXNIP组丙二醛含量(18.69±1.84 vs 45.21±4.33,P<0.01)降低,SOD活力(71.65±7.32 vs 31.69±4.05,P<0.01)、GSH-Px活力(654.12±34.57 vs 367.43±33.54,P<0.01)升高。以上结果表明,过表达miR-16-5p或可抑制TXNIP表达,均可抑制脂多糖诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激反应。综上所述,miR-16-5p可通过抑制TXNIP表达抑制脂多糖诱导的心肌细胞损伤。

苦参碱通过miR-17-5p/MKNK2分子轴抑制膀胱癌干细胞增殖和侵袭

目的通过miR-17-5p/MKNK2分子轴研究苦参碱(atrine,MT)对膀胱癌干细胞增殖和侵袭的影响,并阐明其作用机制。方法采用流式细胞术分选膀胱癌干细胞(transitional cell carcinoma cells,TCCSUP),并用干细胞成球实验检测不同剂量MT处理的膀胱癌干细胞的成球能力,采用CCK-8和Transwell检测膀胱癌干细胞增殖和侵袭,采用RT-qPCR检测膀胱癌干细胞中miRNAs的表达水平,采用Western blot检测MKNK2的表达水平,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-5p和MKNK2的靶向关系。结果通过分选出的TCCSUP细胞在显微镜下观察发现,细胞生长状态良好,呈球形或椭圆形,细胞膜边界清晰;CCK-8、Transwell和干细胞成球实验检测结果显示,MT可呈浓度依赖性显著抑制膀胱癌干细胞增殖、侵袭以及成球能力,TCCSUP干细胞半数抑制浓度为2 mg·L^(-1)。miR-17-5p在膀胱癌干细胞内异常高表达,MT可显著下调miR-17-5p的表达水平;过表达miR-17-5p可明显促进膀胱癌干细胞的增殖、侵袭以及干细胞成球;同时过表达miR-17-5p和MKNK2可显著MKNK2下调过表达MKNK2对TCCSUP干细胞增殖、侵袭和干细胞成球的抑制作用。结论MT通过下调miR-17-5p,促进MKNK2的表达,抑制TCCSUP干细胞增殖、侵袭和成球能力。

LncRNA FGD5-AS1调节miR-195-5p/TXNIP轴对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞增殖和凋亡的影响

目的探究长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)中含有5个PH结构域的反义RNAl(PH domain containing 5 antisense RNA 1,FGD5-AS1)调节微小RNA-195-5p(microRNA-195-5,miR-195-5p)/硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interactingprotein,TXNIP)轴对氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation and reperfusion injury,OGD/R)小胶质细胞增殖和凋亡的影响。方法以正常小胶质细胞B-V2作为对照组,并建立OGD/R模型,分为OGD/R组(未转染质粒)、转染FGD5-AS1阴性对照(si-NC)组、转染si-FGD5-AS1(si-FGD5-AS1)组、共转染si-FGD5-AS1和miR-195-5p抑制剂阴性对照(si-FGD5-AS1+inhibitor-NC)组和共转染si-FGD5-AS1和miR-195-5p inhibitor(si-FGD5-AS1+miR-195-5p inhibitor)组;采用细胞增殖-毒性检测(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测各组细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time-PCR,qRT-PCR)法检测各组细胞中FGD5-AS1、miR-195-5p和TXNIP mRNA水平;采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞中TXNIP蛋白表达水平;双荧光素酶活性验证miR-195-5p和FGD5-AS1、TXNIP之间的靶向关系。结果相较于对照组,OGD/R组细胞存活率、克隆形成数量及miR-195-5p表达水平均降低(P<0.05),而细胞凋亡率、细胞中FGD5-AS1、TXNIP mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05);相较于OGD/R组,si-FGD5-AS1组细胞凋亡率、FGD5-AS1和TXNIP mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),而细胞存活率、克隆形成数量及miR-195-5p表达水平升高(P<0.05);回补实验发现,miR-195-5p inhibitor逆转了敲低FGD5-AS1对OGD/R细胞增殖及凋亡所造成的影响(P<0.05);双荧光素酶活性验证了miR-195-5p和FGD5-AS1、TXNIP均存在靶向结合位点,具有靶向关系(P<0.05)。结论敲低LncRNA FGD5-AS1能够通过提高miR-195-5p表达水平、降低TXNIP表达水平来影响氧糖剥夺/复氧小胶质细胞的增殖及凋亡情况。

CircACTR2调节miR-497-5p/TXNIP轴对高糖诱导的滋养层细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的探讨CircACTR2调节miR-497-5p/TXNIP轴对高糖诱导的滋养层细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法将HTR-8/SVneo细胞分为control组和高糖组,并对高糖组细胞进行质粒转染。qRT-PCR检测胎盘组织和HTR-8/SVneo细胞中CircACTR2、miR-497-5p、TXNIP mRNA表达,CCK-8法测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测TXNIP、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达,双荧光素酶报告实验与RIP实验验证CircACTR2、TXNIP与miR-497-5p的靶向调控关系。结果CircACTR2、TXNIP在GDM胎盘组织和高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞中表达升高,miR-497-5p表达降低(P<0.05);与control组比较,高糖组HTR-8/SVneo细胞OD_(450)值、迁移、侵袭细胞数、Bcl-2、N-cadherin表达显著降低,凋亡率、Bax、E-cadherin表达显著升高(P<0.05);干扰CircACTR2或过表达miR-497-5p可显著促进HTR-8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,抑制凋亡(P<0.05);抑制miR-497-5p表达或过表达TXNIP可逆转干扰CircACTR2或过表达miR-497-5p对HTR-8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的促进作用,增加凋亡(P<0.05)。双荧光素酶报告与RIP实验显示CircACTR2、TXNIP与miR-497-5p存在靶向调控关系。结论CircACTR2在高糖诱导的HTR-8/SVneo细胞中表达上调,干扰CircACTR2表达可能通过调节miR-497-5p/TXNIP,促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,抑制凋亡。