灰树花多糖通过LncRNA HULC/miR-186-5p轴调控胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:分析灰树花多糖(Grifola frondose polysaccharide,GFP)对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:将对数期GBC-SD细胞随机分组:对照组、GFP组(0.5、1、2µg/mL GFP)、shNC组、shHULC组、miR-NC组、miR-186-5p mimics组、GFP+pcDNA组、GFP+pcDNA-HULC组。CCK-8法检测细胞抑制率;Transwell小室法检测GBC-SD细胞迁移和侵袭;Western Blot印迹检测Cyclin D1、P21、MMP-2、MM-9蛋白水平;qRT-PCR检测LncRNA HULC和miR-186-5p的水平;Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p的结合位点,双荧光素酶报告实验检测LncRNA HULC和miR-186-5p的靶向关系。裸鼠移植瘤实验检测GFP对GBC-SD细胞移植瘤体内生长的影响。结果:0.25~8µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用;与对照组比较,0.5、1、2µg/mL的GFP(极)显著(P<0.05,P<0.01)抑制GBC-SD细胞迁移和侵袭,(极)显著降低Cyclin D1、MMP-2和MM-9水平(P<0.05,P<0.01),(极)显著(P<0.05,P<0.01)增加P21水平,极显著(P<0.01)下调LncRNA HULC,上调miR-186-5p的表达(P<0.05,P<0.01);Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点,与miR-NC组比较,miR-186-5p mimics组HULC-WT的荧光素酶活性极显著降低(P<0.01),而HULC-MUT荧光素酶活性无统计学差异(P>0.05);与shNC组比较,shHULC组HULC相对表达水平极显著(P<0.01)降低,miR-186-5p相对表达水平极显著(P<0.01)增加,细胞存活率、迁移数目、侵袭数目极显著(P<0.01)降低,Cylin D1、MMP-2和MM-9水平极显著下调(P<0.01);与GFP+pcDNA组比较,GFP+pcDN-HULC组抑制率显著降低(P<0.05),迁移数目、侵袭数目极显著增加(P<0.01),Cylin D1、MMP-2和MM-9水平显著上调(P<0.05);与GFP+pcDNA给药组比较,GFP+pcDN-HULC给药组瘤体体积、质量极显著增加(P<0.01),miR-186-5p水平极显著下调(P<0.01)。结论:GFP可抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制与调控LncRNA HULC/miR-186-5p有关。

miR-186-5p通过靶向调控PTTG1抑制肺腺癌细胞的上皮-间质转化

先前研究表明,miR-186-5p在人类许多恶性肿瘤中扮演抑癌基因的作用,但其在肺腺癌上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用并不明确。本研究旨在证明,miR-186-5p可通过靶向调控PTTG1抑制肺腺癌细胞的上皮-间质转化。我们首先分析了miR-186-5p在人肺癌细胞中的表达。荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示,与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,肺腺癌细胞SPC-A1、A549中的miR-186-5p表达量明显降低。为研究miR-186-5p在肺腺癌细胞中的功能,利用GV369-miR-186-5p表达载体,实现了在A549细胞中的过表达。基因转染结合Transwell侵袭结果显示,与对照质粒转染的A549细胞相比,过表达miR-186-5p的A549细胞的体外侵袭能力明显下降。Western印迹检测细胞中EMT相关标志物揭示,GV369-miR-186-5p转染的A549细胞中的上皮-钙黏着蛋白(E-cadherin)表达明显上调,而神经-钙黏着蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达明显下调。同时,GV369-miR-186-5p转染引起其靶基因——垂体肿瘤转化基因1(pituitary tumor-transforming gene 1,PTTG1)编码蛋白在A549细胞中明显降低。重要的是,过表达miR-186-5p与敲减PTTG1均可导致上皮-钙黏着蛋白表达上调,而神经-钙黏着蛋白和波形蛋白下调;而miR-186-5p和PTTG1表达载体共转染后,3种EMT相关标志物在A549的表达与对照细胞的表达无明显差异,提示过表达PTTG1可抵消miR-186-5p对EMT相关标志物表达的影响。综上所述,miR-186-5p可通过靶向调控PTTG1抑制EMT的发生,进而抑制肺腺癌细胞的侵袭转移。

miR-186-5p对绵羊黑色素细胞迁移增殖的影响

旨在研究miR-186-5p对绵羊黑色素细胞迁移增殖的影响。本研究通过荧光定量PCR检测不同毛色绵羊皮肤中miR-186-5p的表达差异;运用细胞转染使miR-186-5p在绵羊黑色素细胞中过表达,然后通过荧光定量PCR检测miR-186-5p的表达,通过分光光度计测定转染细胞中黑色素含量,运用划痕试验判定黑色素细胞的增殖迁移能力。结果显示,miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中均有表达,但白色皮肤表达高于黑色皮肤且差异显著(P<0.05);在过表达miR-186-5p的绵羊黑色素细胞中,miR-186-5p的表达显著升高(P<0.01);黑色素含量显著减少(P<0.05);黑色素细胞的增殖和迁移能力有所降低。综上表明,miR-186-5p与绵羊皮肤黑色素的生成有关,绵羊黑色素细胞中过表达miR-186-5p降低了黑色素的生成,同时也抑制了绵羊黑色素细胞的迁移和增殖。

MiR-186-5p通过靶向调控RAB2A在乳腺癌细胞阿霉素耐药性中的逆转作用机制

目的探讨miRNA-186-5p在乳腺癌细胞阿霉素耐药性逆转作用中的分子机制。方法采用阿霉素诱导人乳腺癌细胞系MCF-7,建立阿霉素耐药性细胞株,命名为MCF-7/ADR;采用双荧光素酶实验检测miR-186-5p与RAB2A的靶向结合情况;采用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞中miR-186-5p、RAB2A mRNA的表达及RAB2A蛋白的表达情况;特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,下调MCF-7中的miR-186-5p后,采用CCK-8和Western blot分别检测乳腺癌细胞增殖情况以及RAB2A蛋白的表达;采用Western blot和CCK-8分别检测共转染后,细胞增殖情况的变化及PI3K/Akt信号通路的激活情况。结果双荧光素酶实验结果显示,RAB2A是miR-186-5p的直接靶点;qRT-PCR结果显示,在MCF-7/ADR细胞中miR-186-5p mRNA表达明显下调,而RAB2A mRNA表达没有明显变化,RAB2A的蛋白表达明显上调。特异性上调MCF-7/ADR中的miR-186-5p,其增殖能力明显下降,RAB2A蛋白的表达明显下调;下调MCF-7中的miR-186-5p,其增殖能力明显增加,RAB2A蛋白的表达明显上调。Western blot和CCK-8结果显示,过表达miR-186-5p使PI3K/Akt信号通路表达明显减弱,且上调RAB2A逆转了上调miR-186-5p所致的增殖能力的减弱。结论 miR-186-5p通过靶向调控RAB2A,经PI3K/Akt信号通路调控乳腺癌细胞的阿霉素耐药和增殖。

长链非编码RNA XIST通过miR-186调控宫颈癌细胞侵袭迁移及凋亡的分子机制

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)XIST通过miR-186调控宫颈癌细胞侵袭迁移及凋亡。方法:宫颈癌细胞中转染XIST shRNA,qRT-PCR检测XIST表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移,Western blot检测Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表达。生物信息学软件预测XIST和miR-186互补结合位点,荧光素酶报告载体鉴定。qRT-PCR检测XIST shRNA对miR-186表达影响。宫颈癌细胞中共转染XIST shRNA和miR-186 inhibitor,检测细胞凋亡、侵袭迁移和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平,评估抑制miR-186对XIST shRNA影响宫颈癌细胞凋亡、侵袭和迁移的作用。结果:转染XIST shRNA可以下调宫颈癌细胞中XIST表达水平,促进细胞凋亡并抑制细胞侵袭和迁移,诱导Cleaved Caspase-3蛋白表达,减少MMP-2和MMP-9蛋白表达。XIST可靶向调控miR-186表达,XIST shRNA可提高miR-186表达。miR-186 inhibitor可明显逆转XIST shRNA对宫颈癌细胞miR-186表达促进、凋亡促进、侵袭迁移抑制和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达影响。结论:下调XIST通过促进miR-186表达抑制宫颈癌细胞侵袭迁移并诱导细胞凋亡。

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。

MiR-186-5p对绵羊黑色素细胞黑色素生成的调控

黑色素合成是极其复杂的过程,其中涉及多种基因和miRNAs的参与。miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中差异表达,说明其可能与毛色形成有关,生物信息学预测和绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p和Mitf的差异表达间接说明二者可能存在靶向关系,双荧光报告直接证实了二者的靶向关系。为了证实miR-186-5p在黑色素形成中的作用,本研究构建miR-186-5p真核表达载体,并转染绵羊黑素细胞。结果显示,miR-186-5p通过与Mitf mRNAs的3′UTR结合抑制Mitf的表达和翻译。MITF是Tyr基因家族的调节因子。实时荧光聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western免疫印迹结果表明,过表达miR-186-5p引起的MITF下调抑制了TYR、TYRP1和TYRP2的表达。其中,mRNA表达水平分别下降34%、66%和52%;蛋白质表达水平分别下降32%、6%和46%。分光光度检测结果显示,黑色素含量下降59%倍。上述结果表明,miR-186-5p通过抑制靶基因Mitf的表达,抑制了绵羊黑素细胞内黑色素的生成。

生物信息学预测hsa-miR-186的靶基因与功能

目的利用生物信息学的方法预测hsa-miR-186的靶基因与功能,为深入研究其生物学功能提供理论依据。方法利用Pubmed检索miR-186相关文章,进行总结分析;用miRbase、NCBI等在线工具分析hsa-miR-186序列及所在基因组特征;用TargetScan、PicTar及miRanda预测hsa-miR-186的靶基因,结合已证实的靶基因进行功能富集分析(GO analysis)和信号转导通路富集分析(Pathway analysis)。结果已有的研究证实miR-186与多种肿瘤发生、发展有关;参与压力应激引起的神经功能改变,并在心血管疾病中表达异常。hsa-miR-186位于人类染色体1p31.1,序列具有高度保守性。hsa-miR-186靶基因功能富集在糖代谢、肾脏发育、视觉功能、神经功能、脂质转运等生物学过程;信号通路涉及前列腺癌、肿瘤信号通路、p53信号通路、黑色素瘤、细胞黏附分子和细胞周期等信号通路。结论 hsa-miR-186功能广泛,与神经系统发育、细胞增殖与凋亡、糖代谢和脂质转运等密切相关。

拟黑多刺蚁活性组分通过miR-186-5p/Cx43促进结直肠癌SW116细胞凋亡的作用

目的 探究拟黑多刺蚁活性组分促进结直肠癌SW116细胞凋亡的作用机制。方法 采用CCK8法、划痕实验、凋亡实验检测拟黑多刺蚁活性组分对SW116细胞增殖、迁移和凋亡的影响,Western blot法检测拟黑多刺蚁活性组分对SW116细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响,RT-qPCR法检测miR-186-5p表达,双荧光素酶报告基因实验验证miR-186-5p与GJA1的靶向关系;过表达/抑制miR-186-5p,并检测Cx43蛋白表达;过表达Cx43,并检测拟黑多刺蚁活性组分对凋亡及相关蛋白、PI3K/Akt信号通路的影响。结果 拟黑多刺蚁活性组分能抑制SW116细胞增殖和迁移能力、Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡、Bax蛋白和miR-186-5p表达。GJA1是miR-186-5p的下游靶基因,过表达miR-186-5p可降低SW116细胞Cx43蛋白表达,抑制miR-186-5p表达可升高SW116细胞Cx43蛋白表达,抑制miR-186-5p表达可逆转拟黑多刺蚁活性组分对Cx43表达的抑制作用。过表达Cx43可逆转拟黑多刺蚁活性组分对SW116细胞凋亡及相关蛋白、PI3K/Akt信号通路的影响。结论 拟黑多刺蚁活性组分抑制SW116细胞恶性生物学行为,通过miR-186-5p/Cx43调控PI3K/Akt信号通路,促进结直肠癌SW116细胞凋亡。

长链非编码RNA SNHG3通过靶向调节miR-186-5p调控WNT5A对黑色素瘤增殖和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA SNHG3、miR-186-5p和WNT5A对黑色素瘤增殖和侵袭的影响情况及相关机制。方法qPCR检测黑色素瘤组织和癌旁组织、黑色素瘤细胞系和人永生化表皮细胞系中SNHG3、miR-186-5p和WNT5A的表达情况;采用starBase数据库预测并用双荧光素酶报告基因验证SNHG3与miR-186-5p、miR-186-5p和WNT5A的靶向关系;采用SNHG3-siRNA和miR-186-5p抑制剂分别构建SNHG3和miR-186-5p低表达模型,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞侵袭,qPCR和Western blotting检测干扰SNHG3或miR-186-5p后WNT5A的mRNA和蛋白表达情况。结果与癌旁组织或人永生化表皮细胞相比,黑色素瘤组织或细胞中SNHG3表达明显增高(P<0.05);miR-186-5p表达明显降低(P<0.05),二者表达水平呈负相关;荧光素酶活性实验进一步证实SNHG3和miR-186-5p存在靶向关系;功能实验证实,敲低SNHG3抑制了黑色素瘤细胞的增殖和侵袭,而低表达miR-186-5p具有相反的效应。进一步探究miR-186-5p的下游机制表明,WNT5A是其下游的重要靶点。结论SNHG3在黑色素瘤发生发展过程中起重要作用,SNHG3可以调节miR-186-5p/WNT5A轴调控黑色素瘤细胞的增殖和侵袭能力。

白藜芦醇通过circACTR2/miR-186-5p对高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨白藜芦醇对高糖诱导的视网膜血管内皮细胞(hRMEC)损伤的影响及机制。方法hRMEC分为正常对照(NG)组、高糖(HG)组、HG+白藜芦醇低、中、高剂量组、HG+si-NC组、HG+si-circACTR2组、HG+白藜芦醇+pcDNA组、HG+白藜芦醇+pcDNA-circACTR2组。流式细胞术检测各组hRMEC凋亡率,ELISA检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、乳酸脱氢酶(LDH)水平和丙二醛(MDA)含量,RT-qPCR检测circACTR2和miR-186-5p的表达水平;双荧光素酶报告实验检测circACTR2和miR-186-5p的靶向关系。结果低、中、高剂量白藜芦醇处理后,高糖诱导的hRMEC的凋亡率降低,SOD活性升高,LDH水平和MDA含量降低,circACTR2表达水平降低,miR-186-5p表达水平升高,呈剂量依赖性(P<0.05)。沉默circACTR2后,hRMEC的凋亡率降低,SOD活性升高,LDH水平和MDA含量降低(P<0.05)。过表达circACTR2可减弱白藜芦醇对高糖诱导的hRMEC损伤的作用。circACTR2靶向调控miR-186-5p表达。结论白藜芦醇可通过调控circACTR2/miR-186-5p抑制高糖诱导的hRMEC损伤。

急性冠状动脉综合征(ACS)患者血清miR-186-5p,miR-23和miR-652水平检测的临床意义

目的探讨急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平检测的临床意义。方法选择2016年1月~2018年1月在延安大学附属医院行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)手术的ACS患者68例作为观察组,另外选取同期做冠脉造影符合冠心病诊断,但排除ACS的患者68例作为对照组。收集两组受试对象外周血,检测血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平,并进行相关性分析。绘制ROC曲线分析miR-186-5p,miR-23b和miR-652单个指标及联合使用诊断ACS的临床价值。结果与对照组比较,观察组患者血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平均提高,差异有统计学意义(Z=3.312~6.451,均P<0.05)。不同病变支数的ACS患者血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652的水平比较不全相同,差异有统计学意义(F=6.017~8.151,均P<0.05)。与术前比较,术后患者血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平显著降低,差异有统计学意义(Z=2.090~3.036,均P<0.05)。ACS患者血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平与cTnI呈显著相关(r=0.689,0.779,0.746,均P=0.000)。其临界值、AUC,灵敏度和特异度,miR-186-5p依次为0.110,0.775,61.8%和91.2%;miR-23b依次为0.133,0.799,69.1%和88.2%;miR-652依次为0.164,0.789,67.6%和91.2%。三者联用AUC,灵敏度和特异度分别为0.941,91.2%和83.8%。cTnI的AUC灵敏度和特异度分别为0.857,76.5%和79.4%。miRNAs联合AUC显著高于cTnI(Z=2.243,P<0.05)。结论ACS患者血清中miR-186-5p,miR-23b和miR-652水平升高,联合使用诊断ACS具有一定的临床价值。

LncRNA SNHG7通过抑制miR-186增强人急性髓系白血病细胞耐药性

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG7通过抑制miR-186对人急性髓系白血病(AML)细胞化疗耐药性的影响。方法取AML初诊患者、复发/难治患者及健康对照者的外周血;AML阿霉素敏感细胞(HL60)和AML阿霉素耐药细胞(HL60/ADM),采用荧光定量PCR检测外周血及细胞样本中SNHG7和miR-186的表达。CCK8法实验检测HL60和HL60/ADM细胞对阿霉素的敏感性并计算半数抑制浓度(IC 50)。在HL60/ADM细胞中转染sh-SNHG7、miR-186 mimic或miR-186 inhibitor,荧光定量PCR检测SNHG7和miR-186的表达,CCK8检测HL60/ADM对阿霉素的剂量反应和IC 50值。双荧光素酶报告基因实验检测SNHG7与miR-186的靶向结合。结果AML初诊者和复发/难治者血清中SNHG7的表达水平显著高于对照组,miR-186的趋势与SNHG7相反(P<0.01)。用不同浓度阿霉素处理后,HL60/ADM细胞活力显著高于HL60细胞(P<0.05),且阿霉素对HL60/ADM细胞的IC 50值3.36±0.65显著高于HL60细胞0.43±0.16(P<0.001)。HL60/ADM细胞中SNHG7显著高表达(P<0.05),miR-186显著低表达(P<0.05)。sh-SNHG7或miR-186 mimic转染HL60/ADM细胞后显著增加对阿霉素的敏感性,使IC 50值分别从3.17±0.61减少到2.30±0.31,3.22±0.62减少到2.16±0.33(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实SNHG7的吸附靶基因为miR-186。结论SNHG7通过抑制miRNA-186增强AML细胞化疗耐药性。

miR-186通过负调控Smad6对胶质瘤细胞迁移和上皮间质转化的影响

目的研究miR-186通过负调控Smad6对人胶质瘤细胞迁移和上皮间质转化的影响。方法qRTPCR检测星形胶质细胞及胶质瘤细胞中miR-186和Smad6的表达,Western blot检测Smad6蛋白的表达水平;细胞分四组:空白对照组(U251)、模拟物组(miR-186 mimics)、质粒组(pc-Smad6)、共转染组(miR-186 mimics+pc-Smad6)。Western blot检测各组细胞Smad6、上皮间质转化相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达水平;划痕实验检测各组细胞的迁移情况。结果与正常星形胶质细胞比,人胶质瘤细胞系U251中miR-186表达明显降低,而Smad6表达明显升高(P<0.05)。较对照组,Smad6蛋白在miR-186 mimics组细胞中的表达显著下降,而在pc-Smad6组细胞中的表达则明显增加(P<0.05);miR-186 mimics组细胞迁移能力显著降低,而pc-Smad6组明显增强(P<0.05);miR-186 mimics组E-cadherin蛋白的表达显著升高,而Vimentin蛋白表达明显降低(P<0.05),在pc-Smad6组中两种分子的表达情况相反(P<0.05)。对比pc-Smad6组,miR-186 mimics+pc-Smad6组Smad6蛋白的表达水平明显降低(P<0.05);miR-186 mimics+pc-Smad6组细胞的迁移能力明显降低(P<0.05);miR-186 mimics+pc-Smad6组Vimentin表达明显降低,而E-cadherin的表达显著升高(P<0.05)。结论miR-186可通过调控Smad6的表达而抑制人胶质瘤细胞迁移和上皮间质转化。

CSE诱导支气管上皮细胞分泌外泌体miR-186促进肺成纤维细胞增殖

目的:研究香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)对支气管上皮细胞16HBE外泌体miR-186表达量的影响,以及16HBE来源的外泌体miR-186对肺成纤维细胞增殖的影响。方法:收集CSE处理的16HBE细胞上清中外泌体miR-186,用于MRC-5细胞培养;使用qPCR检测外泌体miR-186的表达;使用CCK-8检测MRC-5细胞增殖能力;使用双荧光素酶验证miR-186与Bcl2L11基因的靶向结合,使用Western blot检测Bcl2L11的表达。结果:透射电镜观察到16HBE细胞上清外泌体直径约100 nm的球形结构形态;CSE处理明显促进外泌体miR-186的表达;CSE诱导的外泌体miR-186能促进MRC-5细胞增殖;miR-186与Bcl2L11存在靶向结合关系;miR-186 mimic明显抑制了Bcl2L11的表达。结论:CSE诱导的16HBE细胞外泌体miR-186通过靶向结合Bcl2L11基因,在成纤维细胞增殖中起到重要作用。

过表达miR-186对白血病HL-60细胞增殖和凋亡作用机制的研究

目的探究过表达miR-186对白血病细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的调控作用。方法选取人白血病HL-60细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、细胞计数试剂-8(CCK-8)、Hoechst33258染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)及蛋白质印迹法(WB)法分析细胞形态、miR-186相对表达量、增殖能力、凋亡情况、相关因子表达水平。结果转染24 h后,与mimic NC组相比,miR-186组细胞生长受到抑制,miR-186相对表达量、凋亡细胞数、超氧化物歧化酶(SOD)、caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而细胞增殖活力、丙二醛(MDA)、p-PI3K和p-AKT、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。PI3K/AKT信号通路抑制剂的加入使各项指标差异更加显著(P<0.05)。结论过表达miR-186能够通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制人白血病HL-60细胞的增殖并改善氧化应激水平,促进细胞凋亡。

过表达miR-186减弱EMT途径抑制白血病细胞增殖、迁移及糖酵解

目的探究过表达miR-186对白血病细胞增殖、迁移、糖酵解和上皮间质转化(EMT)的影响。方法体外培养人白血病HL-60细胞,然后转染mimic NC和miR-186 mimic至HL-60细胞,分别设为mimic NC组(阴性对照组)和miR-186过表达组,非转染的细胞设为对照组。miR-186表达水平采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定;细胞形态用倒置显微镜观察;细胞增殖抑制率采用活细胞计数(CCK-8)法测定;细胞迁移率采用Transwell小室法测定;乳酸生成量和葡萄糖消耗水平分别采用萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒测定;EMT相关因子[E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)]表达水平使用RT-qPCR和蛋白免疫印迹(WB)法测定。结果转染24 h后,与对照组和mimic NC组相比,miR-186过表达组miR-186相对表达量、细胞增殖抑制率及E-cadherin mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05),而细胞迁移率、葡萄糖消耗水平、乳酸生成量及N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达水平显著减少(P<0.05);对照组和mimic NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达miR-186能够通过减弱EMT进程抑制人白血病HL-60细胞的增殖、迁移和糖酵解。

miR-186-5p调控PRKAA2促进肺腺癌细胞铁死亡的机制研究

背景与目的肺腺癌是最常见的非小细胞肺癌组织学类型,miRNAs作为基因表达的调控分子调控细胞增殖、凋亡和分化,从而影响细胞内稳态。本研究通过实验验证miR-186-5p通过调控其下游靶蛋白PRKAA2影响铁死亡途径从而抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。方法前期研究获得肺癌中表达显著下调的miRNA,即miR-186-5p;生物信息学方法预测其下游铁死亡相关靶蛋白并查询其在肺腺癌中的表达水平及对患者生存预后的影响;双荧光素酶验证两者结合位点;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测过表达miR-186-5p后PRKAA2的基因和蛋白表达情况;EdU、Transwell、划痕实验验证miR-186-5p在A549、H1299细胞中的增殖、侵袭迁移能力的影响以及miR-186-5p对Fer-1抑制铁死亡敏感性的作用机制;活性氧(reactive oxygen species,ROS)实验检测miR-186-5p对肺腺癌细胞ROS含量的影响;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)实验检测miR-186-5p、PRKAA2对肺腺癌细胞铁死亡指标变化的影响;脂质ROS(lipid ROS,L-ROS)实验检测miR-186-5p、PRKAA2对肺腺癌细胞L-ROS含量的影响。结果PRKAA2在肺腺癌中表达上调;过表达miR-186-5p使PRKAA2的基因和蛋白表达量下降;过表达miR-186-5p通过调控PRA2促进铁死亡抑制肺腺癌细胞增殖、侵袭迁移能力;miR-186-5p能够增加A549细胞ROS含量;过表达miR-186-5p和敲低PRKAA2上调肺腺癌细胞MDA含量,下调还原型GSH含量;miR-186-5p通过靶向PRKAA2增加肺腺癌细胞L-ROS含量,促进肺腺癌细胞铁死亡敏感性。结论miR-186-5p通过靶向调控PRA2促进肺腺癌A549、H1299细胞铁死亡,从而抑制肺腺癌增殖、侵袭和迁移能力。

miR-186-5p调控NEK2表达对HL-60细胞阿霉素耐药性的影响

目的探讨miR-186-5p调控中心体相关激酶2(NEK2)表达对HL-60细胞阿霉素(ADR)耐药性的影响。方法依次用0.092,0.184,0.552,0.920μmol/L ADR反复培养HL-60细胞,最终获得在0.920μmol/L ADR稳定生长的细胞系,即为HL-60/ADR细胞系。以HL-60细胞、HL-60/ADR细胞为研究对象,CCK-8法检测细胞活力及IC 50,qRT-PCR法测定细胞中miR-186-5p表达水平。将HL-60/ADR细胞分为对照组(正常培养)、miR-186-5p NC组(转染miR-186-5p阴性对照)、miR-186-5p mimic组(转染miR-186-5p mimic)、miR-186-5p mimic+NEK2 mimic组(共转染miR-186-5p mimic和NEK2 mimic),qRT-PCR法测定各组HL-60/ADR细胞中miR-186-5p表达水平,CCK-8法检测各组HL-60/ADR细胞活力及IC 50,Western blot法测定各组HL-60/ADR细胞中NEK2蛋白及耐药性蛋白抗P-蛋白(P-gp)、抗谷胱甘肽S-转移酶π(GST-π)表达水平,荧光素酶报告实验检测miR-186-5p与NEK2的靶向关系。结果与HL-60细胞相比,HL-60/ADR细胞中miR-186-5p表达水平显著降低(P<0.05),细胞活力及IC 50值升高(P<0.05)。与对照组相比,miR-186-5p NC组HL-60/ADR细胞中miR-186-5p、NEK2表达、细胞活力、IC 50值、P-gp、GST-π蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-186-5p mimic组HL-60/ADR细胞中miR-186-5p表达显著升高(P<0.05),NEK2表达、细胞活力、IC 50值、P-gp、GST-π蛋白显著降低(P<0.05)。与miR-186-5p mimic组相比,miR-186-5p mimic+NEK2 mimic组NEK2表达显著升高(P<0.05),细胞活力、IC 50值、P-gp、GST-π蛋白显著升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-186-5p与NEK2 mRNA存在靶向关系。结论上调miR-186-5p可降低HL-60/ADR细胞的ADR耐药性,可能是通过抑制NEK2表达实现的。

miR-186-5p调控猪原代前体脂肪细胞增殖和分化的研究

旨在探究miR-186-5p对猪原代前体脂肪细胞增殖和成脂分化的调控作用及机制。本研究采集7日龄健康马身猪公猪的颈部皮下脂肪,分离培养马身猪原代前体脂肪细胞;猪原代前体脂肪细胞分为4组,分别转染miR-186-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-186-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),用CCK8和划痕试验分析猪原代前体脂肪细胞的增殖效果,油红O染色检测其成脂分化能力,qPCR检测其增殖和成脂分化相关基因的表达水平;预测miR-186-5p的靶基因,用双荧光素酶报告试验检测miR-186-5p与靶基因的相互作用。结果,当猪原代前体脂肪细胞中转染mimics时,miR-186-5p的表达量极显著升高(P<0.01),细胞增殖能力和增殖相关基因:增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinases 4,CDK4)的表达量以及预测靶基因去乙酰化酶2(sirtuins 2,SIRT2)的表达量都极显著降低(P<0.01),而细胞成脂分化能力和成脂分化相关基因:过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)、固醇调节元件结合转录因子1(sterol regulatory element binding transcription factor 1,SREBF1)、CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4,FABP4)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的表达量都极显著升高(P<0.01);当猪原代前体脂肪细胞转染inhibitor时,miR-186-5p的表达量极显著降低(P<0.01),细胞增殖能力以及增殖相关基因PCNA和CDK4的表达量、预测靶基因SIRT2的表达量都显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而细胞成脂分化能力以及成脂分化相关基因PPARγ、SREBF1、C/EBPβ、FABP4、LPL的表达量都极显著降低(P<0.01)。转染miR-186-5p mimics可以显著抑制SIRT23′UTR野生型双荧光素酶报告载体(SIRT2-Wt-psiCHECK-2)中荧光素酶的活性,但不影响SIRT23′UTR突变型双荧光素酶报告载体(SIRT2-Mut-psiCHECK-2)中荧光素酶的活性。miR-186-5p可以靶向结合SIRT2的3′UTR序列,降低SIRT2的表达,抑制马身猪原代前体脂肪细胞增殖,促进其成脂分化。