miR-325-3p通过靶向HE4抑制卵巢癌细胞SKOV3化疗耐药性的研究

目的探讨miR-325-3p通过靶向人附睾蛋白4(HE4)基因对卵巢癌细胞SKOV3顺铂(CDDP)耐药的影响。方法采用浓度梯度递增法构建对CDDP耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/DDP。CCK-8检测经不同浓度梯度的CDDP处理后亲代细胞SKOV3和耐药细胞SKOV3/DDP对CDDP的耐药性。随后,将SKOV3/DDP细胞随机分为空白对照组,阴性对照组和miR-325-3p组。其中,空白对照组不做任何处理,阴性对照组细胞转染阴性对照miR-NC,miR-325-3p组转染miR-325-3pmimic。采用CCK-8检测细胞半数抑制浓度(IC50)。流式细胞术检测细胞凋亡率。TargetScan数据库预测miR-325-3p与HE4 mRNA 3’UTR的结合位点。双荧光素酶报告基因实验验证miR-325-3p与HE4 mRNA 3’UTR的靶向性。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-325-3p和HE4 mRNA表达。Westernblotting实验检测HE4蛋白表达。结果亲代细胞SKOV3对CDDP的IC50为14.15μM,耐药细胞SKOV3/DDP对CDDP的IC50为45.29μM,且耐药倍数(RI)为3.20。与亲代细胞SKOV3比较,耐药细胞株SKOV3/DDP中miR-325-3p表达明显降低(P<0.05),而HE4 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。另外,与空白对照组比较,阴性对照组中miR-325-3p表达、HE4 mRNA和蛋白表达、对CDDP的IC50以及细胞凋亡率均无明显差异(P>0.05)。与阴性对照组比较,miR-325-3p组中miR-325-3p表达、细胞凋亡率均显著升高(P<0.05),而对CDDP的IC50、HE4 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论miR-325-3p通过靶向HE4抑制卵巢癌细胞SKOV3对CDDP的耐药性。

miR-325-3p通过CCL19基因调控非小细胞肺癌脑部转移的发展

目的:探索非小细胞肺癌患者发生脑部转移的分子机制。方法:采用2个独立的分析数据来源(GEO公共数据库芯片和临床募集非小细胞肺癌患者样本)寻找最为显著的差异基因和差异miRNA。定量PCR方法检测差异基因在非小细胞肺癌脑部转移患者和无脑部转移患者中的差异性。利用非小细胞肺癌细胞系A549,检测靶点基因对于肺癌细胞增殖、分化、凋亡以及侵袭的影响,并进一步研究下游分子通路。结果:与非小细胞肺癌无脑部转移患者相比,非小细胞肺癌脑部转移患者呈现352个差异性表达基因,其中CCL19基因差异性最显著(低表达,P<0.01)。CCL19是miR-325-3p的主要候选靶标。CCL19在非小细胞肺癌脑部转移组患者肺部组织中存在低表达,而miR-325-3p存在高表达。荧光素酶实验可以证实miR-325-3p直接调控CCL19的表达活性。miR-325-3p抑制剂转染后,A549细胞的侵袭、增殖和集落形成有了显著的降低(P<0.05),而细胞凋亡水平有了明显的增加。同时转染CCL19 siRNA可以有效地降低miR-325-3p抑制剂对于非小细胞肺癌细胞的调节功能。研究表明,CCL19主要通过调节下游Erk的磷酸化水平影响肺癌细胞功能调控。结论:初步证实,miR-325-3p作为致癌基因,通过调控CCL19的功能,继而影响下游Erk分子信号,最终控制肺癌细胞的侵袭、增殖和集落形成。

MiR-325-3p通过靶向PBOV1抑制人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:研究miR-325-3p抑制肝癌细胞增殖和转移的作用以及其作用靶点。方法:通过qRT-PCR方法研究肝癌组织以及肝癌细胞中miR-325-3p的表达情况。肝癌细胞HepG2转染miR-325-3p mimic后,通过CCK-8和Transwell法研究miR-325-3p对肝癌细胞HepG2增殖和转移的影响。通过双荧光素实验研究miR-325-3p的作用靶点。通过CCK-8和Transwell实验验证miR-325-3p与PBOV1相互作用调控HepG2细胞增殖与迁移。结果:肝癌组织和肝癌细胞中miR-325-3p表达量明显低于癌旁正常组织或正常肝细胞。miR-325-3p-mimic可显著抑制HepG2细胞增殖、侵袭和迁移。PBOV1是miR-325-3p的靶基因。与转染miR-325-3p-mimic+Lenti-Con比较,转染miR-325-3p-mimic+Lenti-PBOV1的HepG2细胞增殖、迁移与侵袭增强。结论:MiR-325-3p通过靶向结合PBOV1来抑制肝癌细胞增殖和转移。

mir-325-3p激活RIPK3/TFEB信号通路减轻脑出血大鼠神经元损伤

目的探讨mir-325-3p通过调控RIPK3/TFEB通路对脑出血大鼠神经元损伤的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组、agomir NC组、agomir-325-3p组、GSK872(RIPK3抑制剂)组、agomir-325-3p+GSK872组,每组18只。评估大鼠运动功能、肢体协调能力、改良神经功能缺损评分(mNSS),测定大鼠脑含水量、血肿周围脑组织病理变化、神经细胞凋亡、神经元自噬、LC3与NeuN共定位、海马组织RIPK3/TFEB信号通路、自噬相关蛋白表达。结果与假手术组相比,脑出血组CA1区神经元肿胀,排列疏松,可见大量溶酶体和自噬小体,前肢放置成功率、左侧转身百分比、TFEB下降(P<0.05),mNSS评分、脑含水量、神经细胞凋亡率、RIPK3、Beclin-1和LC3-II/LC3-Ⅰ、LC3/NeuN强阳性个数升高(P<0.05);agomir-325-3p、GSK872可减轻大鼠海马神经元损伤,增强自噬,且两者有协同作用。结论mir-325-3p过表达可通过调控RIPK3/TFEB促进自噬,减轻脑出血大鼠神经元损伤。

miR-325-3p靶向CLDN1基因调控胃癌上皮间质转化和侵袭转移

目的探讨miR-325-3p靶向CLDN1基因对胃癌上皮间质转化和侵袭转移的影响。方法选取人胃黏膜上皮细胞株GES-1以及人胃癌细胞株HGC27、SGC-7901、MKN-45和MGC-803,并检测细胞中miR-325-3p和CLDN1的表达。双荧光素酶报告实验验证miR-325-3p和CLDN1的靶向关系,干预胃癌细胞中miR-325-3p和CLDN1的表达,qRT-PCR和Western blot检测细胞中N-cadherin、Vimentin和MMP2的表达,CCK-8检测细胞增殖活力,Transwell和流式细胞仪分别检测细胞侵袭和凋亡能力。结果相对于GES-1细胞,MGC-803细胞中miR-325-3p表达降低而CLDN1表达增高(均P<0.05),双荧光素酶报告实验证实CLDN1为miR-325-3p的靶基因。过表达miR-325-3p能够抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化,促进胃癌细胞凋亡,抑制miR-325-3p则能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化,抑制胃癌细胞凋亡(均P<0.05)。而过表达CLDN1则能够逆转miR-325-3p过表达对胃癌细胞生物学行为的影响。结论miR-325-3p能够靶向抑制CLDN1进而抑制胃癌细胞的侵袭转移和上皮间质转化,促进胃癌细胞凋亡,miR-325-3p有望成为治疗胃癌的新靶点。

miR-325-3p通过靶向FOXM1调控乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮-间质转化的实验研究

目的探讨miR-325-3p通过靶向叉头框蛋白(FOX)M1调控乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(EMT)。方法培养MCF-7细胞,根据转染质粒不同分为NC组(转染miRNA mimic阴性对照)、miR-325-3p组(转染miR-325-3p mimic)、miR-NC组(转染miRNA inhibitor阴性对照)、miR-325-3p inhibitor组(转染miR-325-3p inhibitor)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空质粒)、FOXM1组(转染pcDNA3.1-FOXM1)、si-NC组(转染si-NC无意义序列)、si-FOXM1组(转染si-FOXM1质粒)、miR-325-3p inhibitor+si-FOXM1组(转染miR-325-3p inhibitor+si-FOXM1质粒)及miR-325-3p inhibitor+si-NC组(转染miR-325-3p inhibitor+si-NC无意义序列)。CCK-8检测细胞24、48、72 h增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-qPCR检测细胞miR-325-3p、FOXM1 mRNA水平,Western blot检测细胞FOXM1、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平,萤光素酶实验检测miR-325-3p与FOXM1的靶向关系。结果miR-325-3p组miR-325-3p表达水平高于NC组(P<0.01),miR-325-3p inhibitor组miR-325-3p水平低于miR-NC组(P<0.01)。48、72 h,miR-325-3p组光密度(OD)值、侵袭细胞数及迁移率低于NC组(P<0.01),miR-325-3p inhibitor组OD值,侵袭细胞数及迁移率高于miR-NC组(P<0.01)。miR-325-3p组E-cadherin蛋白表达水平高于NC组,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平低于NC组(P<0.01);miR-325-3p inhibitor组E-cadherin蛋白表达水平低于miR-NC组,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平高于miR-NC组(P<0.01)。FOXM1组细胞FOXM1蛋白、mRNA表达水平高于pcDNA3.1组(P<0.01);si-FOXM1组FOXM1蛋白、mRNA表达水平低于si-NC组(P<0.01)。48、72 h,FOXM1组OD值、侵袭细胞数及迁移率高于pcDNA3.1组(P<0.01);si-FOXM1组OD值,侵袭细胞数及迁移率低于si-NC组(P<0.01)。FOXM1组E-cadherin蛋白表达水平低于pcDNA3.1组,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平高于pcDNA3.1组(P<0.01);si-FOXM1组E-cadherin蛋白表达水平高于si-NC组,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平低于si-NC组(P<0.01)。48、72 h,miR-325-3p inhibitor+si-FOXM1组OD值、侵袭细胞数及迁移率低于miR-325-3p inhibitor+si-NC组(P<0.01)。miR-325-3p inhibitor+si-FOXM1组E-cadherin蛋白表达水平高于miR-325-3p inhibitor+si-NC组,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平低于miR-325-3p inhibitor+si-NC组(P<0.01)。miR-325-3p组FOXM1蛋白、mRNA表达水平低于NC组(P<0.01);miR-325-3p inhibitor组FOXM1蛋白、mRNA表达水平高于miR-NC组(P<0.01)。NC+WT-FOXM1组与NC+MUT-FOXM1组萤光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05);miR-325-3p+WT-FOXM1组萤光素酶活性低于miR-325-3p+MUT-FOXM1组(P<0.01)。结论miR-325-3p在乳腺癌组织中低表达,过表达miR-325-3p可靶向FOXM1抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT。

miR-325-3p通过靶向调控S100B对帕金森病模型细胞损伤的保护作用及其机制

目的研究miR-325-3p对帕金森病(PD)模型细胞损伤的保护作用及潜在机制。方法用100μmol/L的1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)诱导人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞建立PD模型,qRT-PCR检测MPP+诱导的SK-N-SH细胞中S100B mRNA和miR-325-3p的表达,Western印迹检测S100B、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase3)蛋白表达,试剂盒检测检测细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-325-3p与S100B的调控关系。结果与Con组相比,MPP+组诱导的SK-N-SH细胞中S100B mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.05),miR-325-3p表达量显著下降(P<0.05);过表达miR-325-3p和干扰S100B表达均可减轻MPP+诱导的SK-N-SH细胞氧化损伤,抑制细胞凋亡;miR-325-3p靶向负调控S100B的表达;过表达S100B逆转了过表达miR-325-3p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞氧化损伤和凋亡的作用。结论miR-325-3p通过靶向抑制S100B表达减轻MPP+诱导的SK-N-SH细胞损伤,抑制细胞凋亡。miR-325-3p可能是成为PD的分子靶点。

miR-325-3p靶向CLDN1调控人肝癌细胞增殖、侵袭与迁移

目的探讨微小核糖核酸-325-3p(miR-325-3p)靶向紧密连接蛋白1(CLDN1)调控人肝癌细胞增殖、侵袭与迁移的作用。方法将对数生长期的人肝癌细胞株SMMC-7721分为四组:阴性对照组、上调组、下调组和正常组。荧光显微镜观察各组细胞转染效率;细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖活性;侵袭小室(Transwell)实验检测各组细胞侵袭和迁移活性;实时-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞miR-325-3p、CLDN1、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫印迹法(WB)检测各组CLDN1、ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达及p-ERK1/2水平;双荧光素酶报告基因检测验证miR-325-3p对CLDN1的作用。结果阴性对照组、上调组和下调组细胞转染效率分别为(91.38±16.21)%、(92.17±15.93)%、(94.12±17.05)%;与正常组、阴性对照组和上调组比,下调组细胞吸光度值上升,增殖抑制率显著下降,侵袭细胞数和迁移细胞数增加,miR-325-3p表达和E-cadherin mRNA和蛋白表达显著下降,CLDN1、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA和蛋白表达上升,ERK1/2 mRNA表达上升,p-ERK1/2水平、p-ERK1/2/ERK1/2水平上升,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);双荧光素酶报告基因实验证实miR-325-3p可靶向调控CLDN1的表达。结论miR-325-3p可抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移,可能与靶向CLDN1,抑制ERK1/2表达,促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin、Vimentin、MMP-2表达相关。

膝关节骨关节炎血清中RIP3、miR-325-3p表达及临床意义

目的探讨膝关节骨关节炎患者血清中受体相互作用蛋白质激酶3(RIP3)、微小RNA(miR)-325-3p表达,分析二者与膝关节骨关节炎病情严重程度及相关指标的关系。方法选取2020年1月至2021年9月该院收治的190例膝关节骨关节炎患者作为骨关节炎组,及同期该院200例健康体检者作为对照组。采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测血清RIP3 mRNA、miR-325-3p相对表达水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-6(IL-6)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平。相关性分析采用Pearson相关性分析,诊断价值分析采用受试者工作特征(ROC)曲线。结果骨关节炎组血清RIP3 mRNA、MMP-13、IL-6、COMP表达水平高于对照组(P<0.05),血清miR-325-3p相对表达水平低于对照组(P<0.05)。随着KL分级增加,血清RIP3 mRNA相对表达水平逐渐升高(P<0.05),血清miR-325-3p相对表达水平逐渐降低(P<0.05)。膝关节骨关节炎患者血清RIP3 mRNA与miR-325-3p相对表达水平呈负相关(P<0.05);血清RIP3 mRNA与MMP-13、IL-6、COMP水平均呈正相关(P<0.05),血清miR-325-3p与MMP-13、IL-6、COMP水平呈负相关(P<0.05)。血清RIP3 mRNA、miR-325-3p相对表达水平联合诊断膝关节骨关节炎的曲线下面积明显高于二者单独诊断(P<0.05)。结论miR-325-3p在膝关节骨关节炎血清中呈低表达,RIP3 mRNA呈高表达,二者均可作为诊断膝关节骨关节炎的指标,且可能通过影响MMP-13、IL-6、COMP水平,参与膝关节骨关节炎的发生与发展。

珠子参总皂苷通过上调miR-325-3p抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞凋亡和炎症因子释放

目的:探讨珠子参总皂苷对脂多糖诱导的星形胶质细胞凋亡和炎症因子表达的影响及可能机制。方法:体外培养大鼠星形胶质细胞,不同剂量(50,100,200μg·ml-1)的珠子参总皂苷作用于脂多糖诱导的星形胶质细胞24 h、脂多糖处理转染miR-325-3p模拟物的星形胶质细胞24 h或200μg·ml-1的珠子参总皂苷作用于脂多糖诱导的的转染miR-325-3p抑制剂的星形胶质细胞24 h后,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹法检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved-caspase9)蛋白表达,试剂盒检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞中微小RNA-325-3p(miR-325-3p)表达。结果:珠子参总皂苷可降低脂多糖诱导的星形胶质细胞凋亡率、细胞中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达及TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05),促进miR-325-3p表达(P<0.05),且呈剂量依赖性。过表达miR-325-3p可降低脂多糖诱导的星形胶质细胞凋亡率、细胞中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达及TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05)。敲减miR-325-3p逆转珠子参总皂苷对脂多糖诱导的星形胶质细胞凋亡及TNF-α和IL-6表达的抑制作用(P<0.05)。结论:珠子参总皂苷可能通过上调miR-325-3p表达抑制脂多糖诱导的大鼠星形胶质细胞凋亡和炎症反应。

电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

背景:越来越多的动物实验和临床研究证实电刺激可以促进周围神经损伤修复,具体的机制尚未完全明确。目的:探讨电刺激诱导miR-741-3p调控Radil对施万细胞迁移的影响。方法:①12只雄性SD大鼠,随机分为电刺激组和对照组,电刺激组在坐骨神经挤压伤后连续电刺激7 d,对照组在坐骨神经挤压后不做任何处理。术后第7天取损伤处神经,利用荧光原位杂交技术检测两组miR-741-3p的表达差异。②通过miRDB、TargetScan和miRWalk数据库预测miR-741-3p靶基因。③将miR-741-3p模拟物及其对照、miR-741-3p抑制物及其对照、Radil siRNA及其对照、miR-741-3p抑制物+Radil siRNA及miR-741-3p抑制物+siRNA对照对施万细胞进行转染,采用RT-PCR检测转染效率,Transwell小室检测施万细胞的迁移能力。结果与结论:①电刺激组神经残端miR-741-3p荧光强度低于对照组;②数据库预测结果显示有69个基因可能是miR-741-3p靶基因,Radil是预测靶基因之一,主要参与细胞黏附和迁移;③与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组施万细胞迁移数增多(P<0.05);与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组施万细胞迁移数减少(P<0.05);与siRNA对照组相比,Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05);④与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组Radil的表达水平升高;与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组Radil的表达水平降低;⑤与miR-741-3p抑制物+siRNA对照组相比,miR-741-3p抑制物+Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05)。结果表明,电刺激通过下调miR-741-3p调控Radi的表达来促进施万细胞迁移。

miR-212-3p靶向MAPK3调控骨髓间充质干细胞的衰老

背景:骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞表现出明显衰老状态,并且细胞活性及成骨分化水平显著降低。miR-212-3p能够抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化,但其对骨髓间充质干细胞衰老调控的作用及机制尚不明确。目的:研究miR-212-3p通过靶向丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)对骨髓间充质干细胞衰老的影响及其机制。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,收集第3代进行以下实验:①分2组培养:对照组加入完全培养基,造模组加入含H_(2)O_(2)的完全培养基培养,培养72 h后,检测细胞中β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p和MAPK3 mRNA表达,以及MAPK3、p16和p21蛋白表达。②分3组培养:对照组、抑制物对照组、miR-212-3p抑制物组,转染24 h后,检测细胞中miR-212-3p、MAPK3 mRNA表达及MAPK3蛋白表达。③采用双荧光素酶报告基因联合qRT-PCR和Western blot验证miR-212-3p与MAPK3靶向调控作用。④分组培养:分为对照抑制物组、miR-212-3p抑制物组、miR-212-3p抑制物+干扰对照组、miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,转染24 h后,检测细胞中MAPK蛋白与mRNA表达。分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+对照抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+干扰对照组、H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组,细胞转染24 h后再加入H_(2)O_(2)培养72 h,检测细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶活性、p16和p21蛋白表达。结果与结论:①与对照组比较,造模组β-半乳糖苷酶活性、miR-212-3p mRNA表达及p16、p21蛋白表达升高(P<0.05),MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。②与对照组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中miR-212-3p mRNA表达降低(P<0.05),MAPK3 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05)。③双荧光素酶报告基因实验证实,MAPK3是miR-212-3p下游靶基因。④与对照抑制物组比较,miR-212-3p抑制物组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05);与miR-212-3p抑制物组比较,miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中MAPK3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组β-半乳糖苷酶活性降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+对照抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组细胞中p16和p21蛋白表达降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物组比较,H_(2)O_(2)+miR-212-3p抑制物+MAPK3干扰组细胞中p16和p21蛋白表达升高(P<0.05)。⑤结果表明,下调miR-212-3p可抑制大鼠骨髓间充质干细胞衰老,其作用机制可能是通过靶向上调MAPK3表达实现的。

酸枣仁提取物调控miR-7b-3p/5-羟色胺1A受体表达促进骨生长

背景:前期研究发现,酸枣仁提取物通过提高脑组织5-羟色胺1A受体(serotonin 1A receptor,5-HT1AR)表达,使之与5-羟色胺结合,延长小鼠慢波睡眠,促进生长激素的分泌,从而使骨生长。5-HT1AR作为一种蛋白质,其表达丰度受到miRNA的调控。作者推测酸枣仁提取物可能通过miRNA调控5-HT1AR的表达从而发挥药物作用。目的:观察酸枣仁提取物通过干预小鼠脑组织中miR-7b-3p/5-HT1AR通路对骨骼生长的影响。方法:①将昆明种小鼠分为正常对照组、用药组(灌胃酸枣仁提取物0.320 mg/g),阳性对照组(灌胃酸枣仁皂甙0.013 mg/g)和酸枣仁提取物+5-HT1AR抑制剂组(灌胃酸枣仁提取物最后3 d同时每天侧脑室注射5-HT1AR选择性抑制剂P-MPPF 8μg),25 d后观察酸枣仁提取物对小鼠骨生长、血清生长激素水平及脑组织5-HT1AR表达的影响;②基因芯片法筛选由酸枣仁提取物引起的骨生长小鼠与普通小鼠脑组织差异表达的miRNAs,并通过PCR验证和双荧光素酶报告基因实验证实筛选的miR-7b-3p与5-HT1AR的调控关系;③体外培养小鼠脑皮质细胞并鉴定,利用Western blot法观察酸枣仁提取物对脑皮质细胞中5-HT1AR表达的影响;④将昆明种小鼠分为正常对照组、用药组、miR-7b-3p inhibitor组、用药+miR-7b-3p mimics组、阳性对照组,观察各组小鼠脑组织5-HT1AR表达及5-羟色胺与5-HT1AR结合活性;⑤将SD大鼠分为正常对照组、用药组、miR-7b-3p inhibitor组、用药+miR-7b-3p mimics组、阳性对照组,观察各组大鼠慢波睡眠的变化。结果与结论:①酸枣仁提取物可以促进小鼠体长、胫骨增长,促进生长激素分泌,提高脑组织5-HT1AR含量;②基因芯片筛选出差异表达的miRNAs个数为16个,其中上调有13个,下调有3个;生物信息学预测下调miR-7b-3p可以调控5-HT1AR表达,且双荧光素酶报告基因实验证实二者有直接调控关系;③酸枣仁提取物和沉默脑皮质细胞中miR-7b-3p表达可以引起5-HT1AR高表达;沉默miR-7b-3p后小鼠脑组织5-HT1AR表达、5-羟色胺与5-HT1AR结合活性及生长激素分泌均升高;过表达miR-7b-3p后小鼠脑组织5-HT1AR表达、5-羟色胺与5-HT1AR结合活性及生长激素分泌均降低;大鼠慢波睡眠期也相应延长或缩短。结果表明,酸枣仁提取物能够降低脑组织的miR-7b-3p水平,同时增加5-HT1AR的表达量。这种机制有助于延长慢波睡眠周期,并且促进生长激素的生成,对骨骼生长有积极影响,为使用酸枣仁提取物作为促进骨骼生长的潜在手段提供了科学依据。

miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体影响牙槽骨成骨细胞增殖及凋亡

背景:miR-338-3p能够抑制破骨细胞分化,下调核因子κB受体活化因子配体水平能够促进骨形成。然而miR-338-3p是否通过调控核因子κB受体活化因子配体表达影响牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡尚不清楚。目的:探究miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法:分离人牙槽骨成骨细胞,对其进行细胞转染及Wnt-C59(Wnt/β-catenin通路抑制剂)处理,分为转染对照组、miR-338-3p组、miR-338-3p+对照组、miR-338-3p+核因子κB受体活化因子配体组和miR-338-3p+Wnt-C59组。双荧光素酶实验验证miR-338-3p对核因子κB受体活化因子配体的调控作用;CCK-8、EdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞周期和凋亡水平;RT-qPCR检测细胞miR-338-3p、核因子κB受体活化因子配体、Wnt-3a、β-catenin、糖原合酶激酶3βmRNA表达水平;Western Blot检测细胞核因子κB受体活化因子配体、增殖细胞核抗原、Ki67、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Bax、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3、Wnt-3a、β-catenin、糖原合酶激酶3β蛋白表达水平。结果与结论:①miR-338-3p靶向调控核因子κB受体活化因子配体;②过表达miR-338-3p后,细胞存活率、EdU阳性细胞率、S期细胞比例升高,细胞凋亡率降低,miR-338-3p、增殖细胞核抗原、Ki67、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Wnt-3a、β-catenin mRNA和蛋白水平升高,Bax、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3、核因子κB受体活化因子配体、糖原合酶激酶3βmRNA和蛋白水平降低(均P<0.05);③过表达核因子κB受体活化因子配体或Wnt-C59处理能够减弱过表达miR-338-3p对细胞增殖、凋亡的影响(均P<0.05);④结果表明,miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体表达可促进牙槽骨成骨细胞增殖,并抑制细胞凋亡,其可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

miR-152-3p表达下调降低紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇的耐药性

目的探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇耐药性的影响及机制。方法①紫杉醇(1.875,3.75,7.5,17和23μmol·L^(-1))与人卵巢癌A2780和A2780T细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率,计算抑制细胞存活半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI)。Western印迹法检测A2780和A2780T细胞耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达。②实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p表达水平。脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p抑制物降低A2780T细胞中miR-152-3p表达(miR-152-3p抑制物组),同时设转染miR-152-3p阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞存活、迁移和凋亡的影响;Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。③用miRDB,Targetscan,miRWalk和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因,并用Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞磷酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白表达的变化及RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞PTEN mRNA表达水平予以验证。随后,脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达,同时设转染siRNA阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测沉默PTEN表达后A2780T细胞存活率和IC50值,Western印迹法检测P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达。结果①紫杉醇处理后A2780和A2780T细胞存活率均降低(P<0.01),A2780T细胞RI为2.8。与A2780细胞相比,A2780T细胞P-gp,MRP1和ABCG2蛋白高表达(P<0.05,P<0.01)。②与A2780细胞相比,A2780T细胞miR-152-3p明显高表达(P<0.01)。与转染miR-152-3p阴性对照组比较,转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和细胞迁移能力(P<0.05)明显降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。③生物信息学数据库分析结果提示,PTEN是miR-152-3p的一个靶基因;Western印迹法验证显示,转染miR-152-3p抑制物组A2780T细胞PTEN蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组(P<0.05);RT-qPCR结果显示,A2780T细胞PTEN mRNA表达水平高于A2780细胞(P<0.01)。转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后,与转染siRNA阴性对照组相比,A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和IC50值(P<0.01)显著降低,P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论miR-152-3p在A2780T细胞中高表达,其表达下调可抑制A2780T细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性,该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的。

lncRNA MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN介导慢性阻塞性肺疾病发展的分子机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MEG8通过调控miR-367-3p/磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)介导慢性阻塞性肺疾病(COPD)发展的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测16HBE细胞和COPD组织lncRNA MEG8表达水平;在香烟烟雾提取物(CSE)刺激后的16HBE细胞中过表达lncRNA MEG8及加入miR-367-3p inhibitor后同时敲减lncRNA MEG8或PTEN,采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测细胞凋亡、细胞增殖和炎症因子水平的变化;利用双荧光素酶报告系统对lncRNA MEG8、miR-367-3p、PTEN的靶向关系进行验证。结果 MEG8在CSE刺激的16HBE细胞和COPD临床组织样本中表达降低(P<0.05)。相比于CSE组,过表达MEG8后CSE刺激的16HBE细胞凋亡和炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平降低(P<0.05),促凋亡蛋白Bax、Caspase3和Cleaved-caspase3表达水平降低(P<0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验验证了MEG8可靶向抑制miR-367-3p(P<0.05),同时miR-367-3p可靶向抑制PTEN的表达(P<0.05),进而抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应(P<0.05)。在CSE刺激下,相较于Control组,加入miR-367-3p inhibitor可显著上调16HBE细胞中PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),增强细胞增殖活性(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase 3和Cleaved-caspase3的表达水平(P<0.05),上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05),抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05),随后敲降MEG8或PTEN可恢复PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),抑制细胞增殖活性(P<0.05),逆转miR-367-3p inhibitor导致的细胞凋亡(P<0.05)以及对凋亡相关蛋白的调控作用(P<0.05),增强炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN轴抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应,并可能为临床COPD的治疗提供新的治疗策略。

hsa-circ-002179靶向miR-143-3p调控自噬-凋亡平衡在胃癌5-氟尿嘧啶化疗耐药性中的作用研究

目的探究hsa-circ-002179靶向miR-143-3p调控自噬-凋亡平衡对胃癌的5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗耐药性的影响。方法通过5-Fu处理AGS细胞构建5-Fu耐药细胞模型(AGS/5-Fu),采用CCK8法检测5-Fu对AGS和AGS/5-Fu细胞活性的影响,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中hsa-circ-002179和miR-143-3p的表达;通过流式细胞术和Western blot分别检测细胞凋亡水平与自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和p62的表达。同时,通过软件预测hsa-circ-002179与miR-143-3p的结合位点,并采用RIP和双荧光素酶实验验证其结合作用。结果与对照组比较,耐药组的细胞活性[(172.33±9.53)%比(106.00±6.16)%,P<0.01]和自噬水平升高、凋亡率(20.5%比43.8%,P<0.01)降低,hsa-circ-002179表达升高[(4.46±0.34)比(1.05±0.66),P<0.01];转染si-002179后,耐药细胞活性降低[(80.00±2.45)%比(102.67±7.13)%,P<0.05],而凋亡水平升高(31.3%比21.8%,P<0.05)。RIP和双荧光素酶报告实验证实hsa-circ-002179与miR-143-3p直接结合,且与对照组比较,耐药细胞中miR-143-3p的表达降低[(0.38±0.05)比(1.04±0.07),P<0.01]。并且,hsa-circ-002179能够调控miR-143-3p的水平。同时,miR-143-3p抑制剂处理能够升高转染si-002179后的耐药细胞自噬水平。自噬抑制剂处理降低了耐药细胞的自噬水平和细胞活性,升高凋亡水平;在此基础上转染OE-002179则升高自噬水平和细胞活性,降低凋亡水平,进一步转染miR-143-3p模拟物可以逆转以上变化。结论hsa-circ-002179靶向miR-143-3p可能可以调控自噬-凋亡平衡,进而影响胃癌细胞的5-Fu化疗耐药性。

LncRNA HCG18通过靶向miR-140-3p/PD-L1通路对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨长非编码(lncRNA)HCG18通过微小RNA-140-3p(miR-140-3p)/程序性死亡受体配体1(PD-L1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法 选择人鼻咽癌CNE2细胞、人正常鼻黏膜上皮细胞HNEpC细胞,将CNE2细胞分为HCG18组、pcDNA3.1组、sh-HCG18组、sh-NC组、miR-140-3p组、miR-NC组、miR-140-3p inhibitor组、Scramble组、HCG18+miR-NC组、HCG18+miR-140-3p组、miR-140-3p inhibitor+sh-NC组及miR-140-3p inhibitor+sh-PD-L1组。用CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测PD-L1蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1 mRNA水平,生物信息学、双荧光素酶报告实验分析lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1的靶向关系。结果 CNE2细胞lncRNA HCG18、PD-L1蛋白及其mRNA表达水平高于HNEpC细胞,miR-140-3p表达水平低于HNEpC细胞(P <0.05)。上调lncRNA HCG18或下调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力增强,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平升高(P <0.05);下调lncRNA HCG18或上调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力降低,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平降低(P <0.05)。miR-140-3p与lncRNA HCG18、PD-L1均有靶向关系。上调miR-140-3p表达可逆转上调lncRNA HCG18对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用;沉默PD-L1可逆转下调miR-140-3p对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用。结论 过表达lncRNA HCG18可通过海绵化miR-140-3p,上调PD-L1表达,促进CNE2细胞增殖、迁移与侵袭。

miR-132-3p/CAMTA1对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠施万细胞的调控作用

目的探讨miR-132-3p通过钙调素结合转录因子1(CAMTA1)对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠(FNI)中施万细胞的调控作用。方法用I-125粒子辐射大鼠施万细胞,并在细胞中转染miR-132-3p mimic、miR-132-3p inhibitor以及sh-CAMTA1。免疫荧光检测S100B和β-TubulinⅢ荧光强度。RT-qPCR检测miR-132-3p的表达,Western blot检测CAMTA1蛋白表达。EdU染色评估细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。同时,构建FNI大鼠模型并在大鼠面部植入I-125粒子,HE、LFB染色以及IF染色评估大鼠面神经组织的病理损伤。StarBase v2.0数据库和双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p和CAMTA1的靶向关系。结果S100B和β-TubulinⅢ在大鼠施万细胞中显著表达。I-125粒子辐射组中miR-132-3p表达降低(P<0.001),抑制细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.001)。过表达miR-132-3p或敲降CAMTA1显著促进施万细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.05),敲降miR-132-3p则具有相反的作用。机制研究显示,miR-132-3p靶向负调控CAMTA1。体内实验结果显示,过表达miR-132-3p通过抑制CAMTA1的蛋白表达,减弱I-125粒子对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。结论过表达miR-132-3p抑制CAMTA1的表达,促进施万细胞的增殖和迁移,抑制I-125对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。