一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化监测活细胞中miRNA活性的新方法

建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc为报告基因的miRNA传感器质粒（命名为Gsensor）监测活细胞中miRNA（microRNA）活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA质粒作为Gsensor的空载体,同时其中的MCS位点可供插入miRNA的靶序列。以miR142-3p为检测对象,将1个和3个拷贝的与miR142-3p完全互补靶序列分别插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA中,构建成miR142-3p Gsensor和miR142-3p Gsensor-3。将它们分别转染至U937细胞中,检测培养上清中Gluc的表达水平。结果显示二者均可有效反映U937细胞中miR142-3p的抑制活性（分别与Gsensor空载体相比）,提示Gsensor中采用一个拷贝的miRNA靶序列即可满足检测要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142对miR142-3p活性的抑制作用。随后,分析了时间、转染剂量对Gsensor检测结果的影响。结果表明,在U937细胞中miR142-3p Gsensor表现的miR142-3p活性在48h后趋于稳定;Gsensor转染剂量在0.001~0.05pg/cell范围内不影响其功能。最后,利用miR142-3p Gsensor检测了HEK293、U937、K562、SP2/0和P815细胞内miR142-3p活性,结果发现miR142-3p活性在U937、K562、SP2/0和P815细胞中均较高,而在HEK293中几乎没有活性。用QRT-PCR方法检测miR142-3p的相对拷贝数。结果表明,在HEK293、U937和K562细胞中,miR142-3p活性与其相对拷贝数呈正相关。本研究表明Gsensor可作为一种有效的miRNA活性检测工具,为体外实时动态监测miRNA活性提供了一种新方法。

高通量miRNA活性谱检测发现BHK21细胞中miR-206高活性

用我们建立的活细胞miRNA活性谱检测技术测定BHK21、HEK293和Vero三种肾来源细胞系中58种miRNA活性谱,发现miR-206在BHK21细胞中具有特征性高活性。鉴于miR-206是典型的横纹肌特征性miRNA,进一步以小鼠成肌细胞C2C12及人胚肾细胞HEK293为对照,检测了BHK21细胞中miR-206的活性及表达水平。之后,用马血清诱导培养BHK21细胞,检测诱导前后BHK21细胞中骨骼肌肌球蛋白重链(Slowskeletal myosin heavy chain,MHC)表达情况,miR-206活性和表达水平以及受miR-206负调控的Connexin43(Cx43)的表达水平。结果发现,miR-206在BHK21细胞中活性和表达水平都明显高于C2C12细胞;马血清诱导后,BHK21细胞中MHC表达水平升高,miR-206活性和表达水平都升高,而Cx43表达水平下降。结果提示BHK21细胞具有成肌细胞特性。本研究首次发现BHK21细胞中miR-206的高活性,从miRNA角度证实了BHK21细胞来源于肾间质细胞,而不是肾实质细胞。研究结果还提示BHK21细胞有可能作为一种体外模型用于miR-206的功能研究。

LncRNA中miRNA海绵活性与肿瘤的研究进展

长链非编码RNA(LncRNA)在真核生物中履行许多调节功能,其功能失调与人类肿瘤等多种疾病相关。研究表明,多种LncRNA对miRNA具有海绵吸附作用,从而参与肿瘤发生发展过程。其微小核糖核酸(miRNA)海绵能作为miRNA有效抑制剂,是miRNA缺失功能研究重要工具。本文对LncRNA中miRNA海绵活性与人类肿瘤相关作一综述。