三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体(MS)活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗(MS-H株),B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示:三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示:在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。

PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。

黄颡鱼杆套病毒TaqMan qPCR检测方法的建立与应用

黄颡鱼杆套病毒(Yellow catfish nidovirus,YCNdV)是近年来在养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)中新发现的病毒性病原,为找到灵敏检测该病毒的方法,本研究根据YCNdV的衣壳基因序列设计特异性引物及探针,对反应体系和反应条件进行优化,建立了TaqMan qPCR方法,并与套氏PCR进行了临床样品的检出率比较。结果显示:反应体系优化后的引物和探针终浓度分别为0.4μmol/L和0.1μmol/L,获得的最佳退火延伸温度为58℃,该条件下,最低检测限为4 copies的pMD19-YCNdV.cap质粒标准品;标准曲线线性关系好且线性范围广(3.37×10^(10)~3.37×100 copies/μL),相关系数(R^(2))为0.9984,扩增效率为91.3%;特异性检测结果表明,与黄颡鱼小RNA病毒(Yellow catfish picornavirus,YCPrV)、草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(Grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)、大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)和锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)均无交叉扩增信号;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于0.6%;对保存的32份疑似黄颡鱼杆套病毒感染样品进行检测,结果表明,TaqMan qPCR检出率较套氏PCR高9.37个百分点;TaqMan qPCR检测发病黄颡鱼各组织发现,在脾、鳃和肾中YCNdV病毒载量显著高于其它组织。以上结果表明,本研究建立的TaqMan qPCR检测方法具有良好的特异性、重复性和超高的灵敏度,可用于YCNdV的定量检测,为YCNdV引起疾病的早防早治提供可靠检测手段。

含内参的登革和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法的建立与评估

目的 本研究旨在建立一种登革病毒以及寨卡病毒并含人类基因为内参的三重RT-qPCR检测方法,可以同时检测出内参、登革病毒以及寨卡病毒。方法 针对登革病毒4种血清型的保守区域和寨卡病毒的NS1基因以及人类各个组织中稳定表达的β-actin基因,设计3组特异性引物和探针。构建4种血清型的登革病毒、寨卡病毒以及β-actin标准质粒作为阳性质控品,采用L_(9)(3^(4))正交实验方法确定最佳反应条件,对其特异性、灵敏性及覆盖面进行验证与临床评估,并与检测登革病毒的商品化试剂盒进行了一致性评估。结果 本实验建立的三重RT-qPCR检测方法与12种相近虫媒病毒无非特异性交叉反应;对登革病毒与寨卡病毒的检测灵敏度分别为2.99和2.18 copies/μL组内和组间重复性变异系数均在1.5%以内;与商品化试剂盒相比较,该检测方法对13株登革流行病毒均可获阳性结果;经过Bland-Altman一致性分析,商品化试剂盒和该方法对临床阳性样本检测结果一致性达到92.59%。结论 本研究建立了一种特异性强、灵敏度高的含内参的登革病毒和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法,可作为登革病毒与寨卡病毒感染者的早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于病毒暴发地区的快速筛查。

猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用

人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。

猪流行性腹泻病毒微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法的建立

为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

qPCR检测白纹伊蚊携带Wolbachia分型及密度方法的建立与应用

目的白纹伊蚊天然携带A与B亚组沃尔巴克氏体Wolbachia,这种共生菌能够通过抑制宿主传播病毒能力或降低宿主种群密度来控制虫媒疾病传播,且这种作用强度与其密度密切相关,本文旨在建立一种准确检测蚊虫携带Wolbachia分型与密度的方法。方法克隆白纹伊蚊携带Wolbachia的wsp基因并测序,在w AlbA与w AlbB wsp基因的非保守区设计特异性引物,建立qPCR检测方法。结果该方法灵敏性和特异性良好,两亚组Wolbachia无交叉反应。利用该方法检测不同浓度四环素处理后蚊虫携带Wolbachia密度下降程度,确定最适四环素处理浓度为0.1 mg/mL。结论本方法的建立为研究Wolbachia在蚊虫生理生殖和天然免疫方面的作用提供了技术支撑。

芯片式支原体qPCR检测技术的开发与应用研究

目的:为解决目前支原体检测方法操作复杂、耗时长、灵敏度低等问题,按照《中华人民共和国药典》(ChP)、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)生物制品支原体检测方法及验证指导原则,构建一种快速芯片式的支原体检测方法,并对该方法检测能力进行验证。方法:采用Taqman探针法,并利用快速qPCR仪结合芯片检测支原体,快速高效,可极大降低检测成本。结果与结论:本研究建立的基于qPCR的支原体检测方法特异性强、稳定性佳、可重复性好,可为支原体感染的诊断检测和流行病学调查提供方法学支持。

MeRIP-qPCR技术检测RNA m^(6)A甲基化修饰对t(8;21)AML细胞中KDM4B基因表达的调控作用

目的:通过MeRIP联合逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术,证明WTAP介导的RNA m^(6)A修饰对伴t(8;21)急性髓系白血病(AML)细胞中KDM4B基因的直接调控作用。方法:采用靶向WTAP或KDM4B基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体沉默t(8;21)AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1中WTAP或KDM4B基因表达,以转染随机打乱序列(scramble)的shRNA的细胞为对照。用超纯RNA提取试剂盒(DNaseⅠ)提取细胞RNA,Magna MeRIP^(TM)m^(6)A Kit试剂盒富集甲基化修饰片段,并通过RT-qPCR检测m^(6)A甲基化修饰的RNA区域;采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞中WTAP、KDM4B蛋白和mRNA的表达水平。采用克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力。结果:沉默Kasumi-1细胞中WTAP的表达后,m^(6)A甲基化修饰在KDM4B mRNA 3’UTR的富集程度显著下降(P<0.01),沉默Kasumi-1和SKNO-1细胞中WTAP的表达可显著抑制KDM4B蛋白(P<0.001)和mRNA表达水平(Kasumi-1:P<0.001;SKNO-1:P<0.01)、细胞体外克隆形成能力下降(Kasumi-1:P<0.001;SKNO-1:P<0.01)。结论:t(8;21)AML细胞系中,WTAP通过调控KDM4B基因mRNA 3’UTR的m^(6)A修饰调控KDM4B的表达,沉默KDM4B表达可以抑制t(8;21)AML细胞增殖。

毒害艾美耳球虫疫苗ENYS株TaqMan qPCR检测方法的建立

为了对E.necatrix ENYS株在生产中进行质控及对临床应用效果的监测,该研究对ENYS株和ENGD株进行全基因组重测序,结合生物信息学分析建立了一种TaqMan qPCR检测技术。结果显示,En-marker5测序结果与预期相符,最优的引物浓度和探针浓度分别为500nM和250 nM,标准曲线的斜率为-3.249,相关系数为0.999,可以通过Ct值对模板浓度定量,该方法检测下线为290个拷贝/反应和50个卵囊/反应,灵敏度是传统PCR的10倍;该方法可以特异性检测EnYS株,不能扩增其他种的疫苗株和野毒株以及肠道病原菌;重复性检测的变异系数小于0.6%,重复性良好。本研究针对E.necatrix EnYS株开发了一种灵敏度高、特异性强、稳定性好的TaqMan qPCR检测方法,为E.necatrix EnYS株的安全性评估及临床应用提供技术支持。

基于核酸适配体的SYBR Green I qPCR法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鲈鱼、鳗鲡等多种水产养殖动物,是水产养殖中的重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体间较强的亲和特异性,通过核酸适配体来识别、结合鳗弧菌,然后以结合的核酸适配体为模板,进行SYBR Green I实时荧光定量PCR(qPCR)扩增,通过Ct值来定量检测鳗弧菌的浓度,从而建立了鳗弧菌的适配体-qPCR定量检测方法。从特异性、标准曲线、灵敏度、重复性和应用效果对该方法进行分析,表明该方法具有很强的特异性,能特异性地扩增鳗弧菌,且对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、变形假单胞菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌均无扩增;在10^(3)~10^(11) CFU/L的检测范围内有较好的线性关系,可用于鳗弧菌的定量检测;同时,该方法有较高的灵敏度和稳定性,其最低检测限为10^(3) CFU/L,组内和组间变异系数分别小于0.17%和1.98%;最后采用该方法对鱼体组织样品进行了应用检测,证明了该方法具有较好的可行性和应用性,可用于水产品或食品中鳗弧菌的定量检测。

三重TaqMan qPCR检测呼吸道感染衣原体方法的建立及应用

目的本试验的目的是建立可以快速鉴别诊断呼吸道感染肺炎衣原体(Cpn)、鹦鹉热衣原体(Cps)和沙眼衣原体(Ct)的三重TaqMan qPCR方法,有助于衣原体病的科学防控和指导临床用药,为公共卫生安全提供保障。方法选择Cpn、Cps和Ct特异基因ARGR、ompA和ORF8设计引物,建立标准曲线,优化反应条件和体系,验证方法的灵敏度、重复性;通过单独检测3种衣原体的荧光定量PCR方法验证本研究建立方法的准确性。结果结果显示,所建立的三重TaqMan qPCR方法特异度和重复性好,检测灵敏度分别为45 copy/μL(Cpn)、40 copy/μL(Cps)和43 copy/μL(Ct);利用该方法对600个临床样本进行检测,其检出率与参考方法比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明该方法检测结果可靠。结论本研究建立的检测呼吸道感染衣原体的三重TaqMan qPCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为呼吸道感染衣原体临床诊治和流行病学监控提供有力工具。

副溶血弧菌QsvR ChIP-qPCR方法的建立

目的:建立副溶血弧菌QsvR的染色质免疫共沉淀实时定量PCR(ChIP-qPCR)实验方法。方法:通过热激转化和转化结合将标记2×Flag标签的qsvR片段转入qsvR突变株(ΔqsvR)中,阿拉伯糖诱导表达QsvR-2×Flag蛋白,通过甲醛与基因组DNA进行交联形成2×Flag-QsvR-DNA复合物,将基因组DNA超声裂解为100~1000 bp大小不等的片段,通过特异性抗原抗体反应将蛋白质-DNA复合物沉淀下来,高盐和加热解交联,回收DNA进行qPCR定量DNA,分析副溶血弧菌体内QsvR与靶基因的结合情况。结果:成功构建出实验菌株ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag,以不加阿拉伯糖诱导为对照,经阿拉伯糖诱导菌株的aphA、opaR、exsB和vtrA的免疫共沉淀量明显较高,表明在副溶血弧菌体内QsvR与aphA、opaR、exsB和vtrA具有结合作用。结论:成功建立了副溶血弧菌QsvR的ChIP-qPCR实验方法,可用于原核生物体内蛋白质-DNA相互作用的研究。

直接多重TaqMan qPCR方法快速鉴定褐飞虱属3种飞虱

【目的】褐飞虱(Nilaparvata lugens)是水稻重大害虫,灯光诱捕一直是褐飞虱监测的重要方法。然而,褐飞虱的两个同属近似种伪褐飞虱(N.muiri)和拟褐飞虱(N.bakeri)也具有扑灯行为,常被误判为褐飞虱。针对测报灯下褐飞虱属近似种形态鉴定费时费力、专业技能要求高,伪褐飞虱和拟褐飞虱常被误判为褐飞虱这一问题,拟建立一种褐飞虱属3种飞虱的快速分类鉴定方法。【方法】以条形码基因ITS1为靶标,筛选褐飞虱属通用引物及物种特异性探针,建立并优化直接多重Taqman qPCR检测体系(Direct Multiplex TaqMan quantitative PCR,dmTqPCR),并分析其特异性、灵敏度及实用性。【结果】本研究建立的3种飞虱dmTqPCR检测方法特异性强,可准确区分褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱;灵敏度高,检出限可达10拷贝/反应;大样本检测结果表明,382个样本从样本获取到结果输出的整个过程可在3 h内完成,检出率及准确率均为100%。【结论】本研究建立的褐飞虱属近似种的dmTqPCR鉴定方法可以用于褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱的快速分类鉴定,有利于灯下褐飞虱的精准测报。

qPCR和胶体金试纸条方法检测猫疱疹病毒感染的比较

本研究比较猫疱疹病毒(FHV-1)2种检测方法荧光探针qPCR和胶体金试纸在检测FHV-1时各自的优劣,并以PCR扩增FHV-1特异基因Glycoprotein B序列并测序的方法作为参比方法。采集107份疑似FHV-1感染样本,分别用3种方法进行检测,qPCR方法采用的是冻干型PCR-荧光探针法,胶体金试纸方法采用的是市场成熟产品,参比方法测序结果与GeneBank数据进行比对,确认样本是否为FHV-1。qPCR检出89例FHV-1阳性,18例FHV-1阴性,胶体金试纸条检出51例FHV-1阳性,56例FHV-1阴性,参比方法检出89例阳性,且基因序列比对确认为FHV-1。通过对比实验结果的分析,qPCR方法灵敏度为100%,胶体金试纸条方法灵敏度为57.3%,qPCR检测灵敏度明显优于胶体金试纸。

基于SecA基因的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法的建立及进化分析

为对诺卡氏菌病进行快速早期诊断,建立了鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)TaqMan qPCR检测方法。以鰤鱼诺卡氏菌的管家基因SecA为靶标设计引物和探针,对反应条件进行优化,制作标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性测试,并将建立的方法应用于临床样品的检测。结果表明,优化后,引物和探针终浓度分别为0.3和0.1μmol/L,退火延伸温度60℃时,qPCR在9.85×1010—9.85×100copies内呈良好的线性关系,灵敏度最高达9.85 copies;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于1%;特异性结果表明,对无乳链球菌、弗氏柠檬酸杆菌和维氏气单胞菌等13种病菌均无扩增曲线;临床对42份大口黑鲈样品进行检测,结果表明,qPCR检出率比普通PCR提高14.24%;对发病大口黑鲈的组织及结节部位检测显示,结节部位菌载量大幅高于非结节部位,最高相差1000倍;SecA基因分析结果显示,SecA基因在传代中和种内高度保守,种间具有一定的离散性,是个很好的用于诺卡氏菌种鉴定的靶基因。研究建立的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于对鰤鱼诺卡氏菌病的早期诊断和定量检测,为诺卡氏菌病的早诊断早治疗提供了有效手段。

基于转录组测序和RT-qPCR技术的烟草糖酯合成基因挖掘

为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个下调表达基因;上调表达基因主要包括生物学进程(2265个)、分子功能(1169个)、细胞成分(363个)3大类,可将基因序列定位到122条代谢通路中,其中与糖酯合成相关的糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成被高度富集,腺毛细胞中酰基糖通路显著上调,有12个基因在功能上与酰基转移酶有关;在腺毛细胞中,分析得到的12个基因中有11个基因的表达量都高于叶细胞,其中gene63826、gene16194和gene37511表达分别上调195.79倍、166.23倍和132.65倍。上述11个基因可能参与调控腺毛细胞合成糖酯,为下一步验证基因功能提供依据。

用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白(YWHAZ)、β-肌动蛋白(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)8个候选内参基因,选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪,进行三元杂交生产的商品猪(DLY),长白、约克猪进行二元杂交的商品猪(LY),成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性,但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因,该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。

非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。