液体培养法与qPCR法对检测猪鼻支原体灵敏度比较

为了比较《中国药典》已收录但相当耗时的液体培养法和未收录但相对快速的荧光定量PCR(qPCR)法对支原体检测的灵敏度,试验分别在猪鼻支原体生长的对数期(48 h)、稳定期(96 h)和衰亡期(144 h)取样,将样品10倍系列稀释后,使用液体培养法和qPCR法对各个稀释度进行检测(两种方法的样品加入体积分别为0.5 mL和5μL),以比较二者的灵敏度。结果显示:在存活支原体占比高的对数期和稳定期,液体培养法比qPCR法的检测灵敏度高约100倍;而在死亡支原体占比大幅增加的衰亡期,结果则相反,qPCR法反而比液体培养法的检测灵敏度高约1 000倍。当把对数期样品高速离心浓缩约100倍后再用qPCR法检测,其检测灵敏度比浓缩之前提高了约100倍。上述结果表明:影响液体培养法和qPCR法相对灵敏度的主要因素是各自体系中不同的样品加入体积和样品中存活支原体的比例,而由于前一因素导致的两种方法灵敏度的差异,可以通过高速离心浓缩的方法缩小,使两种方法的相对灵敏度基本相同。

基于ARMS-qPCR技术检测 SLC25A13基因c.2T>C突变方法的建立及临床验证

建立一种基于荧光定量PCR的扩增阻滞突变系统方法(amplification-refractory mutation system quantitative real-time PCR,ARMS-qPCR)检测 SLC25A13基因c.2T>C突变并验证其诊断性能。根据ARMS-qPCR引物设计原则,针对 SLC25A13的保守序列设计特异性引物,利用人工合成纯合突变型质粒及200份已测序验证的人外周血核酸样本建立 SLC25A13基因c.2T>C突变ARMS-qPCR检测体系及其Sanger测序体系,并应用提取自另外其他200份人外周血的核酸样本验证此体系的诊断效能,所获结果与作为金标准的Sanger测序结果对比,分析2种检测方法的一致性。结果显示,本研究建立的ARMS-qPCR体系可准确区分 SLC25A13基因野生型及携带c.2T>C突变型;利用该方法检测人外周血中 SLC25A13 c.2T>C突变状态,其检测结果与Sanger测序结果一致性为100%。200份外周血样本中,携带 SLC25A13基因c.2T>C突变8份(4%),非携带者192份(96%)。综上,本研究建立的ARMS-qPCR测试能够快速、准确地检测 SLC25A13基因c.2T>C突变,有助于希特林蛋白缺陷病(citrin deficiency,CD)的诊断。

空气净化装置病毒净化效率试验中病毒滴度测定方法比较

目的比较3种不同病毒滴度测定方法在通风系统用空气净化装置病毒净化效率试验中的适用性。方法采用气溶胶染菌,分别使用噬斑法、定量聚合酶链反应法(qPCR)和结合细胞培养的qPCR法(ICC-qPCR)3种病毒滴度测定方法,对5款不同类型空气净化装置的一次净化效率进行对比。结果高压静电净化装置、初效过滤器、中效过滤器的净化效率,3种方法检测结果无统计学差异(P>0.01);紫外线净化装置和高效过滤器的净化效率,qPCR法的检测灵敏性高于与其他2种方法(P<0.01),ICC-qPCR法耗时最短(约5 h),重复性好,RSD值小于其他2种方法,最低为0.01%。结论ICC-qPCR法适用范围广、用时短、结果稳定性高,适用于通风系统用净化装置病毒净化效率的评价。

洋葱伯克霍尔德菌群3种检测方法的比较

目的通过对环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、基于聚合酶链式扩增(polymerase chain reaction,PCR)的SYTO 9染料法及TaqMan探针实时荧光定量PCR法(简称TaqMan探针法)3种检测方法的比较,旨在建立一种能够快速、准确检测24株洋葱伯克霍尔德菌群的PCR方法。方法根据NCBI数据库中24株洋葱伯克霍尔德菌的分子生物学信息,筛选出洋葱伯克霍尔德菌所特有的多个候选序列片段,设计能同时检出24株洋葱伯克霍尔德菌的特异性引物和探针,同时探索了LAMP法、基于PCR的SYTO 9染料法及Taqman探针法3种检测方法,优化筛选出最佳退火温度,并采用39株实验菌株对洋葱伯克霍尔德菌群检测方法开展了验证研究。结果采用LAMP法无法实现对洋葱伯克霍尔德菌群的有效检出,采用SYTO 9染料法和TaqMan探针法可以实现对20多株洋葱伯克霍尔德菌群的有效检出,而TaqMan探针法扩增效率更高,检测灵敏度、重复性、稳定性更好,能够满足本研究的要求。结论本研究建立了洋葱伯克霍尔德菌群的TaqMan探针快速检测方法,相较于LAMP法和SYTO 9染料法,该方法具有快速、简便和敏感性高等优点,为洋葱伯克霍尔德菌群的快速检测提供了技术支持。

抗生素诱导的微生物组耗损后促进空肠弯曲菌在小鼠肠道定植

目的通过抗生素诱导肠道微生物组耗损建立一种空肠弯曲菌在C57BL/6小鼠肠道定植的方法。方法将36只C57BL/6小鼠分为正常组、对照组及实验组,头孢哌酮钠舒巴坦钠(50 mg/mL)连续灌胃2 d后,灌胃空肠弯曲菌200μL,在建模后第1~3天,收集肠道内容物进行16S rDNA法分析细菌多样性,收集建模后1~7 d的动物粪便,探针法qPCR检测粪便空肠弯曲菌HipO基因,取建模后第1~3天及第7天小鼠肠道组织,免疫荧光法检测肠弯曲菌定植,HE染色观察病理学改变。结果建模后实验组回肠的乳酸杆菌属、盲肠及结肠的拟杆菌属被抑制,肠球菌属相对丰度较高,第1天实验组检测到较高丰度的弯曲菌属。在建模后第1~3天,实验组动物粪便中能检测到较高拷贝数的空肠弯曲菌,肠道管腔内可见明显的免疫荧光标记的空肠弯曲菌,而肠道黏膜基本完整,未见明显的炎症细胞浸润。结论经头孢哌酮钠舒巴坦钠诱导的微生物组耗损后能促进空肠弯曲菌在小鼠肠道内的短期定植。

基于无性期18S rDNA特异性引物检测5种疟原虫qPCR的建立和应用

目的建立基于疟原虫无性期(A期)18S rDNA检测感染人的5种疟原虫的qPCR,并评价其检测效果。方法从GenBank中下载5种疟原虫A期、子饱子期(S期)、卵囊期(O期)和人的18S rDNA序列进行比对,划分保守区和变异区,在保守区设计疟原虫属特异性引物,在变异区设计种特异性引物。以5种疟原虫DNA、田鼠巴贝虫和婴儿利什曼原虫DNA为模板进行qPCR扩增,筛选特异性引物对。应用qPCR法筛选特异性引物对的最佳退火延伸温度和引物浓度。分别构建5种原虫A期18S rDNA短片段(筛选出的引物对扩增产物)和长片段(属特异性引物扩增产物)质粒,以连续浓度梯度的短片段质粒DNA[(5×10^(1))~(5×10^(8))拷贝/μl]、长片段质粒DNA[(5×10^(4))~(5×10^(9))拷贝/μl]为模板分别进行qPCR扩增,测定筛选出的引物对的扩增效率、最低检出限[包括最低质粒浓度、循环数阈值(Ct值)、变异系数]、无扩增时非目标DNA的最高浓度、可检出的混合DNA中不同虫种间的最大拷贝浓度比值。以5倍稀释的18份疟原虫血样DNA[恶性疟原虫(Pf)6份、间日疟原虫(Pv)6份、卵形疟原虫(Po)4份、三日疟原虫(Pm)2份、诺氏疟原虫(Pk)1份]为模板,应用筛选出的特异性引物分别进行qPCR、一步反转录qPCR和巢式PCR扩增,计算最低检出限时的原虫密度。用筛选出的特异性引物进行应用验证,对70份疟疾患者血样DNA(Pf 26份、Pv 14份、Pm 14份、Po 9份、Pk 3份、混合感染4份)、65份疟原虫阴性人血样DNA以及阿米巴(1份)、田鼠巴贝虫(1份)和杜氏利什曼原虫DNA(3份)进行qPCR扩增,以样品提供者的检测结果为标准,计算qPCR检测的敏感度、特异度、符合率。不同PCR方法检测结果的比较采用卡方检验、t检验、Mann-Whitney检验或Wilcoxon秩和检验。结果序列比对结果显示,5种疟原虫A期18S rDNA序列的一致性为89.3%~96.7%,高于S期的60.0%~92.1%,可分为9个保守区和8个变异区。除Pv O期和Pm S期18S rDNA外,保守区序列长度相同,一致性≥92%。筛选获得1对属特异性引物和5对种特异性引物,各引物对的qPCR扩增效率为90.6%~98.8%,qPCR扩增的最佳退火延伸温度为57.8℃,最佳引物终浓度为0.3μmol/L。6对特异性引物的qPCR检出的最低质粒浓度均为5×102拷贝/μl,对应Ct值为32.3~33.1,变异系数为0.5%~3.7%。5对种特异性引物qPCR扩增非目标DNA结果均为阴性时非目标DNA的最高浓度为(5×10^(6))~(5×10^(8))拷贝/μl,可检出的混合质粒中不同虫种间的最大拷贝浓度比值均为104。一步反转录qPCR、qPCR和巢式PCR可检出的最低原虫密度平均值分别为(4.1±5.1)、(6.0±4.3)和(8.2±2.9)虫/μl血,最低值分别为0.01、0.3和2.0虫/μl血,变异系数分别为125.6%、72.2%和35.8%,一步反转录qPCR检出最低原虫密度的敏感性高于另两种方法(Wilcoxon秩和检验,Z=-2.0、-2.0,均P<0.05),qPCR和巢式PCR的敏感性差异无统计学意义(t=-1.7,P>0.05)。应用验证结果显示,qPCR的敏感度和特异度均为98.6%,qPCR检测结果与标准结果的符合率为98.6%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.0,P>0.05)。结论建立了基于疟原虫A期18S rDNA的qPCR检测系统,可用于鉴定常规疟疾血样。