人CD80-Linker-SEA重组毒素的设计及生物学特性预测

目的 :构建人重组CD80 Linker SEA毒素的真核表达载体并预测Linker的合理性和可行性。方法 :应用核酸和蛋白质序列分析软件GolgKey对融合基因及Linker部位翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性 ,诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测。结果 :CD80 Linker SEA融合基因的氨基酸序列经软件分析 ,并分别与CD80和SEA单独的分析结果相比较 ,发现在二级结构的水平未出现新的抗原性 ,同时在Linker部位具有很低的抗原性 ,亲水性没有改变 ,Linker部位呈中性 ,CD80和SEA具有原来各自的表位特征 ,无新的表位出现。结论 :本研究通过计算机软件对CD80 Linker SEA融合蛋白的预测 ,并与CD80、SEA各加以对比分析和比较 ,以利于在重组过程中有一个合理的设计 。

SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞体外诱导脐血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:常规分离4例脐带血单核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48 h后收集各组细胞提取mRNA并合成cD-NA,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算TCRζ链表达差异倍数。结果:抗CD3单抗组、K562细胞组、SEA组、SEA联合K562细胞组诱导培养T细胞中TCRζ链表达差异倍数分别是(4.52±0.96)、(1.65±0.26)、(1.43±0.44)、(3.41±0.30),表明各组均有活化T细胞的作用,但各组TCRζ链表达水平有差异,其中SEA联合k562细胞组的T细胞ζ链基因表达均明显高于单纯k562组及单纯SEA组(P<0.01)。结论:超抗原SEA有助于增强K562细胞体外诱导T细胞活化作用。

BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒。方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒。将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达。结果:成功扩增出BCR/ABL和SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白。结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白。

小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定

目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。

超抗原SEA对K562细胞诱导脐带血单个核细胞上CD3ε链表达的影响

目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞诱导正常人脐带血单个核细胞(MNCs)中CD3ε链基因表达的影响。方法:常规分离4例脐带血单个核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体(mAb)、单纯K562细胞、单纯SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导MNCs活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48 h后,收集各组细胞提取mRNA并合成cDNA,以β2微球蛋白基因作为内参照,采用实时荧光定量PCR检测在各组MNCs中CD3ε链基因的表达,并根据公式2-△△C t对CD3ε链表达的差异倍数进行相对定量分析。结果:K562细胞组MNCs中CD3ε链基因表达的水平略有降低,抗CD3 mAb组、SEA组、SEA联合K562细胞组的诱导活化的MNCs中CD3ε链基因的表达均有增强,而SEA联合K562细胞组MNCs中CD3ε链基因的表达明显高于单纯SEA组(P<0.01)。结论:超抗原SEA可以增加K562细胞在体外诱导脐带血MNCs中CD3ε链基因的表达。

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA)。分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR G reenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-△△C t分析TCRζ链表达差异。结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降。结论:超抗原SEA联合PML-RARα多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点。

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。

超抗原分子SEA在肝癌细胞的表达和HLA-Ⅰ分子递呈

目的 将超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcalenterotoxinA ,SEA)分子转入肝癌细胞以增强其免疫原性 ,开辟肝癌免疫排斥的新途径。方法 从产SEA标准菌株中获得SEA基因全长片段 ,构建SEA逆转录真核表达载体 ,通过病毒包装和滴度测定 ,最后转导肝癌细胞 ,并进行T细胞杀伤实验 ,同时利用抗体阻断的方法研究递呈途径。结果 成功的获得了表达SEA人肝癌细胞株HHCSEA。结果显示微量表达的SEA蛋白即可引发高效的免疫活性。将细胞表面的HLA I分子利用抗体阻断后 ,杀伤活性明显降低。结论 肝癌细胞表达的SEA分子具有较高的免疫激活能力 ,且有可能主要通过HLA Ⅰ分子递呈。

应用ELISA和ELFA定量检测牛奶中葡萄球菌肠毒素A方法的建立

探讨了Tecra SEs SET(ELISA法)和Vidas SET2(ELFA法)两种葡萄球菌肠毒素定性检测试剂盒用于定量检测牛奶中葡萄球菌肠毒素A(SEA)的可行性。根据GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求,对两种方法应用于定量检测时的检出限、校正曲线范围、相关系数和加标回收率指标进行了分析比较。实验结果显示,Tecra SEs SET对牛奶中SEA的检出限为0.79 ng/mL,校正曲线范围为0.79~10 ng/mL,相关系数r=0.997,SEA加标浓度为0.80、2.5和10 ng/mL时的回收率分别为110%、81%和100%。Vidas SET2的检出限为0.09 ng/mL,校正曲线范围为0.09~1.0 ng/mL,相关系数r=0.998,SEA加标浓度为0.1、0.25和1.0 ng/mL时的回收率分别为90%、95%和104%。上述结果结合对阳性样品的检测表明:这两种定性检测试剂盒能满足牛奶中SEA定量检测的要求。

肺癌可溶性抗原联合超抗原修饰致敏DC诱导抗瘤免疫的研究

目的观察经肺癌肿瘤可溶性抗原(TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合修饰致敏树突状细胞(DC)体外诱导抗肺癌的免疫效应。方法3mol/L氯化钾提取法获得人肺癌细胞GLC-82的可溶性抗原;从人外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增DC,并用流式细胞仪(FCM)检测表型;以肺癌TSA和SEA联合修饰致敏的DC、单纯肺癌抗原致敏的DC和未经抗原修饰的DC分别与同种异体外周血T淋巴细胞共同孵育,刺激T淋巴细胞活化增殖(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、DCL),直接活细胞计数法观察增殖倍数;MTT法检测不同DC:T淋巴细胞比例的效应细胞对靶细胞GLC-82的体外杀伤效应。结果诱导出高表达CD1a、CD80、HLA-DR的DC,光镜下具有典型的DC特性;联合抗原修饰后的DC具有较强的免疫刺激活性,少量致敏DC即可强烈激发T细胞的增殖;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL及DCL;联合抗原修饰的DC以1:100与T淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强。结论经肺癌TSA和SEA联合修饰致敏的DC可强烈激发同种异体T淋巴细胞活化增殖;肺癌TSA联合超抗原SEA诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效杀伤作用,经肺癌TSA与超抗原SEA联合修饰DC的活性明显强于单用肺癌TSA。

葡萄球菌肠毒素A诱导小鼠体内T细胞无能过程中CD28/CTLA-4的变化

目的在葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导小鼠体内T细胞无能的过程中,观察CD28和CTLA-4的变化规律及相互关系。方法单次(1×SEA组,n=4)或多次(2×SEA组,n=4;3×SEA组,n=4)向小鼠腹腔注射SEA,每次注射间隔3d,分别于末次注射后的第1、3、7、14天,将小鼠处死,制备小鼠脾淋巴细胞。通过流式细胞仪检测细胞膜表达CD28和CTLA-4、细胞内表达CTLA-4和IL-2的阳性率。结果1×SEA组,细胞膜CD28和细胞内IL-2的表达显著上升;而CTLA-4在细胞内和细胞膜表面的表达均降低且无明显变化;2×SEA组CD28和IL-2的表达稍有上升;CTLA-4在细胞内和细胞膜表面的表达均明显增加,胞内CTLA-4的增加尤为显著。3×SEA组,细胞膜CD28、细胞膜和细胞内CTLA-4的表达呈下降趋势,细胞内IL-2在第7天已经检测不到。结论SEA初次诱导小鼠脾淋巴细胞时,能显著促进T细胞的活化;经SEA多次(3次)刺激可诱导T细胞的无反应性。在无能的形成过程中,IL-2产生减少与CD28表达下调可能有着密切联系;CTLA-4的表达上调有利于无能的诱导,但可能不参与无能的维持。

单克隆抗体与葡萄球菌肠毒素A结合物的制备及其抗肝癌作用

目的制备超抗原(SAg)葡萄球菌肠毒素A(SEA)与抗人原发性肝细胞癌(简称肝癌)单克隆抗体(McAb)HAb18F(ab')2段的结合物,探讨其介导外周血单个核细胞(PBMC)的抗人肝癌作用.方法制备McAbHAb18,并用木瓜蛋白酶消化法制备其F(ab')2段.再用化学连接剂N-琥珀酰亚氨基-3-(2-二硫吡啶)丙酸酯(SPDP)制备HAb18F(ab')2-SEA结合物.结合物经快速蛋白质液相层析系统用凝胶色谱柱纯化后,用SDS-PAGE鉴定各收集峰.免疫组化ABC法鉴定结合物的抗体活性.MTT法鉴定结合物活化PBMC的活性及其介导PBMC的杀伤肝癌细胞作用.结果制备的HAb18F(ab')2-SEA结合物具有肝癌抗体活性和活化PBMC的功能.此结合物具有明显的介导PBMC杀伤肝癌细胞的作用,并与其浓度呈正相关.结论 SPDP是一种很好的蛋白质交联剂.HAb18 F(ab')2-SEA结合物导向治疗肝癌具有一定的发展前景.

葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定(英文)

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法 采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC135 6 5菌株中扩增全长SEA ,目的扩增片段T -A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒 pUCm -T -SEA获得的 pUCm -T -SEA基因片段与真核表达载体 pPIC9K连接。采用电融合法将重组真核载体pPIC9K -SEA转化入P pastorisGS115株 ,构建成真核表达系统 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。采用含G4 18抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。 0 5 % (V∶V)甲醇诱导下 ,采用SDS -PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况。结果 可从S aureusATCC135 6 5株DNA中扩增获得SEA目的片段。与报道的SEA基因序列 (GenBankNo :AP0 0 4 82 8andL2 2 5 6 6 )比较 ,所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。在甲醇的诱导下 ,pPIC9K -SEA -P pastorisGS115能表达在SDS -PAGE图谱位于预期位置的rSEA。结论 我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统 ,为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。

乳糖诱导葡萄球菌肠毒素A基因在大肠杆菌中的表达

以乳糖作为诱导剂代替传统方法中的IPTG,分别从菌龄、诱导剂浓度、诱导时间及诱导剂的添加方式等方面,对乳糖诱导金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达进行了研究。结果表明,重组大肠杆菌表达SEA的优化条件为:在对数生长期(OD600约为0.6),一次性添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖诱导6 h。目标蛋白的表达量占菌体总蛋白质的36.9%,略低于以IPTG为诱导剂时38.1%的表达量。乳糖价格仅为IPTG的1%左右,因此,在SEA的大规模制备中,使用乳糖作为诱导剂可以大大节约成本。

金黄色葡萄球菌肠毒素A对H22小鼠移植瘤的抑制作用

旨在探讨金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)在KM鼠体内的抑瘤效果。建立H22荷瘤小鼠模型,将20只小鼠随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(15μg/ml)、中剂量组(25μg/ml)和高剂量组(50μg/ml),观察肿瘤生长趋势,计算抑瘤率,通过ELISA检测IL-2的含量。结果显示,给药组肿瘤生长趋势均较对照组缓慢;对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的抑瘤率分别为0,28.9%,34.0%,51.0%(P<0.05);血清中IL-2含量分别为58.9pg/ml、83.6pg/ml、91.8pg/ml、118.1pg/ml。金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)可抑制H22肿瘤的生长,并上调IL-2的分泌。

金黄色葡萄球菌肠毒素A诱导的S180肉瘤细胞凋亡分析

分析了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导的S180肉瘤细胞凋亡。将S180肉瘤细胞接种于小鼠腋下,建立小鼠肿瘤模型,随机分为2组,即SEA实验组和生理盐水对照组,隔日进行腹腔注射,九天后解剖,将肿瘤组织做成石蜡切片。用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)检测S180肉瘤细胞凋亡,并用免疫组化方法观察CD8+T细胞和颗粒酶B的分布,最后用ELISA法检测血清、脾脏中TNF-α的含量。SEA组的凋亡指数明显大于对照组,SEA组肿瘤组织周围的CD8+T细胞、颗粒酶B明显多于对照组,且血清、脾脏中TNF-α的含量也高于对照组。SEA诱导S180细胞凋亡与颗粒酶B和TNF-α的分泌有关。

BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在BALB/c小鼠肌肉表达分析

检测BCR-ABL-pIRES-SEA重组基因疫苗在小鼠肌肉中的表达。用已构建BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒免疫BALB/c小鼠一侧后肢骨骼肌,每两周一次,每次注射200μg,第七周取材用RT-PCR及免疫组织化学染色法检测目的基因在注射部位肌肉中转录和表达。结果发现:实验小鼠骨骼肌内检测到BCR-ABL和金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的转录,以及BCR-ABL蛋白的表达,证明所构建的BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在小鼠体内可以有效地表达基因产物。

口蹄疫病毒三价复合多表位佐剂DNA疫苗构建及其免疫原性

以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,在此基础上,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)为基因佐剂,通过分子设计构建了SEA与OAAT融合表达基因。将构建好的表达盒OAAT与SEA融合表达基因克隆至真核表达载体PVAX1PCMV启动子下游,构建了口蹄疫三价基因佐剂DNA疫苗pEA。经Western blotting和IFA检测,目的蛋白在Hela细胞中获得正确表达。小鼠免疫实验表明,pA和pEA免疫组的血清抗体均能分别与O型、A型和AsiaI抗原反应,与对照组相比差异较显著,且pEA免疫组和灭活疫苗免疫组抗体水平均显著高于pA免疫组;同时pA和pEA免疫小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10较对照组显著提高,且pEA免疫组的IL-2、IFN-γ和IL-4水平明显高于pA免疫组。用O/NY00和Asia1/YNBS/58株FMDV进行豚鼠攻毒免疫保护试验,结果表明O型和Asia1型FMDV二联灭活疫苗免疫组均获得完全保护,pA免疫组均获得2/4保护,pEA免疫组均获得3/4保护,而pVAX1和PBS免疫组完全没有保护。实验结果表明,SEA与OAAT融合表达蛋白具有较好免疫原性,且SEA可以作为DNA疫苗的有效基因佐剂。

超抗原刺激Jurkat T细胞的原子力显微镜研究

利用原子力显微镜分别对未加药人急性T淋巴细胞性白血病细胞(Jurkat细胞)和经超抗原刺激不同时间(6,12,48,72h)后的Jurkat细胞进行了细胞全貌和细胞膜表面纳米结构成像和探测研究,并通过比较不同状态下细胞表面的粘附力变化,探讨Jurkat细胞形态变化与粘附行为之间的关系,用CCK-8检测细胞的增殖,以期对Jurkat细胞形态结构和细胞功能之间的关系有进一步的了解。结果发现:与未加药的Jurkat细胞相比,随着超抗原刺激时间的延长,Jurkat细胞的体积、高度、半宽度、粗糙度等参数发生明显的变化;活化48、72h时,细胞与针尖间的相互作用力大约是活化6h时的5倍,活化过程中细胞膜表面纳米结构的改变,引起其机械性能的变化。Jurkat细胞的表面超微结构、细胞膜结构的改变和分化对于更深入地了解T细胞活化与免疫信号的传递,阐明其免疫过程的作用机制具有重要的意义。