2种抗生素对大黄鱼肠道组织及紧密连接蛋白基因表达的影响

为探究盐酸多西环素和恩诺沙星对大黄鱼肠道结构及肠道紧密连接蛋白相关基因表达的影响,在水温16.80~22.50℃下,将体质量(41.57±1.63)g的大黄鱼饲养在直径1 m、水深1.25 m的圆形塑料水槽中,投喂剂量0、0.2、1.0、2.0 g/kg的药饵5~7 d,停药后1、5、15 d,观察肠道组织形态变化,测定紧密连接蛋白基因Claudin-7、ZO-1和Occludin的相对表达量。试验结果显示:大黄鱼摄食2种药物后,肠道均出现肠绒毛萎缩,组织空泡化等病变,随着给药剂量的增加和给药时间的延长,肠道组织损伤程度逐渐加深,紧密连接蛋白基因表达量持续降低;肠黏膜损伤在停药15 d后仍未恢复至对照组水平,药物剂量越高恢复程度越低;与对照组相比,2种药物高剂量组紧密连接蛋白基因表达量在停药15 d后仍显著低于对照组(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05)。试验结果表明,盐酸多西环素和恩诺沙星以剂量时间依赖方式损伤大黄鱼肠道组织,降低肠道通透性,药物剂量越高,恢复周期越长,在15 d后仍未完全恢复。

胰高血糖素样肽-2对断奶仔猪肠上皮紧密连接蛋白相关基因表达的影响

本文旨在研究胰高血糖素样肽-2(GLP-2)对离体培养的断奶仔猪空肠上皮紧密连接蛋白相关基因表达的影响,探讨GLP-2调节肠道黏膜屏障的可能机制。将断奶仔猪空肠组织块置于含0、1×10-8、1×10-7mol/L的GLP-2的细胞培养液中进行培养,考察不同GLP-2添加水平对断奶仔猪空肠上皮丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路细胞外调节蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)、p90核糖体S6蛋白激酶(p90RSK)以及紧密连接蛋白ZO-1、Oc-cludin、Claudin-1基因表达的影响,待确定出GLP-2能有效促进紧密连接蛋白相关基因表达的剂量后,再向培养液中添加MEK1/2的特异性阻断剂U0126,考察阻断MAPK经典通路后紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因表达的变化。结果表明,与对照组相比,将空肠组织块置于含1×10-7和1×10-8mol/L GLP-2的培养液中培养72 h均能显著促进MEK1/2、p90RSK以及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因mRNA相对表达量(P<0.05),除ZO-1的基因之外,上述各蛋白的基因mRNA相对表达量还随着GLP-2浓度的增高而升高(P<0.05);向1×10-7mol/L的GLP-2组添加U0126阻断p90RSK、ERK1/2的基因表达后,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因mRNA相对表达量也显著下降(P<0.05)。由此可知,GLP-2能够促进断奶仔猪空肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因表达,而MAPK通路可能是GLP-2调控肠道紧密连接蛋白基因表达的重要信号通路之一。

Claudin-7—潜在的抑癌基因

目的分析Claudin-7基因敲除后小鼠表型及Claudin-7潜在的抑癌功能。方法将小鼠分为2组,Claudin-7基因敲除组及野生型组,每组各15只,分别采用PCR鉴定小鼠基因型,HE染色观察Claudin-7基因敲除后各脏器的组织病理学变化;免疫共沉淀(CO-IP)检测Claudin-7与intergrinα2相互作用;蛋白印迹技术检测Claudin-7在小鼠不同脏器及C-fos、C-jun、Cox-2蛋白在小鼠肠道中表达,同时检测Claudin-7在人不同分化大肠癌及肝转移组织中的表达情况,分正常人大肠组织、高分化大肠癌组织、低分化大肠癌组织及大肠癌肝转移组织4组,每组20例患者。结果 Claudin-7基因敲除小鼠自出生后第4 d左右停止生长,7 d左右死亡;HE染色以肠道病理变化最为显著,表现为黏膜上皮细胞严重脱落、空泡形成、并有炎性反应细胞浸润,其他脏器病理变化显示除有轻微的中性粒细胞浸润外未见明显的组织损伤;Claudin-7在肠道、胃、肺、膀胱、皮肤、胸腺、肾脏脏器中均有表达,小肠和大肠广泛强表达;Claudin-7和intergrinα2免疫共沉淀,C-fos、C-jun及Cox-2蛋白表达在Claudin-7基因敲除小鼠肠道中显著高表达(P<0.001);Claudin-7蛋白表达随大肠癌的分化降低而降低,在大肠癌肝转移组织中表达显著降低(P<0.001),差异有统计学意义。结论 Claudin-7基因敲除可诱导严重的肠道炎性反应,Claudin-7可能为潜在的抑癌基因。

坐骨神经缺损后神经组织再生早期信号调控研究

目的:采用基因芯片技术结合信号传递调控网络(Signal-Flow)分析技术,探讨坐骨神经缺损近端神经组织早期分子信号调控机理。方法:SD大鼠坐骨神经缺损0h、0.5h、1h、3h、6h和9h后,取0.5cm近端神经组织进行mRNA芯片检测,进行差异基因的筛选和信号传递调控网络分析,并采用qRT-PCR对相关基因行表达趋势验证。结果:共筛选差异显著性基因2850个,抗凋亡相关因子和紧密连接蛋白等构成信号传递调控网络的核心部分。Birc2、Birc3和Tnfrsf1a早期上调抑制凋亡相关基因,紧密连接蛋白cldn14促进与其家族成员的结合。结论:抗凋亡因子和紧密连接蛋白可能是坐骨神经缺损后神经组织再生的内在早期调控分子,推测与神经组织损伤后内在的再生能力调控机制相关。

以LPS构建IPEC1细胞损伤模型及相关指标的测定

本试验旨在研究脂多糖(LPS)刺激对猪肠上皮细胞系(IPEC1)细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、紧密连接蛋白和炎症相关基因表达的影响。分别选取0、0.025、1、10μg/m L的LPS刺激细胞1、2、4、8 h,检测相关指标。结果表明:在不同时间,不同浓度的LPS对细胞活力的影响未呈现出显著的规律性;与0、0.025μg/m L LPS组相比,在1、4、8h,1、10μg/mLLPS处理导致IPEC1上清液LDH活性显著升高;在不同时间,不同浓度的LPS对紧密连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1)和炎症相关基因(TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6)mRNA表达影响未呈现出显著的规律性。以上结果表明,LPS刺激能引起IPEC1细胞损伤,但不能诱导显著的炎症反应。

肿瘤坏死因子-α刺激对IPEC-1细胞活力、物理屏障以及炎症相关基因表达的影响

本试验探讨了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激对IPEC-1细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、紧密连接蛋白和炎症相关基因表达的影响。分别选取0(对照组)、10、20、40、50 ng/mL的TNF-α刺激IPEC-1细胞12、24、48 h,检测相关指标。结果表明:1)与对照组相比,当刺激时间为24 h时,不同浓度的TNF-α均导致细胞活力显著下降(P<0.05);当刺激时间为48 h时,40和50 ng/mL的TNF-α导致细胞活力显著下降(P<0.05)。2)与对照组相比,当刺激时间为24和48 h时,40和50 ng/mL的TNF-α导致LDH活性显著升高(P<0.05)。3)与对照组相比,当刺激时间为24 h时,40和50 ng/mL的TNF-α导致IPEC-1细胞紧密连接蛋白闭合小环蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白-1(Claudin-1)、咬合蛋白(Occludin)的mRNA表达量显著上升(P<0.05);当刺激时间为48 h时,不同浓度的TNF-α对Claudin-1蛋白表达量无显著影响(P>0.05)。4)与对照组相比,当刺激时间为24和48 h时,不同浓度的TNF-α均导致TNF-α和白细胞介素-8(IL-8)的mRNA表达量显著上升(P<0.05),并呈时间和剂量依赖关系。以上结果表明,TNF-α刺激诱导了IPEC-1细胞的炎症反应,引起了IPEC-1细胞损伤。综合考虑各指标,可采用40 ng/mL TNF-α刺激IPEC-1细胞48 h构建IPEC-1细胞损伤模型。

Occludin基因在猪肠道屏障中的研究进展

紧密连接蛋白与肠道疾病密切相关,由Occludin基因编码的蛋白质是紧密连接蛋白中具有代表性的蛋白之一,在维持肠道屏障功能完整中发挥重要作用。在猪肠道中,Occludin基因表达的下降会导致细胞膜通透性增加,使肠道屏障功能受损,从而引发多种肠道疾病。文章综述了肠道屏障的构成、紧密连接蛋白的分类及Occludin基因编码蛋白质的结构和生物学功能,介绍了Occludin基因在猪肠道中的表达情况和营养调控的研究进展,为预防猪腹泻、肠道炎症等疾病提供参考。

Claudin-7可诱导性条件性基因敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的:应用Cre-Loxp系统构建Claudin-7蛋白在肠道可诱导性条件性基因敲除小鼠模型,并进行表型分析.方法:构建Claudin-7打靶载体,通过电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定和Southern鉴定,利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL/6N小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫以获得嵌合体小鼠.将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6N小鼠交配获得Claudin-7-flox小鼠,该小鼠与PvillinCre ERT2转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Claudin-7在肠道可诱导性条件性基因敲除(Cldn7fl/fl Villin-Cre ERT2)的小鼠,他莫昔芬(tamoxifen)药物诱导肠道Claudin-7基因敲除,对小鼠进行表型分析.结果:获得Claudin-7-flox小鼠及Claudin-7肠道可诱导性条件性基因敲除小鼠数只,Claudin-7肠道可诱导性条件性基因敲除小鼠出生时表型正常,发育良好,他莫昔芬(tamoxifen)药物应用后,诱导了小鼠肠道上皮细胞Claudin-7基因表达的缺失.小鼠出现脱水表现,活泼度降低,并出现死亡.结论:成功构建了Claudin-7肠道可诱导性条件性基因敲除小鼠模型,利用他莫昔芬诱导肠道Claudin-7基因敲除,初步构建了肠道炎症模型,为进一步研究Claudin-7在肠道肿瘤中的作用奠定了基础.

茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育、抗氧化功能和紧密连接蛋白基因mRNA表达的影响

试验旨在探究饲粮添加茶多酚对乳鸽十二指肠形态发育、抗氧化功能及紧密连接蛋白基因mRNA表达量的影响,为茶多酚作为功能性饲料添加剂在养鸽生产中的合理应用提供理论依据。选取初始体重一致、健康1日龄仔鸽240只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复10只仔鸽。对照组饲喂基础饲粮,茶多酚低、中、高剂量组分别在基础饲粮中添加100、200和400 mg·kg^(-1)茶多酚,试验期28 d。试验结束后,采集乳鸽十二指肠组织进行肠道形态发育、抗氧化功能以及紧密连接蛋白基因表达测定。结果表明,与对照组相比,中剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)、提高绒隐比(VH/CD)(P<0.01),高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠绒毛高度和隐窝深度(P<0.01);低剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠丙二醛(MDA)含量(P<0.01),中剂量茶多酚极显著降低乳鸽十二指肠MDA含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.01),高剂量茶多酚极显著提高乳鸽十二指肠总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低MDA含量和LDH活性(P<0.01),3个剂量茶多酚均极显著提高SOD2基因mRNA表达量(P<0.01),高剂量茶多酚还极显著提高过氧化氢酶(CAT)基因mRNA表达量(P<0.01);此外,低剂量茶多酚极显著提高Occludin、降低Claudin-2 mRNA表达量(P<0.01),中剂量茶多酚极显著提高Occludin和ZO-1并降低Claudin-2 mRNA表达量,高剂量茶多酚极显著提高Occludin和ZO-1基因mRNA表达量,显著提高Claudin-3基因mRNA表达量(P<0.05)并极显著降低Claudin-2 mRNA表达量(P<0.01)。综上所述,饲粮添加茶多酚可以通过改善乳鸽十二指肠肠道发育、提高肠道抗氧化能力和调节肠道紧密连接蛋白相关基因mRNA表达量进而维持乳鸽肠道健康。

槲皮素对仔猪生长性能、肠道抗氧化及免疫相关基因表达的影响

【目的】通过分析不同含量槲皮素对仔猪生长性能、肠道抗氧化指标、炎症细胞因子分泌及紧密连接蛋白基因表达的影响,探究槲皮素在改善仔猪应激综合征的作用。【方法】选取216头健康、初始体质量为(9.5±0.5)kg(杜×长×大)仔猪,随机分为3组(对照组、试验1组和试验2组),分别饲喂基础日粮、基础日粮+200 mg·kg^(-1)槲皮素日粮和基础日粮+400 mg·kg^(-1)槲皮素日粮,每组6个重复,每个重复12头仔猪(公、母各6头),试验期为15 d。【结果】1)与对照组相比,试验1组和试验2组均提高了仔猪平均日增重,显著降低了腹泻率。2)与对照组相比,试验1组和试验2组显著提高了仔猪空肠黏膜谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,显著降低脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。其中,GPx、SOD和CAT活性随着槲皮素添加含量提高而显著增加。3)与对照组相比,试验1组和试验2组显著降低了空肠黏膜中白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,显著提高了白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)水平;与其他组相比,试验2组分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平显著增加。4)与对照组相比,试验1组和试验2组显著提高了仔猪空肠黏膜中紧密连接蛋白基因Claudin-1、Occludin和ZO-2mRNA相对表达量,并且试验2组显著提高了ZO-1 mRNA相对表达量;与试验1组相比,试验2组显著提高仔猪空肠黏膜中紧密连接蛋白基因Claudin-1和Occludin mRNA相对表达量。【结论】日粮添加槲皮素可以降低断奶后仔猪腹泻率,改善生长性能,增强肠道抗氧化功能,提高抗炎因子分泌,抑制促炎因子分泌,促进肠道紧密连接蛋白相关基因表达。

饲粮添加茶多酚对马岗鹅空肠组织形态、抗氧化能力及紧密连接蛋白相关基因表达的影响

本试验旨在探究饲粮中添加茶多酚(TP)对70日龄马岗鹅肠道组织形态、抗氧化能力及紧密连接蛋白相关基因表达的影响。试验选取体重基本一致、健康的28日龄马岗鹅240只(公母各占1/2),随机分为4组,分别饲喂添加0(对照)、100(低剂量)、500(中剂量)和1000 mg/kg(高剂量)茶多酚(纯度为98.7%)的试验饲粮,每组6个重复,每个重复10只。预试期1周,正试期5周。结果表明:1)与对照组相比,饲粮添加500 mg/kg茶多酚显著提高马岗鹅空肠绒毛高度(P<0.05);饲粮添加100和500 mg/kg茶多酚显著降低空肠隐窝深度(P<0.05),并显著提高空肠绒隐比(V/C)(P<0.05)。2)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚显著提高空肠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)活性(P<0.05);饲粮添加100和500 mg/kg茶多酚显著降低空肠丙二醛(MDA)含量(P<0.05);各添加剂量茶多酚均显著降低空肠乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚均显著提高空肠与抗氧化能力相关基因超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、GPX2和血红素氧合酶-1(HO-1)的mRNA相对表达量(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮添加500和1000 mg/kg茶多酚显著提高空肠紧密连接蛋白相关基因闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白-5(Claudin-5)和咬合蛋白(Occludin)的mRNA相对表达量(P<0.05);各添加剂量茶多酚均显著提高空肠E钙黏连蛋白(E-cadherin)的mRNA相对表达量(P<0.05)。由此可见,饲粮添加一定剂量的茶多酚可以促进马岗鹅空肠的形态发育,提高空肠的抗氧化能力以及肠壁紧密连接的程度。综合考虑,在70日龄马岗鹅饲粮中茶多酚的推荐添加量为500 mg/kg。

珍珠龙胆石斑鱼紧密连接蛋白基因Claudin-3与Claudin-12的克隆及精氨酸干预下的肠道表达

为评价Claudin-3与Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂生长和肠道黏膜屏障中的作用,通过同源克隆及RACE PCR技术克隆珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3和Claudin-12基因的全长,采用qRT-PCR技术分析Claudin-3和Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼脑、鳃、皮肤、肌肉、肝脏、胃、前肠、中肠、后肠、头肾、体肾、脾和心脏13种组织的表达情况,并通过饲料精氨酸干预评估上述两个基因在肠道的表达情况。结果表明:Claudin-3 cDNA全长序列为1544 bp,包括一个153 bp的5′末端非翻译区(UTR)和743 bp的3′UTR,Claudin-3的开放阅读框(ORF)为648 bp,可编码215个氨基酸的蛋白,预测该蛋白相对分子质量为23100;Claudin-12 cDNA全长序列为1236 bp,包括一个118 bp的5′UTR和92 bp的3′UTR,Claudin-12的ORF为1026 bp,可编码341个氨基酸的蛋白,预测该蛋白相对分子质量为37400;系统进化树和氨基酸序列比对显示,珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3与斜带石斑鱼亲缘关系最近,同源性最高,一致性高达98.14%,珍珠龙胆石斑鱼Claudin-12与䲟的亲缘关系最近,同源性最高,一致性高达91.75%;Claudin-3和Claudin-12基因在被检测的13种组织中均有表达,Claudin-3 mRNA在鳃和体肾中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和肝脏,Claudin-12在脑中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和后肠;饲料中精氨酸含量为3.06%时,珍珠龙胆石斑鱼增重率及肠道Claudin-3和Claudin-12基因表达水平显著高于1.96%和3.74%精氨酸组(P<0.05)。研究表明,Claudin-3和Claudin-12基因表达在适宜精氨酸水平的影响下上调,可维护石斑鱼肠道黏膜屏障完整,并促进鱼体生长。

氟对大鼠支持细胞紧密连接occludin基因与蛋白的影响

试验旨在研究NaF对支持细胞occudin基因和蛋白表达的影响。采用不同浓度的NaF(0,0.1,1,10 mg/L)分别处理大鼠睾丸支持细胞48 h,q RT-PCR检测occludin基因水平的变化,免疫荧光技术检测occludin蛋白定位及水平的变化。结果显示,与对照相比,10 mg/L NaF染毒,occludin mRNA相对表达量显著下降(P<0.05);0.1,1.0 mg/L NaF染毒,occludin mRNA相对表达量下降,但差异不显著;occludin蛋白随着染氟剂量的增加,表达量逐渐降低,且occludin蛋白由细胞膜转移到细胞核附近的部位。说明NaF对支持细胞紧密连接的破坏可能与occudin基因与蛋白表达的变化有关。

亲鸽饲粮添加黑水虻幼虫粉对乳鸽生长性能、抗氧化及肠道物理屏障功能的影响

试验旨在探究亲鸽饲粮添加黑水虻幼虫粉对乳鸽生长性能、血清免疫指标、抗氧化功能、肠道形态发育及紧密连接蛋白相关基因表达的影响。试验选取192只体重相近且健康的1日龄乳鸽和96对产蛋日期相近的7月龄亲鸽,随机分成4组,每组6个重复,每个重复8只乳鸽和4对亲鸽,每对亲鸽以“2+2”哺育模式哺育乳鸽。对照组饲喂基础日粮,0.5%、1.0%、1.5%黑水虻幼虫粉组分别饲喂含0.5%、1.0%和1.5%黑水虻幼虫粉的试验饲粮,试验期28 d。结果显示:与对照组相比,黑水虻幼虫粉组乳鸽28日龄体重显著提高(P<0.05);0.5%、1.0%黑水虻幼虫粉组血清IgM和IgG含量显著提高(P<0.05);血清总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及回肠谷胱甘肽过氧化物酶和T-SOD活性显著提高(P<0.05),乳酸脱氢酶活性和血清丙二醛含量显著降低(P<0.05);回肠SOD1、SOD2和CAT mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05);肠道绒毛高度、绒隐比和肌层厚度显著提高(P<0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05);回肠Claudin-3、Occludin和ZO-1 mRNA相对表达量均显著提高(P<0.05),Claudin-2 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮添加0.5%~1.0%黑水虻幼虫粉更有利于乳鸽生长,提高其免疫和抗氧化功能,改善肠道的物理屏障功能。

健脾补土方对脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮质Claudin-5、Occludin、p-BAD、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

目的探讨健脾补土方减轻脑缺血再灌注大鼠神经元损伤的可能作用机制。方法将80只SD大鼠随机分为假手术组10只、手术组70只,手术组经模型制备后评价,剔除不成功的及死亡大鼠,二次分组,分为模型组、依达拉奉组、健脾补土方高、中、低剂量组,每组各13只。手术组采用大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO),干预7天,取材。取材前每组选取10只,采用国际公认的大鼠脑卒中后神经功能缺损评分法(mNss评分)进行神经功能缺损评分。取材部位为缺血侧脑皮质组织。每组随机选取3只采用苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察病理形态改变;每组随机选取其中5只采用Western blot法检测紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、闭合蛋白(Occludin)表达量;剩余5只采用免疫组化法检测磷酸化相关死亡启动因子(phospho-Bcl-xL/Bcl-2 asociated death promoter,p-BAD)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达量。结果(1)造模后,与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分明显上升,经药物干预后,各组神经功能缺损评分均有所下降(P<0.05),其中以依达拉奉组与健脾补土方高剂量组下降最为明显;(2)造模后,模型组大鼠较假手术组病理改变严重,出现组织大片坏死,经药物干预后,各组病理改变均有所改善,依达拉奉组和健脾补土方高剂量组尤为明显;(3)与模型组比较,各药物干预组脑组织缺血皮质区Occludin、Claudin-5蛋白表达均有所上调,差异有统计学意义(P<0.05),其中以依达拉奉组和健脾补土方高剂量组最为显著;(4)与模型组比较,各药物干预组脑缺血皮质组织p-BAD、Bcl-2蛋白表达均明显增加,Caspase-3蛋白表达有所降低(P<0.05),其中依达拉奉组与健脾补土方高剂量组最为显著。结论健脾补土方可能通过上调p-BAD、Bcl-2、Claudin-5、Occludin蛋白表达,下调Caspase-3蛋白表达,从而改善脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损症状及脑组织病理改变,进而促进缺血脑组织损伤修复。

艾灸对克罗恩病大鼠结肠肿瘤坏死因子-α含量及艾灸鼠结肠上清液对培养的结肠上皮细胞内紧密连接蛋白及其基因表达的影响

目的:通过观察温和灸、隔药灸对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导大鼠结肠上皮细胞紧密连接——咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白1(claudin-1)和闭锁蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)及其基因表达的影响,探讨艾灸对肠上皮屏障损伤的修复/保护机制。方法:将SD大鼠随机分成正常组、模型组、温和灸组、隔药灸组和西药组,各12只。采用三硝基苯磺酸制备克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)大鼠模型。温和灸组与隔药灸组选择"天枢""气海"穴分别予以温和灸和隔药灸,每日1次,共治疗14次;西药组以柳氮磺胺吡啶溶液灌胃,每日2次,共14次。治疗结束后剖取各CD组大鼠结肠,制备结肠黏膜上清液;正常组纯化并培养结肠上皮细胞建立肠上皮屏障体外模型。将各CD组结肠黏膜上清液分别与正常大鼠结肠上皮细胞混合培养1周,采用ELISA法检测各组结肠黏膜上清液TNF-α含量,Western blot和荧光定量PCR法观察其对CD大鼠体外结肠上皮紧密连接occludin、claudin-1和ZO-1及其mRNA表达的影响。结果:CD模型组较正常组大鼠结肠黏膜上清液中TNF-α含量有显著增高(P<0.01),温和灸、隔药灸和柳氮磺胺吡啶治疗后TNF-α含量显著降低(均P<0.01),其中温和灸、隔药灸组优于西药组(均P<0.05);与此同时,温和灸、隔药灸和西药组结肠黏膜TNF-α上清液体外诱导大鼠结肠上皮紧密连接occludin、claudin-1和ZO-1及其mRNA表达较模型组有显著增高(P<0.01,P<0.05),且隔药灸、温和灸两组也优于西药组(均P<0.05)。结论:艾灸(隔药灸、温和灸)可能是通过降低CD大鼠结肠黏膜异常增高的TNF-α,进而促进或调节结肠上皮紧密连接occludinc、laudin-1和ZO-1及其mRNA表达,达到修复/保护肠上皮屏障损伤的目的。

池塘养殖条件下草鱼(Ctenopharyngodon idelluspond)肠道黏膜细胞紧密连接蛋白基因表达水平的研究

为了研究肠道损伤与肠道黏膜细胞TJ结构的关系,以池塘养殖条件下的草鱼为研究对象,在对肠道损伤进行外观形态、组织切片和血清指标评估的基础上,分别选取肠道健康和肠道损伤的草鱼,采用荧光定量PCR(RT-QPCR)方法,定量检测了构成肠道黏膜细胞紧密连接结构的9个蛋白基因的表达水平。结果显示:与肠道健康草鱼相比,养殖草鱼肠道损伤后,血清二胺氧化酶(DAO)活性显著增加,同时,肠道黏膜细胞中的跨膜蛋白基因Claudin-3、Claudin-12、Claudinb、Claudinc、Claudin-15a,外周膜蛋白基因ZO-3和闭锁蛋白基因Occludin的表达水平显著下调(p<0.05)。结果表明,草鱼肠道损伤会导致肠道黏膜细胞间TJ结构的损伤,从而导致肠道屏障通透性的显著增加。

金黄色葡萄球菌和纤维连接蛋白结合蛋白A对血管内皮细胞紧密连接的破坏作用

目的观察金黄色葡萄球菌和纤维连接蛋白结合蛋白A基因(fnBA)敲除金黄色葡萄球菌菌株对人微血管内皮细胞(HMEC-1)紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的影响,并探讨金黄色葡萄球菌侵袭血管内皮细胞的机制。方法将野生金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325与HMEC-1按100︰1比例共培养,实时定量RT-PCR检测共培养30 min、60 min和120 min时HMEC-1紧密连接成份ZO-1和Claudin-5 mRNA的表达,同时应用Western blot分析和免疫组织化学染色观察共培养不同时间紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达。构建fnBA基因敲除突变菌株NCTC8325ΔfnbA,以野生金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325为阳性对照,观察突变株NCTC8325ΔfnbA与HMEC-1共培养120 min后紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的变化。结果金黄色葡萄球菌NCTC8325与HMEC-1共培养30 min、60 min和120 min后紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5 mRNA的表达在30 min、120 min时较对照组显著下降[30 min时与对照组比较:ZO-1:t=4.104、P=0.015,Claudin-5 mRNA:t=2.802、P=0.049;120 min时与对照组比较:ZO-1:t=3.478、P=0.025,Claudin-5 mRNA:t=1.802、P=0.261],但60 min时ZO-1、Claudin-5 mRNA的表达有一过性升高。与金黄色葡萄球菌NCTC8325共培养后,免疫组织化学结果发现在30 min时ZO-1和Claudin-5两种紧密连接蛋白较对照组表达显著下降(t=33.6、59.03,P均<0.001),120 min时ZO-1和Claudin-5两种紧密连接蛋白较对照组表达亦显著下降(t=31.8、60.75,P均<0.001);Western blot与免疫组组织化学结果一致。与突变菌株NCTC8325ΔfnbA共培养30 min、60 min和120 min后,在30 min和60 min时ZO-1、Claudin-5蛋白的表达与NCTC8325组差异无统计学意义(P均>0.05),在120 min时ZO-1和Claudin-5蛋白的表达较NCTC8325组显著升高,差异均有统计学意义(ZO-1:t=14.89、P<0.001,Claudin-5:t=7.008、P=0.002)。结论金黄色葡萄球菌能通过下调紧密连接蛋白破坏HMEC-1紧密连接屏障,且其表面蛋白FnBPA发挥了重要作用。