辅助生殖实验室技术的改进

人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)经过40年的发展,已成为治疗不孕不育的重要方式。实施ART治疗过程涉及多个环节、多个流程,环环相扣,其中实验室技术为保护配子和胚胎的发育潜能提供良好的条件,是获得理想临床结局的质量保障,随着新的理论知识发展及技术操作经验的积累,实验室技术不断优化和改进,尤其在实验室质量管理、培养体系、体外操作等方面都在稳步有序地发展和改进,本文就以上几个方面的ART实验室技术的改进进行阐述。

辅助生殖技术领域的知情同意

首先对知情同意程序进行了说明,再结合临床实践情况对辅助生殖技术领域知情同意的内容制定、实践重点难点进行了阐述,最后对知情同意面临的挑战进行了探讨。要做好知情同意过程,首先知情同意书的内容要公正合理,其次临床医生对知情同意的重要性要有科学的认识,并制定出规范的执行程序,再次,工作中要认真执行相关的伦理要求,最后,坚持尊重病人这一基本伦理学原则是关键。

促性腺激素释放激素拮抗剂在下丘脑垂体外生殖系统中的作用及临床应用

近年来,促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant)因其可以有效抑制提前出现的LH峰,大大降低了促排卵周期的取消率,因此在体外受精的临床促排卵中使用日益广泛。垂体外组织中广泛存在GnRH及其受体,由于GnRH-ant可以直接阻断垂体外组织的GnRH受体,因此可能影响成功受孕的关键步骤,如卵泡的募集发育和子宫内膜容受态的建立,但相关的研究尚无统一定论。仍然需要进一步的研究明确GnRH-ant在垂体外组织的具体作用,以改善临床促排卵的效果和胚胎种植的效率,这也是目前的研究热点之一。

关注生殖健康,摆脱不孕困扰

根据世界卫生组织(WHO)的定义,生殖健康是表示人们能够有满意且安全的性生活,有生育能力,可以自由决定是否和何时生育并且生育多少。根据这样的定义我们可以将生殖健康的主要内容归纳为如下六点。第一,有满意且安全的性生活。

2016年美国生殖医学协会《中重度卵巢过度刺激综合征的预防和治疗的临床指南》解读

卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）是控制性卵巢刺激后的并发症。卵巢刺激是治疗不孕症及进行人类辅助生育技术中的重要环节,尤其是进行人类辅助生育技术时需要多个卵泡的同步发育,会使用相对剂量较大的促性腺激素,导致OHSS的发生风险增加（据报道其发生率为1％～5％）。

关于生殖医学伦理的争议与思考

1978年7月英国第一例“试管婴儿”出生，标志着现代人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）进入了一个崭新的阶段，也激发了关于使用生殖技术的伦理争论，随着这些技术的安全性逐渐被证实，人们已认为辅助生殖技术在伦理学上是可以接受的。

体外受精周期中注射hCG日雌激素水平对妊娠结局的影响

目的探讨体外受精周期中注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)日雌激素高水平对新鲜周期和随后的冻融周期妊娠结局的影响。方法收集采用长方案进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)的患者移植周期资料,根据注射hCG日血清雌二醇(E2)的质量浓度分为两组:A组(E2质量浓度≥5 000 pg/mL,n=154)和B组(E2质量浓度<5 000 pg/mL,n=294);其中A组患者根据首次移植时间又分为两个亚组:A1组(鲜胚移植组,n=78)和A2组(冻胚移植组,n=76)。比较各组周期特征和妊娠结局。结果 A、B两组受精率、卵裂率比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组临床妊娠率和胚胎种植率的差异无统计学意义(P>0.05);A组的中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生率(4.55%)显著高于B组(1.36%)(P<0.05)。A2组首次胚胎冻融移植周期的临床妊娠率(48.68%)和胚胎种植率(29.14%)显著高于A1组和B组(P<0.05)。结论 E2水平升高是卵巢高反应的表现,与IVF结局没有明显关系,但患者发生OHSS的风险随之升高;对E2高水平的患者采用全胚胎冻存的方法能够获得满意的妊娠结局。

激光辅助孵化对冻融胚胎移植临床结局的影响

目的探讨激光削薄法辅助孵化(AH)对冷冻第3天胚胎移植结局的影响。方法选取行第3天冷冻胚胎移植患者的1 024周期,其中964个周期行常规的第3天冻存胚胎移植(非AH组),60个周期于第3天冻存胚胎复苏后,用激光将1/4透明带削薄2/3后移植(AH组);分析两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率。结果两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率分别为43.2%和24.2%、58.3%和43.2%、45.7%和26.9%、78.4%和77.7%、21.6%和22.3%、6.7%和4.4%;其中AH组的种植率、临床妊娠率及多胎率与非AH组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而活产率、流产率及生化妊娠率高于非AH组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用激光削薄方法进行AH可以提高冷冻复苏第3天胚胎移植后的种植率及临床妊娠率,而对活产率无明显影响。

吸烟对精子染色质结构完整性影响的探讨

目的：探讨吸烟对精子染色质结构完整性的影响。方法：784例男性不育患者从病例库中选取,根据吸烟与否及每日吸烟支数（≤10、11-19、≥20）和吸烟年限（≤5、6-9、≥10）进行分组,比较各组患者精液常规检测参数及精子染色质结构受损和精子核成熟情况。精子染色质结构完整性采用流式细胞仪检测,DNA损伤程度和不成熟精子指数分别以DNA损伤指数（DFI）和高DNA着色性（HDS）来表示。结果：吸烟≥20支/日和吸烟年限≥10年的患者组精液量、前向运动精子比例低于其他组而精子畸形率高于其他组（P〈0.05）;吸烟组男性的DFI和HDS值均升高（P〈0.05）;HDS与前向运动精子比例呈负相关（r=-0.18,P〈0.05）,DFI与HDS均与精子畸形率呈正相关（r=0.31与r=0.39,P均〈0.05）。结论：日吸烟量≥20支或吸烟年限≥10年对男性的精液量、前向运动精子比例和精子畸形率都有影响,吸烟影响男性精子DNA完整性和精子核成熟。

胚胎质量对冻融周期中生化妊娠和胚胎早期停止发育的影响

目的·探讨在体外受精-胚胎移植冻融周期中,胚胎的质量是否会影响临床结局导致生化妊娠或早期胚胎停止发育。方法·回顾性分析2015年1月至2016年6月在上海交通大学医学院附属瑞金医院生殖中心行冻融胚胎移植治疗后生化妊娠的115个周期、早期胚胎停止发育的64个周期、继续妊娠的871个周期的临床资料,比较移植后第3天(D3)胚胎质量及评分和囊胚发育速度、囊胚级别在3组之间的差异。结果·在男女双方年龄、不孕年限、排卵日子宫内膜厚度、移植日雌二醇和孕酮水平等方面3组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。多数D3冻融胚的评分为6~8分,且各分值所占比例在3组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组中移植的D5囊胚所占的比例均高于D6囊胚所占的比例,但3组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。评级为A、B的囊胚内细胞团比例和评级为C的囊胚内细胞团比例在3组中分别比较,差异均无统计学意义;但在胚胎停止发育组中,评级为C的囊胚滋养层所占的比例为52.2%,明显高于生化妊娠组(35%)和继续妊娠组(29.3%)中相应的比例,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论·胚胎质量与生化妊娠没有必然关系,而囊胚滋养层的评级可能是胚胎早期停止发育的主要原因之一。

以胚胎质量评分预测体外受精-胚胎移植妊娠结局

目的探讨移植胚胎质量与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局关系,并探讨本中心采用的胚胎质量评分能对体外受精妊娠结局起到的预测作用。方法对2002年3月至2003年12月间的136对夫妇,141 个完全随访的移植周期按各种情况分组,并对各组的平均年龄、胚胎评分、移植胚胎数、妊娠率、种植率及多胎妊娠等进行分析。结果每移植周期中的最佳胚胎均分随年龄增加而递减(P=0．002 3);随移植的优质胚胎数增加,胚胎种植率显著增加(P=0．015),多胎率也依次递增;至少有一枚胚胎评分≥8分的移植周期与≤7分的移植周期相比,胚胎种植率明显增高(P=0．020)。结论患者胚胎质量随年龄递减,妊娠率随之下降,以35岁为界线;移植胚胎评分≥8分能预见较高的妊娠可能性;优质胚胎移植数与多胎妊娠的发生密切相关。

ICSI时不同单精子注入方式对胚胎体外发育的影响

目的:探讨卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)时回吸与不回吸胞浆对胚胎体外发育的影响。方法:将在本中心接受ICSI治疗的90周期不孕患者的1077枚MII卵子随机分为A组(632枚)和B组(445枚)。A组ICSI时回吸胞浆至卵母细胞直径的1/4-1/2处;B组不回吸胞浆,比较2组的受精率、胚胎可用率和优质胚胎率等。结果:A组和B组的受精率分别为80.85%和82.02%,无统计学差异意义(P>0.05)。A组的胚胎可用率为53.88%,与B组(56.15%)比较无差异(P>0.05);B组的优质胚胎率为20.39%,显著高于A组的13.32%(P<0.05)。结论:ICSI时回吸胞浆和不回吸胞浆对体外受精均是有效的;不回吸胞浆可提高优质胚胎率,对胚胎发育更安全。

PCOS合并代谢综合征患者卵泡液激肽谱与卵子质量的关系

目的探讨PCOS合并代谢综合征患者卵泡液内脂质代谢模式与卵泡液内激肽系统表达谱及胚胎发育的关系。方法前瞻性队列研究,选取年龄匹配的体外受精助孕患者共90例,其中单纯PCOS 30例,PCOS合并代谢综合征患者30例,正常对照组30例。所有患者均采用拮抗剂方案促排卵,取卵日收集单个优势卵泡(直径18~21mm)卵泡液,采用悬液芯片技术检测卵泡液内激肽表达谱,比较各组患者卵泡液内脂代谢指标、激肽表达谱及相关的胚胎质量。结果 (1)三组患者基础性激素(FSH,LH,E_2,P)水平、HCG扳机日和取卵日激素(LH,E_2,P)水平,及收集卵泡液的卵泡直径大小均无统计学差异(P>0.05)。(2)PCOS合并代谢综合征组患者的体重指数、血清和卵泡液内甘油三酯水平均显著高于其他两组患者(P<0.05),而高密度脂蛋白水平显著下降(P<0.05);PCOS合并代谢综合征患者卵泡液内胆固醇水平和TNF-α水平均显著高于其他两组患者(P<0.05),而G-CSF水平显著降低(P<0.05);其他15种激肽水平各组间无统计学差异(P>0.05)。(3)卵泡液G-CSF水平与其内胆固醇(TG)和甘油三酯(TC)水平存在负相关(相关指数分别为0.29和0.25),而TNF-α则与TG水平正相关(相关指数0.26)。(4)三组患者间受精率、胚胎可用率均无统计学差异(P>0.05),优质胚胎率在PCOS合并代谢综合征组(20.0%)显著低于PCOS组(38.4%)及对照组(34.6%)(P<0.05)。结论 PCOS合并代谢综合征患者卵泡液内脂代谢异常指标主要与激肽表达谱中的G-CSF和TNF-α有关;由于激肽系统对卵子的发生存在直接影响,我们推断PCOS合并代谢综合征患者的卵子发育潜能下降的原因很可能涉及这一机制。

基础血清卵泡刺激素/黄体生成素比值评估卵巢反应性价值的探讨

目的探讨基础卵泡刺激素/黄体生成素(FSH/LH)比值评估卵巢对促性腺激素反应性的价值。方法对134个短方案促排卵周期的患者年龄、基础FSH以及FSH/LH比值和代表卵巢反应性降低的指标进行logistic回归统计,比较三者影响度,并寻找适当FSH/LH界值。结果在基础FSH<8 IU/L患者中,年龄、FSH和FSH/LH比值对卵巢反应性降低的影响度OR值相近,基础FSH/LH预测取卵数目≤5个的界值为3.7;在FSH≥8 IU/L患者中,上述三项指标OR值出现差异,FSH/LH比值的OR值最高,年龄次之,FSH最低;基础FSH/LH预测取卵数目≤5个的界值为3.3。结论在卵巢储备降低(FSH≥8 IU/L)的患者中,使用基础FSH/LH比值对卵巢反应性进行评估比单纯使用年龄或基础FSH进行评估更有价值。

IVF-ET失败者行宫腔镜检查的临床价值

目的:探讨IVF-ET失败者行宫腔镜检查的意义及其临床应用价值。方法:选取38例既往有IVF-ET失败史的患者行宫腔镜检查及手术(研究组),与同期常规行宫腔镜检查的不孕患者45例(对照组),就子宫内膜形态的不同表现类型临床结局等方面进行比较。结果:研究组宫腔内膜异常的发生率为84.21%,明显高于对照组的48.89%,其中宫腔粘连、子宫内膜不规则增生以及子宫内膜息肉的发生率均高于对照组(P<0.05)。研究组的32例于宫腔镜术后一年内再次行IVF/ICSI或冷冻胚胎移植术,17例获得临床妊娠。余6例术后至今未行IVF-ET,不避孕未孕。结论:宫腔镜检查、干预有利于改善子宫内膜的形态,提高临床妊娠率,可作为再次IVF前的常规筛查手段。

1052例Y染色体微缺失检测及14例微缺失家系调查

目的:通过对不育患者进行Y染色体微缺失筛查以及部分微缺失患者的家系追踪调查,探讨Y染色体微缺失父子间的自然垂直遗传特点。方法:对1 052例患者进行Y染色体无精子因子(AZF)检测,并对12例AZFc缺失患者,1例AZFb和1例AZFb+c缺失患者进行家系追踪调查,绘制AZF缺失患者男性直系家族成员男性不育家系系谱图。结果:1 052例患者,共发现Y染色体微缺失89例,其中AZFc缺失56例,AZFa缺失6例,AZFb缺失5例,AZFb+c缺失14例,AZFa+b+c缺失8例。在追踪调查的AZF缺失家系中,AZFb和AZFb+c仅先证者存在缺失,12例AZFc缺失患者中5例重度少精子症患者存在家族垂直遗传,另外1例重度少精子症患者和6例无精子症患者家系中除先证者有缺失外,其家系成员未发现缺失。结论:通过对Y染色体微缺失患者进一步的家系调查发现,仅重度少精子症的AZFc缺失患者可能由父亲垂直遗传而来,但与父系表型有差异。对AZF缺失的无精子症患者,无论何种缺失类型,由父亲垂直遗传而来的可能都不大。

不明原因反复自然流产妇女植入窗期子宫内膜形态及雌孕激素受体的表达

目的探讨不明原因反复自然流产(URM)与植入窗期子宫内膜发育程度以及雌、孕激素受体(ER、PR)表达之间的相关性。方法应用光学显微镜、扫描电镜观察URM(试验组)24例生育妇女(对照组)22例子宫内膜组织学,胞饮小泡密度;免疫组织化学分析ER、PR的表达。结果 URM组子宫内膜黄体期缺陷(LPD)的发生率明显高于对照组,胞饮小泡密度低于对照组,子宫内膜上皮细胞核及基质细胞核中PR的表达量也低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。两组子宫内膜ER的表达未见统计学差异。结论 URM子宫内膜LPD发生率高,胞饮小泡密度明显低于正常生育妇女,提示植入窗期子宫内膜发育滞后可能是导致胚胎着床障碍、反复自然流产的原因之一。在性激素分泌正常的URM妇女中,子宫内膜PR表达下降,对孕激素反应不足可能是导致内膜形态发育滞后的原因。

中国汉族人群AZFc微缺失区域序列标签位点的探讨

目的:探讨中国人群无精子因子c(azoosperm ia factor c,AZFc)微缺失的类型及AZF多重PCR筛查时序列标签位点(sequence taged sites,STSs)的选择。方法:采用多重PCR反应测定9个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY152、sY145、sY255、sY254、sY157)筛查164例严重少精子症或非梗阻性无精子症汉族男性Y染色体微缺失,并以精子浓度正常的男性105例作为对照;同时对来自多中心的180例已确诊为sY254、sY255缺失的男性进行sY145、sY152和sY157位点分析。结果:164例严重少精子症或无精子症男性中AZFc缺失者14例(8.5%);共194例sY254、sY255缺失男性的sY145、sY152均未缺失,而sY157未缺失者仅2例。发现1例单sY157缺失的严重少精子症男性为sY1206缺失和DAZ基因中DAZ3/DAZ4基因拷贝缺失。结论:sY254、sY255和sY157缺失是中国人群AZFc缺失的最常见类型;sY145和sY152微缺失在入选的研究对象中未曾出现,因此不建议作为AZFc常规筛查的位点。"sY157的单一缺失"可能是中国人群AZFc部分缺失的一种新类型,其临床意义值得进一步探讨。

子宫腺肌病冻融胚胎移植周期子宫内膜准备方案的选择

目的探讨促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)超长垂体降调节对改善子宫腺肌病(AM)患者冻融胚胎移植(FET)周期妊娠结局的价值。方法选择2008年1月至2010年9月在本生殖医学中心实施体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕后剩余胚胎冻存并择期行FET助孕的AM患者138例。根据FET前是否采用长效GnRH-a垂体降调节将患者分为GnRH-a+人工周期组,共106个周期;单纯人工周期组,共79个周期。比较两组患者的一般情况、性激素水平、注射黄体酮日子宫内膜厚度、胚胎移植日内膜形态、平均移植胚胎数、所移植的第3天(D3)卵裂期胚胎质量评分等指标,以及两组胚胎种植率、临床妊娠率和流产率差异。结果 (1)注射黄体酮日雌二醇(E_2)水平、内膜厚度,FET日孕酮(P)水平和内膜形态评分、平均移植胚胎数、复苏D3胚胎质量评分,两组比较均无显著差异(P>0.05)。(2)胚胎种植率、临床妊娠率,在GnRH-a+人工周期组分别为28.37%(61/215)、48.11%(51/106),单纯人工周期组分别为19.14%(31/162)、31.65%(25/79),两组比较均有显著性差异(P<0.05);流产率两组比较无显著差异(P>0.05)。结论 GnRH-a+人工周期子宫内膜准备方案明显提高AM患者FET周期胚胎种植率和临床妊娠率,而未增加流产率。

体外受精周期中血清和卵泡液活性氧及总抗氧化能力的研究

目的探讨体外受精(IVF)周期中血清和卵泡液活性氧(ROS)及总抗氧化能力(TAC)的变化特征。方法选择进行IVF助孕的患者共245个周期,分别收集卵泡刺激前基础状态血清和取卵日血清及排卵期卵泡液,检测ROS和TAC,并分析其与相关临床特征之间的相关性。结果基础状态血清ROS值平均为(59.8±54.6)cps,取卵日血清ROS值平均为(77.5±62.3)cps,差异具有统计学意义(P<0.05);但TAC差异无统计学意义(P>0.05)。卵泡液ROS与取卵日血清ROS、卵泡液TAC与基础状态血清TAC及取卵日TAC均呈正相关(P<0.05)。卵泡液ROS和TAC水平与患者年龄、雌二醇(E2)峰值、获卵数、峰值E2/获卵数及受精率等均无相关性,仅ROS与患者体质量指数(BMI)呈正相关(r=0.29,P=0.04)。BMI<19 kg/m2组与BMI为23～25 kg/m2组及BMI>25 kg/m2组的患者相比,卵泡液ROS显著降低(P<0.05)。结论排卵期血清ROS较早卵泡期升高,卵泡液ROS与BMI呈正相关。