上海市临床检验中心召开上海地区高通量测序试点单位运行情况专题研讨会

为了规范高通量测序在临床检测中的应用,自2014年12月起国家卫生和计划生育委员会先后发布了遗传病、肿瘤及产前筛查高通量测序技术临床试点名单,上海共有包括瑞金医院、中山医院、仁济医院等11家试点单位.为了及时了解上海地区11家试点单位的运行情况,上海市临床检验中心进行了调研工作.通过调研发现试点实验室在运行过程中普遍存在一些困惑及问题.为了更好地解决这些问题,确保高通量测序检测质量,2016年7月13日下午,上海市临床检验中心召开了上海地区高通量测序技术试点单位试运行情况专题研讨会,来自11家试点单位的30余位专家参加了会议.会议由上海市临床检验中心常务副主任王华梁教授主持.

上海地区临床实验室运动神经元存活基因外显子缺失项目检测能力的室间质量评价分析

目的利用室间质量评价(EQA)分析上海地区临床实验室运动神经元存活(survival motor neuron,SMN)基因外显子缺失项目的检测能力。方法选用含有不同SMN外显子拷贝数的细胞株基因组DNA作为EQA样本,2023年间共两次,每次随机选取5份发放给上海地区各参评实验室,要求其在规定时间内进行检测并上传结果,依据回报结果统计分析并评价其检测能力。结果两次EQA中SMN1判定结果回报全部正确的实验室分别占100%(38/38)和97.22%(35/36),SMN1第7,8号外显子拷贝数检测的总体符合率分别为96.92%(315/325)和98.18%(324/330),SMN2第7,8号外显子拷贝数检测的总体符合率分别为100%(65/65)和96.56%(43/45)。回报错误结果中包括1例结果判定错误和4例拷贝数检测错误。结论通过筛选出具有不同SMN外显子拷贝数的细胞株基因组DNA可有效模拟临床样本并应用于SMN外显子缺失EQA活动中。回报结果分析显示上海地区临床实验室SMN外显子缺失项目整体符合率较高,但个别实验室检测能力尚待提高。

2020~2022年度上海及其他省市临床实验室HPV6与HPV11型核酸检测室间质量评价结果分析

目的 通过开展人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型、11型核酸检测室间质量评价(external quality assessment,EQA)计划,来评估实验室检测能力,分析其存在问题,提高检测质量。方法 EQA计划一年两次,样本盘含阳性样本4支,包括HPV6,HPV11强阳性、弱阳性各1支,由具有尖锐湿疣(condyloma acuminata,CA)临床表现,HPV6或HPV11阳性患者的宫颈分泌物(上海市第一妇婴保健院提供)制成。阴性样本1支,由C-33A细胞株(中科院购入)培养制成。样本冷链寄送至各参评实验室,要求其在规定时间内检测并上传结果。上海市临床检验中心(以下简称中心)依据回报结果计算各实验室的成绩。结果 6轮EQA活动共计发出样本盘163份,收到有效报告140份。实验室合格率96.43%(135/140),样本符合率97.86%(685/700)。假阴性13个,假阳性2个,弱阳性样本占假阴性结果的76.92%(10/13)。结论 实验室HPV6/11型核酸检测准确率比较高,个别实验室弱阳性样本的检出能力有待提高,通过参加EQA计划可及时发现问题并提高检测质量。

上海地区PIK3CA基因突变检测室间质量评价分析

目的利用室间质量评价评估上海地区临床实验室PIK3CA基因突变的检测能力。方法选用含有特定PIK3CA突变型的福尔马林固定石蜡包埋细胞样本作为室间质评样本,对其均匀性和稳定性进行评价后,将5个样本随机编号后发送至参评实验室,要求实验室在规定时间内检测并回报结果,综合分析评价回报结果。结果均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。2018年和2019年分别收到有效回报结果28份和19份,回报结果完全正确的实验室分别为78.6%(22/28)和89.5%(17/19),成绩不合格实验室分别为17.9%(5/28)和10.5%(2/19)。样本的整体符合率分别为86.4%(121/140)和93.7%(89/95),其中假阳性率为8.6%(12/140)和2.1%(2/95),假阴性率为8.3%(7/84)和5.3%(4/76)。结论上海地区临床实验室PIK3CA基因突变检测质量整体较好,但部分实验室检测能力尚需提高。实验室通过参加室间质量评价可发现自身问题,持续改进并提高其检测质量。

上海地区NRAS基因突变检测室间质量评价分析

目的通过开展神经母细胞瘤病毒癌基因RAS同源物(NRAS)基因突变检测室间质量评价(EQA)项目,评估上海地区实验室的检测能力及存在问题。方法选取含有特定NRAS基因突变位点的经甲醛溶液固定、石蜡包埋的细胞作为EQA标本,对其均匀性和稳定性进行评价。分别于2019年和2020年将标本随机编号后发至参评实验室,要求实验室在规定时间内检测并回报结果,上海市临床检验中心对结果进行评价分析。结果标本均匀性和稳定性均符合要求,2019年和2020年分别收到26份和24份有效回报结果,结果总体合格的实验室分别占84.62%、95.83%,结果完全正确的实验室分别占80.77%、79.17%;标本的整体符合率分别为93.08%、93.33%;在错误结果类型中,假阳性率分别为33.33%、25.00%,假阴性率分别为66.67%、75.00%。结论上海地区实验室NRAS基因突变检测能力整体较好,2020年实验室的检测能力较2019年有所提升;假阴性是主要错误类型,部分实验室检测能力尚有待提高;实验室通过参加EQA等方式加强实验室质量管理,可及时发现问题并持续改进以提高其检测能力。

上海地区血液EGFR基因突变检测室间质量评价回顾分析

目的利用室间质量评价(EQA)分析上海地区临床实验室血液表皮生长因子受体(EGFR)基因突变项目的检测能力。方法选用含有特定EGFR突变位点的肿瘤细胞系,通过超声断裂基因组DNA制备可人工模拟游离DNA(cell⁃free DNA,cfDNA)的基因片段,经片段长度鉴定及突变频率检测后作为EQA样本。选取5份样本随机编号后发送至参评实验室,要求其在规定时间内进行检测并上传结果,依据回报结果综合评价其检测能力。结果2019年至2021年分别收到有效回报结果33、29和27份。参评实验室最常用的方法为ARMS法,分别为66.7%(22/33)、75.9%(22/29)和74.1%(20/27),其次为dPCR法和NGS法,分别为12.1%(4/33)、13.8%(4/29)、14.8%(4/27)和21.2%(7/33)、10.3%(3/29)、11.1%(3/27)。回报结果完全正确的实验室分别为78.8%(26/33)、89.7%(26/29)和96.3%(26/27),成绩不合格实验室分别为9.1%(3/33)、3.4%(1/29)和3.7%(1/27)。样本的整体符合率分别为92.7%(153/165)、97.2%(141/145)和98.5%(133/135)。不符合样本中,假阳性率分别为1.8%(3/165)、1.4%(2/145)和0%(0/135),假阴性率分别为5.5%(9/165)、1.4%(2/145)和1.5%(2/135)。结论上海地区临床实验室血液EGFR基因突变检测整体符合率较高,但个别实验室检测能力尚待提高。此外,临床实验室应通过参加EQA活动以持续改进其检测质量。

CRISPR/Cas系统在分子检测中的应用

近年来,成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律短回文重复序列相关蛋白(CRISPR/Cas)系统凭借其简单、高效的基因编辑能力,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。随着CRISPR技术的快速发展,CRISPR/Cas系统已被开发为一种快速、便携、低成本、高灵敏度的分子检测工具,在病原体检测、耐药性分析、单核苷酸多态性(SNP)分型、肿瘤基因突变检测等方面取得重大突破。文章就不同Cas蛋白在分子检测中的最新研究进展进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为从事相关领域的科研工作者提供参考与帮助。

上海地区乙型肝炎病毒DNA检测正确度验证结果分析

目的分析上海地区2017年乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)正确度验证结果,了解上海地区HBV DNA的检测质量。方法收集临床实验室检验剩余样本,制备低、高2个浓度样本。要求临床实验室在3个不同工作日检测,每批次重复检测3次,通过网络回报结果。采用国家二级标准物质对调查样本进行赋值,分析不同试剂组的组内变异系数(CV)和偏移以及各临床实验室的室内CV和偏移。结果通过赋值,2个正确度样本的定值分别为5.96×10^3IU/mL和4.34×10^5IU/mL。2个样本不同试剂组组内CV为4.49%~8.87%和2.64%~4.55%,检测结果与靶值的偏移为-5.52%^-18.06%和-2.19%^-7.79%。2个样本室内CV为1.28%~7.59%和0.53%~4.09%;偏移为-1.88%^-26.66%和0.02%^-11.21%。2个样本的符合率分别为37.93%(11/29)和65.52%(19/29)。结论上海地区临床实验室HBV DNA检测重复性较好,但正确度水平还需改进。

一种H7N9禽流感病毒检测质粒DNA标准物质的研制

为保证H7N9禽流感病毒核酸检测方法的可比性、有效性和可靠性,研制了一种质粒DNA标准物质,包含H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的靶标基因(H7、N9基因序列)和内参基因(M基因、Rnase P基因序列),具有良好的序列准确度和量值溯源性。采用紫外分光光度法(UV)和高分辨电感耦合等离子对该标准物质的均匀性、稳定性进行了评估,并对定值不确定度进行了评定。结果显示,质粒DNA标准物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20℃下保存1 a以上,且无生物危害。对质粒DNA标准物质在实时荧光RT-PCR检测中的应用性考察结果证明,其适用于多种实时荧光RT-PCR检测方法,可保证H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测结果的可比性,为其提供生物计量技术支持。

人乳头瘤病毒16和18型核酸检测用质控品制备及其应用

目的制备可模拟真实临床标本的HPV-16和HPV-18核酸检测用质控品,并用于上海地区临床实验室的室间质量评价。方法分别选择整合有HPV-16和HPV-18 L1基因的宫颈癌细胞系(Siha和Hela)进行培养,收集细胞后用HPV国际标准品定值并分装,对其均匀性和稳定性进行评价,然后将样本盘发送至参评实验室,对回报结果进行分析评价。结果均匀性评价结果显示质控品间均匀性良好,稳定性评价结果表明质控品检测结果随时间延长无明显趋势变化。参评实验室对高浓度样本的检测符合率较高,低浓度样本的检测符合率较低。对于不分型项目,26%参评实验室由于上报假阴性结果导致出错。对于分型项目,不同检测方法的结果间没有显著差异,样本检测出错主要是因为错检或漏检某一亚型所致。结论制备的核酸检测用质控品的均匀性和稳定性良好,可有效用于临床实验室室间质量评价。质评结果显示上海地区参评实验室HPV核酸检测质量整体较好,个别实验室检测能力尚需提高。

HCV核糖核酸国家二级标准物质的研制

目的研制HCV RNA国家二级标准物质。方法用HCV阴性血清将阳性血清稀释至浓度约3.0×10^5IU/m L,按每支1 m L分装,真空冷冻干燥。制备后进行均匀性和稳定性检验,并做临床适用性评价。定值溯源至国际标准物质（编号06/102）。结果均匀性结果显示瓶间不精密度1.77%,瓶内不精密度1.40%（F=1.596 9,P〉0.05）;20～25℃稳定14 d,2～8℃稳定2个月,-20℃稳定12个月（P〉0.05）;37℃不稳定（P〈0.05）。开瓶后放置7 d、反复冻融5次和模拟运输后检测值与对照组（-20℃保存）比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。定值为（1.9±0.9）×10^5IU/m L。结论制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的HCV RNA标准物质。

环介导等温扩增技术快速检测沙眼衣原体

目的建立一种新的简单、快速检测沙眼衣原体(CT)的环介导等温扩增(LAMP)技术。方法采用Primer Explorer V4软件,针对CT隐蔽性质粒基因保守区域设计4重引物(2重内游引物,2重外游引物),并对LAMP反应体系和反应条件进行优化,评价其敏感性和特异性,将其与实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对临床样本的检测结果进行比较。结果建立的LAMP技术特异性高,与其他常见菌株检测无交叉反应;敏感性高(100拷贝/μL)。用建立的LAMP技术与实时荧光定量PCR对90例临床样本进行检测,检测结果为阳性40例、阴性50例,二者符合率为100%。结论成功建立了检测CT隐蔽性质粒基因的LAMP技术,为CT的快速检测提供了新的手段。

血浆Septin9基因甲基化检测质控品制备及其应用

目的制备可模拟临床标本的血浆Septin9基因甲基化(mSEPT9)质控品并用于室间质量评价。方法选择Septin9区域已发生/未发生甲基化的HeLa/Jurkat细胞进行培养,收集并抽提细胞基因组DNA,经mSEPT9试剂盒检测,依据检测Ct值用阴性血浆稀释分装成含有不同浓度的质控品,对质控品均匀性和稳定性进行评价后,将5个样品随机编号后发送至参评实验室,分析评价回报结果。结果抽提得到的细胞基因组DNA纯度和浓度均可满足使用需求,且可用作mSEPT9检测的质控品。均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品要求。部分参评实验室出现假阳性和假阴性情况,仅有约55.6%实验室的检测结果(Ct值)呈良好线性相关。9家参评实验室中,7家实验室(77.8%)成绩优秀,1家实验室(11.1%)成绩合格,1家实验室(11.1%)成绩不合格。结论成功研制血浆mSEPT9检测的质控品并应用于室间质评,有利于评估并提升临床实验室检测能力。

临床分子病理检测质控品的研究进展

分子病理检测是肿瘤个体化治疗的重要依据,其检测结果的准确可靠与患者疗效紧密相关。为确保检测质量,须在检测中加入特定质控品对检测过程进行严格质量控制。本文对常用分子病理检测用质控品的类型及其优点和局限性阐述如下,以便为实验室选择相关质控品提供帮助,进而更好地为临床提供准确可靠的结果。

上海地区BRAF基因突变检测室间质量评价

目的通过开展B-rapidly accelerated fibrosarcoma(BRAF)基因突变检测项目室间质量评价(external quality assessment,EQA),分析和探讨临床实验室存在的问题,并提出改进措施。方法上海市临床检验中心(以下简称"中心")2017年发送两次EQA样品盘至45家实验室,每次均包含5份样本,要求各参评实验室在1周内将检测结果上传至中心数据库。然后,中心依据回报结果汇总各实验室EQA成绩,并计算每份检测样本的符合率。结果 2017年两次BRAF基因突变检测EQA活动分别收到42和41家实验室的有效回报结果,两次10份样本检测总符合率为76.2%~100%,其中:野生型、p.V600K、p.V600R和p.V600E样本符合率分别为99.2%(123/124份),79.8%(67/84份),87.8%(36/41份)和95.2%(119/125份)。分别有73.8%(31/42家)和75.6%(31/41家)的实验室检测结果完全正确;其中:使用注册试剂检测结果完全正确的实验室分别为79.8%(27/34家)和81.3%(26/32家),使用实验室自建方法(laboratory-developed tests,LDTs)结果完全正确的实验室分别为50%(4/8家)和55.6%(5/9家)。结论上海市临床实验室BRAF基因突变检测项目EQA总符合率较高,商品化试剂检测结果符合率高于LDTs;部分实验室检测能力有待提高,应加强BRAF基因突变检测项目质量控制,以确保检测结果的准确性。

新型冠状病毒核酸检测室间质量评价分析

目的:利用室间质量评价(EQA)评估实验室新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测项目的检测能力。方法:室间质量评价选用经特殊处理的2019-nCoV RNA作为EQA样本,甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒灭活临床样本作为阴性样本,分别评价其适用性、均匀性和稳定性后,将6份样本(第一轮不分组/第二轮分组)经冷链快递发送至参评实验室,要求实验室在规定时间内检测并回报检测信息和结果,然后对回报数据进行分析评价。结果:EQA样本适用于市面上主流核酸检测试剂。均匀性和稳定性均符合中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。第一轮和第二轮分别收到有效回报结果243份和60份,回报结果完全正确的实验室分别为98.8%(240/243)和73.3%(44/60),成绩不合格实验室分别为1.2%(3/243)和26.7%(16/60)。第一轮和第二轮样本的整体符合率分别为99.8%(1455/1458)和94.7%(341/360),其中假阳性率分别为0.1%(1/729)和2.5%(3/120),假阴性率分别为0.3%(2/729)和6.7%(16/240)。结论:目前参评实验室对2019-nCoV核酸检测的整体能力较好,假阴性结果是影响其检测的主要问题。各实验室在常规应用相关试剂前,应对不同厂家试剂进行性能验证与比对。

高通量测序技术在五类疾病分子诊断中的应用及质量管理策略

高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称下一代测序(next generation sequencing,NGS)能一次并行对成千上万个基因进行测序,极大地提高了DNA测序效率并降低了成本。近年来,NGS在医学研究和临床诊断中的应用日益广泛,在无创产前筛查,肿瘤筛查、诊断和治疗,微生物病原体检测,遗传性疾病的筛查与诊断及器官移植排斥筛查等多个领域具有广泛的应用前景。NGS技术作为一项新兴技术,在相关临床应用中也存在诸多问题,其质量管理体系尚不完善,还面临许多挑战,需要医学实验室和相关部门共同努力,以促进NGS在临床诊断中规范开展。

11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较

收集11种不同厂家的灭活型样本保存液,将甲型流感病毒加入保存液和生理盐水中,在4℃、25℃和37℃条件下保存0 h、2 h、4 h、6 h和24 h后,分别提取各组的病毒核酸,并通过逆转录实时荧光PCR检测病毒载量变化,以探究不同样本保存液对病毒核酸保护效果是否存在差异。结果发现不同样本保存液中的病毒载量随保存时间和温度变化存在显著差异。据此可将11种灭活型样本保存液的保存效果分为四类:(1)优秀产品:在任一温度(4℃、25℃、37℃)条件下,即使保存24h时病毒核酸都未发生明显降解,占比27.2%(3/11);(2)良好产品:低温(4℃)和室温(25℃)情况下核酸未出现降解,但在高温(37℃)条件下6 h后保存效果明显下降,占比27.2%(3/11);(3)合格产品:低温(4℃)条件下对病毒核酸具有较好的保护效果,但在室温(25℃)和高温(37℃)情况下随保存时间延长其保护效果显著下降,占比18.1%(2/11);(4)不合格产品:任一保存条件下对病毒核酸的保护效果都较差,甚至加入病毒后立即导致病毒核酸发生快速降解,占比27.2%(3/11)。以上结果说明不同厂家样本保存液对病毒核酸的保护效果存在显著差异,可能会导致病毒核酸检测出现假阴性结果。因此,需重点加强对样本保存液的质量监管,以有效保障病毒核酸检测,尤其是新冠核酸检测质量,以更好地做好疫情防控工作。

病原体核酸即时检测质量管理要求专家共识

2021年,新型冠状病毒肺炎疫情仍然在全球范围起伏跌宕。在我国科学防控、精准施策的公共卫生体系运行下,实现了疫情管控和复工复产的有序和共赢。其中,新型冠状病毒核酸检测作为疫情防控的第一防线,发挥了巨大作用。在发热门诊、急诊手术等场景下,要求核酸检测随到随做、快速报告,新型冠状病毒核酸即时检测(POCT)技术应运而生,迅速在各级医疗机构广泛开展,与常规聚合酶链反应(PCR)批测试互补,构建了保障医疗安全和提升优质服务的实验诊断平台。但鉴于分子诊断的复杂性和病原微生物的生物安全要求,病原体核酸POCT与传统基于血液的理化指标检测不同,其质量管理要求尚无章可循,在实际工作中也存在各种认识上的困惑和操作中的不一致。因此,上海市医学会分子诊断分会、上海市医学会检验医学分会、上海市微生物学会和上海市临床检验中心,协同编制了本专家共识,立足当前我国主要的感染性疾病谱,从病原体POCT应用场景、生物安全、人员资质、性能验证、质量控制、结果报告等全流程运行管理进行阐述,以期促进该技术在公共卫生防御和医院感染管理中的合理应用和健康发展。

丙型肝炎患者病毒基因型与抗HCV水平的相关性研究

目的探讨丙型肝炎患者抗-HCV水平性与病毒基因型的相关性。方法采用回顾性研究方法，收集2013至2014年上海市15家医疗机构抗．HCV阳性标本603份，应用雅培Architect11000免疫分析系统进行复检。对复检阳性标本检测HCVRNA及进行基因分型，并以患者的抗HCV浓度水平的四分位间距为区间，分析不同基因型患者抗HCV浓度水平的分布规律，探讨机体对病毒应答的抗体产生与病毒基因型的相关性。各基因型在不同抗体浓度区间分布率比较采用X2检验。结果603份标本中抗HCV双试剂复检阳性412份（68．33％），其中174（42．3％）份标本检测出HCVRNA；174份HCVRNA阳性标本中169份得到丙肝基因型结果。以抗体浓度四分位间距为区间，不同基因型患者中不同抗体浓度患者的分布为：1a型（8份）1／8、11／8、4／8、2／8；1b型（112份）25．9％（29／112）、17．0％（19／112）、25．9％（29／112）、31．3％（35／112）；2a型（14份）3／14、4／14、5／14、2／14；3a型（11份）3／11、6／11、2／11、0／11；3b型（16份）4／16、11／16、1／16、0／16；6a型（8份）为2／8、2／8、1／8、3／8。在HCV患者中不同基因型的HCV患者的抗体浓度不同，1b、2a、6a型患者抗体浓度分布均匀，1a型患者的抗体浓度（13．65）相对较高，3b型的患者的抗HCV水平（8．77）相对较低，各基因型在不同抗体浓度区间分布率有差异（X2=35．2，P〈0．05）。结论HCV患者的抗体水平与病毒基因型可能存在相关性。由于部分基因型的例数较少，相关性需要更大标本量的研究证实。