食用菌栽培基质中木质纤维素组分测定方法的建立

为建立批量测定食用菌栽培基质中纤维素、半纤维素、酸不溶木质素的方法,在美国国家可再生能源实验室(national renewable energy laboratory,NREL)建立的方法的基础上,对硫酸浓度、反应温度、反应容器进行了调整。将NREL法中0.3 g样品于87 mL 4%(w/w)硫酸中121℃水解的反应体系改为0.1 g样品于10 mL 15.4%(w/w)硫酸中100℃水解,反应容器和加热容器分别由压力瓶和灭菌锅改为离心管和水浴锅。改进后的反应体系可以避免加热过程中酸液溢出,采用离心实现固液分离提高了测定效率。在新的反应体系中,确定了草菇(Volvariella volvacea)、香菇(Lentinula edodes)、金针菇(Flammulina velutipes)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)栽培基质的最适水解时间为1.5 h,刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、灵芝(Ganoderma lucidum)栽培基质的最适水解时间为2 h。通过比较新建立的方法与NREL建立的方法测定的纤维素、半纤维素、酸不溶木质素含量,表明改良后的新方法是可行的。

食用菌多糖作为添加剂在养殖业中的应用

食用菌多糖作为添加剂,对病毒、细菌有较好的抑制作用,可提高机体抵抗力,从而减少抗生素在养殖业的使用。多糖是天然大分子物质,药理作用非常广泛,其独特的活性和低毒效应在临床应用及养殖业中具有极大的潜力。多糖广泛存在于动植物体和微生物中,为生命物质的组成成分之一,近年来国内外已对多种食用菌,如香菇(Lentinula edodes)、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、金针菇(Flammulina velutipes)、猴头菌(Hericium erinaceus)等进行了多糖的提取纯化、分离鉴定及功能等方面的研究。这些食用菌多糖是理想的天然添加剂,且成本低廉,功能广泛,相信将来食用菌多糖在养殖行业的发展前景会越来越好。

覆土细菌在食用菌栽培中的作用

针对食用菌在栽培过程中覆土细菌的作用,重点介绍需要覆土栽培的食用菌种类、不同食用菌覆土的细菌结构组成、动态变化、生物功能以及覆土细菌与食用菌互作的分子机制等。在此基础上,总结并展望覆土微生物组的研究方向、存在问题以及解决办法,为深入研究细菌与食用菌互作分子机制提供参考,同时也为研发食用菌生长促进剂以提高食用菌栽培效益、生物防治剂控制虫害和疾病等提供思路。

暗褐网柄牛肝菌子实体内生细菌群落结构研究

暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)是第一个栽培成功的牛肝菌目(Boletales)真菌,一般采用覆土栽培模式,覆土微生物对子实体的发育具有重要作用,目前的研究主要集中在覆土微生物上,但缺少对子实体内生菌的研究。为揭开暗褐网柄牛肝菌子实体内生菌的组成,本研究基于Illumina MiSeq平台,利用16S rRNA V3~V4区高通量测序进行细菌群落结构分析。结果表明子实体(fruiting body,FB)内部存在很高丰度的细菌,主要以变形菌门(Proteobacteria)为主,在属水平上以贪铜菌属(Cupriavidus)(64.98%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(7.62%)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(6.02%)为主。与覆土(casing soil,CS)基质固有的细菌种群进行比较,VENN分析显示子实体内有468个OTUs为独有,占总序列的26.65%,分类上隶属于贪铜菌属、不动杆菌属和Delftia。FB和CS差异性分析以及Lefse标志性微生物分析均显示贪铜菌属、苍白杆菌属、不动杆菌属、嗜糖假单胞菌属(Pelomonas)等为FB特异性、标志性类群。利用Picrust(Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路预测发现,子实体内生菌群的主要代谢途径为膜传输、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、外源生物降解与代谢,与覆土菌群有20个代谢通路的差异,并且外源生物降解与代谢、信号转导、其他氨基酸代谢、脂质代谢、细胞过程和信号5个通路的比例要高于覆土,微生物类群的差异可能是导致产生这些功能差异的原因。

响应面法优化双孢蘑菇泥炭覆土技术

以双孢蘑菇产量为响应值,采用响应面D-最优设计对双孢蘑菇A15泥炭覆土制作时的含水量(A)、搅拌时间(B)以及泥炭覆土厚度(C)进行优化。结果表明:在3个因素中,B对双孢蘑菇产量的影响最为显著,其次为A和C。AB之间的交互作用强于AC之间的交互作用以及BC之间的交互作用。双孢蘑菇泥炭覆土制作时最佳条件为含水量62.4%、搅拌时间11 min、覆土厚度5 cm。在该条件下,双孢蘑菇两潮菇产量为1 584 g/筐。

构建香菇转化的同源筛选标记的研究

通过比对分析多种导致真菌内源萎锈灵抗性的琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)氨基酸序列的突变位点,将香菇(Lentinula edodes)SdhB氨基酸序列第243位的组氨酸替换为亮氨酸,构建了香菇萎锈灵抗性同源筛选标记载体,以农杆菌介导转化小米粒培养的香菇菌丝。转化子经5次传代后,PCR扩增验证插入片段,并观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况。结果显示:香菇单核体和双核体菌株经转化后,均能筛选到具有萎锈灵抗性的转化子,单核体菌株的转化率为34%,显著高于双核体菌株(4%);单核体转化子中的同源筛选标记及报告基因稳定性较好。本研究构建的萎锈灵抗性同源筛选标记可有效地在香菇遗传转化体系中应用。

香菇自交选育新菌株及其亲本子实体的氨基酸特征及蛋白质营养价值

通过测定粗蛋白和其水解后氨基酸的含量,在现行国际氨基酸模式谱的基础上,以氨基酸评分(amino acid score,AAS)、美国国家科学院医学研究所(IOM)模式评分、化学评分(chemical score,CS)、氨基酸比值系数(ratio coefficient,RC)、氨基酸比值系数分(score of RC,SRC)和必需氨基酸指数(essential amino acid index,EAAI)等指标,对香菇(Lentinula edodes)自交选育新菌株243和申香1504及亲本沪香F2子实体的氨基酸特征和蛋白质营养价值进行分析。结果表明,菌株243和申香1504子实体粗蛋白含量显著低于亲本沪香F2,菌株243子实体的氨基酸总量、必需氨基酸总量与沪香F2相当,3个菌株必需氨基酸/总氨基酸值和必需氨基酸/非必需氨基酸值符合FAO/WHO理想蛋白模式;蛋白中AAS评分、IOM评分、CS评分、SRC值、EAAI值均以243菌株最高。3个菌株的蛋白质校正氨基酸计分(protein digestibility corrected amino acids score,PDCAAS)值在0.54~0.61之间,子代243菌株最高,其次为亲本沪香F2。

灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物抑制脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7产生NO的活性

采用氯磺酸法对灵芝(Ganoderma lucidum)β-葡聚糖进行硫酸化修饰,在不同反应温度下(40、50、60、70、80、90℃)得到灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物(SGLP1~SGLP6),随着反应温度的上升,硫酸化衍生物取代度逐渐增加,反应温度为60℃时取代度最大为1.72,之后随着反应温度上升,取代度逐渐下降;随着反应温度的增加衍生物的重均分子量逐渐下降。灵芝β-葡聚糖衍生物的溶解度为0.901~1.102g/100mL,与硫酸化前相比溶解度提高约50倍。灵芝β-葡聚糖硫酸化衍生物具有抗炎作用,对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO有一定程度的抑制作用,并呈浓度依赖性,且随着取代度增加,抑制率增高;对LPS刺激RAW264.7细胞的吞噬活性也具有显著的抑制作用,且随着取代度增加对细胞吞噬活性的抑制作用增加;取代度相近时,重均分子量较大的硫酸化衍生物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO的抑制率较高以及对细胞吞噬活性的抑制作用也较强,说明硫酸化多糖的体外抗炎活性与其硫酸化衍生物的取代度和重均分子量相关。

一种炭角菌菌丝体生物活性的研究

从一种牛肝菌Boletus sp.中分离得到一株炭角菌菌株,通过液体深层发酵获得菌丝体,并对其粗多糖石油醚和氯仿提取物进行了体外免疫力、抗氧化和抗肿瘤等活性评价。研究结果表明,此株炭角菌的菌丝体石油醚和氯仿提取物抗氧化和提高免疫活力的效果不明显,但炭角菌石油醚和氯仿提取物相对SPCA-1肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性,100μg/m L石油醚和氯仿提取物细胞增殖的抑制率分别达到60.08%和68.41%,而50μg/m L石油醚和氯仿提取物可以分别诱导25.4%和26.3%的SPCA-1细胞发生早期凋亡,并引起P53、Caspase-3和Bax抗肿瘤标志蛋白表达上升和抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,表明两种提取物抗肿瘤效果是通过样品诱导细胞线粒体释放ROS来发挥的。同时,发现炭角菌可以激活细胞自身的保护性自噬,从而降低炭角菌的抗肿瘤活性。以上研究结果将为深入研究和开发以炭角菌为来源的抗肺癌药物提供科学依据。

鲍姆桑黄孔菌化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响及其作用机制的研究

利用胰岛素抵抗HepG2细胞模型筛选具有降血糖活性的鲍姆桑黄孔菌菌丝体化合物,并对其作用机理进行了初步探讨。研究结果表明从鲍姆桑黄孔菌大米发酵菌丝体中分离出的原儿茶醛、柚皮素和黄芩素3种化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量具有明显的促进作用;实时定量PCR分析表明,原儿茶醛对SOCS-3因子mRNA表达抑制效果最好,而黄苓素对TNF-α因子mRNA表达抑制效果最佳。原儿茶醛和黄芩素为鲍姆桑黄孔菌中有降血糖活性的化合物。

桑黄醇提物对MCF7乳腺癌细胞活力和周期改变的影响

为评价桑黄(Phellinus baumii)子实体醇提物对MCF7乳腺癌细胞的影响,用不同浓度醇提物作用于MCF7细胞,用Alamar blue法测定细胞增殖率,显微观察细胞形态变化,用流式细胞术PI染色法和DCF染色法分别检测细胞周期变化和ROS释放量。结果表明:桑黄子实体醇提物使MCF7细胞形态发生明显变化,对MCF7细胞增殖有显著的抑制作用,能引起MCF7凋亡细胞数量升高、降低S和G2/M细胞数量,并呈现浓度梯度依赖性,但ROS实验结果提示桑黄子实体醇提物的促肿瘤细胞凋亡与ROS释放无关。

采用木屑培养基传代的金针菇菌种稳定性

对金针菇(Flammulina velutipes)菌种在木屑培养基上进行连续6次的继代培养,比较不同继代菌种与原始母种的菌丝生长速度、液体发酵pH以及工厂化栽培子实体的相关农艺性状的变化,利用基因组重测序技术检测继代菌种在DNA分子水平的遗传变异。结果显示:与原始母种相比,各继代菌种的表型性状无显著性差异,6次传代菌种的表型性状均稳定。DNA分子水平的遗传分析表明,第1~5次继代菌种基因组中的遗传变异呈缓慢增长趋势。与原始母种相比,第5次继代菌种的遗传差异达到7.92%,其它继代菌种的遗传差异均低于4%。采用木屑培养基进行金针菇菌种的继代培养可有效保持菌种的稳定性。

中国野生蓝莓总花青素对A549细胞活力和周期改变的影响

为了进一步探究中国野生蓝莓的功能特性,本研究从中国野生蓝莓中提取总花青素,并使用XAD-7大孔树脂进行纯化,考察纯化后总花青素提取物对A549细胞平板克隆、增殖、细胞周期、早期凋亡和ROS释放的影响,并初步探讨其作用机理。研究结果表明,中国野生蓝莓总花青素对A549细胞活力有明显的抑制作用,对其增殖抑制的IC50值为176.652μg/m L,对细胞周期也有明显影响并能引起早期凋亡现象以及ROS释放。

真菌中的海藻糖及其在低温逆境下的作用

海藻糖是一种可溶性的非还原性双糖,对真菌具有渗透调节的保护作用。温度是生物体正常生长发育的一个重要影响因素,当真菌受到低温对细胞的损伤时,会通过渗透调节作用来抵御低温逆境。本文综述了海藻糖的结构与特性、代谢调控以及在低温逆境下对真菌的作用。

灵芝子实体醇提取物的毒理研究

本文主要研究灵芝子实体醇提物的毒理学并评价其安全性,利用小鼠急性毒性试验和遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验)对灵芝醇提物的毒性进行考察。试验结果显示,小鼠对灵芝醇提取物的最大耐受量是15 000mg/(kg?bw);灵芝醇提取物在有或无S9的条件下,对鼠伤寒沙门氏菌的突变型菌株TA97、TA98、TA100及TA102均无潜在致突变性;灵芝醇提取物在小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验中均呈阴性反应,不同剂量的样品组与阴性对照组之间无显著性差异。该结果表明灵芝醇提取物基本无毒性,属实际无毒物质。本研究为灵芝醇提取物的产品开发和应用提供了科学研究。

沼渣栽培鸡腿菇初探

以沼气发酵的废弃物沼渣为试材,部分代替鸡腿菇栽培常用栽培料中的玉米芯进行栽培试验,分别考察菌丝生长速度、生长周期、产量以及生物转化率。结果表明:以配方3(60%沼渣,20%玉米芯,13%麸皮,5%玉米粉,2%石膏,含水量63%~65%)栽培鸡腿菇,菌丝生长速度较快,生产周期短,产量和生物转化率最高,并且子实体中镉、汞、铅、砷的含量远低于国家对食用菌中重金属含量的要求,效果理想,可以在规模沼气发酵的地区推广、示范。

基于湖北随州气候条件下香菇菌株品比试验

在随州气候条件以及生产模式下对5个香菇菌株进行筛选,以发菌时间、转色时间、出菇时间、农艺性状以及产量等为筛选考察指标。结果表明:泌阳6号在农艺性状、产量等方面要明显优于其余4个菌株,最适合在湖北随州栽培。

油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺研究及规模化验证

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分之一,前期研究发现油酸可以促进灵芝三萜液态深层发酵下的发酵合成。本研究主要对油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺进行优化,并进行3L发酵罐规模的验证。通过单因素实验考察油酸的添加方式、添加时间和添加浓度对灵芝三萜的影响,结合响应面实验,获得最优工艺条件并进行验证:在发酵第32h添加1.21%高温灭菌油酸,最高灵芝三萜含量为42.69mg/g;在发酵第7h添加1.35%过滤除菌油酸,最高三萜含量为43.38mg/g,分别比对照提高2.04倍和2.08倍。在1000m L摇瓶中添加高温灭菌油酸和过滤除菌油酸,灵芝三萜含量分别为32.18和32.48mg/g,为对照的1.96倍和1.95倍;在3L发酵罐规模下灵芝三萜含量分别为28.66和25.13mg/g,为对照的1.62倍和1.42倍。本研究系统优化了油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺条件,并在与工业生产相对应的3L发酵罐上进行验证。该研究可为灵芝三萜的规模化发酵提供重要参考和借鉴。

利用SSR标记鉴定香菇单核体及杂交后代

【目的】研究简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)分子标记方法用于香菇原生质体单核体、孢子单核体及其杂交后代的分离和鉴定。【方法】利用基于香菇全基因组序列信息开发的SSR标记,分析由香菇品种"L808"双核菌丝制备的原生质体单核体、孢子单核体及其杂交后代的SSR指纹。【结果】对制备的原生质体单核体的鉴定中,在不经过杂交配对的情况下,鉴定出"L808"的两种不同极性的原生质体单核体,其分离比例为191:1,该鉴定结果得到SSR标记、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphismic DNA,RAPD)标记及传统方法的验证。另外,开发的香菇SSR标记还能以多位点组合的方式,用于对孢子单核体及其杂交后代的鉴定。【结论】应用SSR标记可加快香菇单核体的制备进程,并提高鉴定单核体及相关杂交菌株的准确性,促进香菇遗传育种研究。

农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化

【目的】将农杆菌介导的转化应用于重要的工厂化栽培食用菌斑玉蕈中,建立稳定的农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化技术。【方法】将构建的双元载体pYN6982转入农杆菌LBA4404菌株中,以斑玉蕈SIEF3133菌株打碎的双核菌丝为受体材料,利用根癌农杆菌介导的转化方法进行斑玉蕈转化试验。【结果】经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定以及有丝分裂稳定性试验验证,表明潮霉素磷酸转移酶基因(hph)已经整合到斑玉蕈的基因组中;转基因斑玉蕈菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)已经在转基因斑玉蕈菌株中获得了表达;通过PCR检测,随机挑选的8个转基因斑玉蕈菌株中有2个可以扩增出载体转移DNA(T-DNA)边界重复序列外的卡那霉素基因(kan)序列。【结论】获得了稳定遗传和表达的斑玉蕈转基因菌株,建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化方法。农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化中,存在载体T-DNA边界重复序列之外的DNA序列转移到转基因斑玉蕈中的现象,有待进一步研究。