鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响

为分析鸡PPARγ基因的组织表达特性及其在脂肪细胞增殖和分化过程中的功能,文章以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系肉鸡为实验材料,利用Western blotting方法,检测PPARγ基因的组织表达特性及其在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织间的表达差异;采用RNAi技术,在鸡原代脂肪细胞中抑制PPARγ基因的表达后,通过MTT和油红O提取比色的方法,研究鸡PPARγ基因对脂肪细胞增殖和分化的调控作用;利用Real-timePCR和Western blotting技术,分析PPARγ基因表达下调后,其他脂肪细胞分化转录因子以及与脂肪细胞分化相关的重要基因的表达变化情况。结果表明,PPARγ基因在7周龄高脂系肉鸡腹部脂肪组织、肌胃、脾脏、肾脏组织中表达量较高,在心脏中表达量较低,在肝脏、胸肌、腿肌、十二指肠中未检测到表达信号;与高脂系相比,PPARγ基因在5和7周龄低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达量较低(P<0.05);PPARγ基因的表达量下降后,鸡脂肪细胞的增殖能力增强,分化能力减弱;同时,C/EBPα、SREBP1、A-FABP、Perilipin1、LPL、IGFBP-2基因的表达量均下降(P<0.05)。由此可见,PPARγ基因的表达可能与肉鸡腹部脂肪的沉积有一定的关系,该基因可能是调控鸡脂肪细胞增殖与分化的关键因子。

鸡KLF3基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响研究

为研究鸡KLF3(Gallus gallus Krüppel-like factor 3,gKLF3)基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响,利用qRT-PCR检测了其在肉鸡脂肪组织和脂肪细胞中的表达特点,并利用基因过表达技术研究gKLF3基因对脂肪细胞分化的影响。结果显示,gKLF3在2~10周龄肉鸡腹部脂肪组织中持续表达,10周龄高脂肉鸡腹部脂肪组织gKLF3表达量显著高于低脂肉鸡(P<0.05);gKLF3在鸡成熟脂肪细胞的表达量低于前脂肪细胞(P<0.01);体外培养的鸡前脂肪细胞经油酸诱导分化后,gKLF3基因表达量均有低于对照组的趋势;过表达gKLF3基因有抑制脂肪细胞分化,以及抑制C/EBPα、FAS基因表达(P<0.01)的趋势。研究结果表明,gKLF3基因在鸡腹部脂肪组织生长发育过程中发挥重要作用,其可能是通过抑制C/EBPα、FAS基因表达进而抑制脂肪细胞分化实现的。

肉鸡腹脂率双向选择系群体表型数据库(NEAUHLFPD)的设计及其功能实现

表型性状的准确记录及其有效管理和分析是选育优良畜禽品种(系)工作的重要内容。东北农业大学肉鸡腹脂率双向选择系(Northeast Agricultural University High and Low Fat,NEAUHLF)经过20年的选育工作积累了大量与肉鸡脂肪沉积的分子遗传基础研究相关的表型数据。为了有效并系统地存储、管理和分析利用这些表型数据,本研究建立了东北农业大学肉鸡腹脂率双向选择系表型数据库(The NEAUHLF Phenome Database,NEAUHLFPD)管理系统。NEAUHLFPD主要涵盖以下表型记录和信息:1~19世代系谱记录和29项表型数据(分别为鸡体尺性状、体重性状、屠体性状及相应的率性状信息等)。该表型数据库的架构和设计过程具体如下:(1)架构信息。WEB服务器—Apache;数据库—MySQL;数据库管理工具—Navicat;用于动态交互性站点创建的服务器端脚本语言—PHP;超文本标记语言—HTML。(2)结构信息。主界面上有数据库整体组成及功能的详细介绍,以及数据库各部分基本结构的索引按钮。功能模块主要包含两方面内容:第一模块,表型(phenotype)数据的物理存储空间,可实现数据指标的选定、筛选、范围设定和查找等功能;第二模块,表型数据的基本描述性统计计算(descnptlve statlstms),可对条件筛选后的数据进行基本统计量的计算,同时还可实现对筛选数据的按条件排序等功能。NEAUHLFPD不仅能有效储存和管理表型数据,还可以兼容高通量基因组学数据,有利于今后进一步开展鸡脂肪组织生长发育的分子遗传基础研究以及推进低脂肉鸡的选育工作。

HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响

【目的】构建鸡HOPX基因(homeodomain only protein X)全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的c DNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体(p CMV-HA vector),获得HOPX基因的真核表达载体p CMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定p CMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞,瞬时转染p CMV-HA-HOPX,转染6 h时后消化细胞,按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板,并在细胞贴壁0、24、48和72 h,分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响;同时,利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA,并反转录合成c DNA,采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因Cyclin D1和PCNA的m RNA表达。【结果】测序结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp,与NCBI发布的鸡HOPX基因m RNA序列(NM_204556)一致;利用HA标签抗体的Western blotting分析显示,真核表达载体p CMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子(约9.5k D),表明鸡HOPX基因的真核表达载体p CMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现,转染p CMV-HA-HOPX载体的细胞(HOPX过表达组)在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染p CMV-HA vector空载体(空载体对照组)的细胞数量;CCK-8检测分析发现,转染p CMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值(OD值)在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组(P<0.01)。与细胞增殖检测结果相一致,细胞增殖标志基因表达检测分析发现,在细胞贴壁后培养24 h后,HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的m RNA表达量显著低于空载体对照组(P<0.05);在细胞贴壁后培养48 h时,HOPX过表达组的PCNA基因的m RNA表达量显著低于空载体对照组(P<0.05);在细胞贴壁后培养72 h时,HOPX过表达组的PCNA和Cyclin D1基因的表达量均极显著低于空载体对照组(P<0.01)。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。

鸡Perilipin1基因启动子的克隆及分析

旨在研究鸡脂滴包被蛋白基因(Perilipin1,Plin)启动子的结构及特征。本研究采用PCR方法扩增了鸡Perilipin1基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,并对其进行了克隆、测序及生物信息学分析;同时,构建了其全长及系列截短突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1),用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性,确定了该基因的核心启动子区域。生物信息学分析结果表明,鸡Perilipin1基因的启动子区不存在典型的TATA box结构和CpG岛,但可能存在TFIID、Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等多个转录因子结合位点;报告基因分析结果表明,本研究克隆的鸡Perilipin1基因启动子能够极显著地启动报告基因的表达(P<0.01),并且随着启动子片段由5′端逐渐截短,报告基因活性表现出逐渐增强的趋势,其中-360/-11片段具有最强的报告基因活性。综上表明,鸡Perilipin1基因-360/-11区域的启动子片段具有最强的转录活性,包含该基因的核心启动子序列。

鸡mir-17-92基因簇的结构、功能及其调控

mir-17-92基因簇(mir-17-92cluster)是脊椎动物的一个保守miRNA基因簇,在哺乳动物细胞增殖、分化、凋亡及发育等多种生物学过程中起重要的调控作用。同时,mir-17-92基因簇又是一个癌基因,在多种肿瘤中表达。尽管对mir-17-92基因簇的研究非常广泛,但其作用机制还不完全清楚。鸡mir-17-92基因簇的结构组成特点、功能及其作用机制尚未见研究报道。该文根据同一miRNA基因簇的miRNAs在功能上相关的特点,以鸡mir-17-92基因簇序列为研究对象,采用生物信息学研究方法和手段,开展了鸡mir-17-92基因簇的基因组结构、miRNAs序列组成、靶生物学过程和信号通路以及miRNAs结合位点分布特点等分析研究。结果发现,鸡mir-17-92基因簇调控MAPK、Wnt和TGF-β等多个重要细胞信号通路;miRNA结合位点分布分析显示,该miRNA基因簇多个成员共同作用于同一个靶基因,提示该基因簇的miRNAs成员以组合和协同的方式调控靶基因。该研究为深入了解mir-17-92基因簇如何调控癌症和发育中的关键细胞过程奠定了基础。

脂滴包被蛋白对鸡前脂肪细胞脂质蓄积的影响

目的:探讨脂滴包被蛋白(perilipin 1)对鸡前脂肪细胞脂质蓄积的影响。方法:首先构建pcDNA3.1-perilipin 1基因真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,24h后添加油酸诱导前脂肪细胞分化。然后利用Western blot方法检测perilipin 1的表达;利用油红O提取比色法研究perilipin 1对鸡前脂肪细胞脂质蓄积的影响;利用Real-time RT-PCR方法分析其他与脂类代谢相关的重要基因(FAS、ACC、ATGL)的表达变化。结果:转染pcDNA3.1-perilipin 1基因真核表达载体能明显上调perilipin 1的表达。perilipin 1表达量升高后,鸡前脂肪细胞脂质蓄积能力增强,但其他与脂类代谢相关的重要基因(FAS、ACC、ATGL)的表达量没有发生明显的变化。结论:过表达perilipin 1促进鸡前脂肪细胞的脂质蓄积。

动物转录因子相关数据库研究进展

转录因子是真核生物中调控基因转录的一类重要的反式作用因子。目前,对动物群体的转录因子已经开展了较为深入的研究,科研人员不仅通过实验证实而且利用生物信息技术预测了全基因组范围内的转录因子,并基于上述数据构建了多个专用的二级数据库。概述了8个应用于动物群体的转录因子数据库,以期为进一步探明转录因子调控动物相关基因转录的分子机制提供理论基础。

鸡FABPFABP2基因单倍型与生长和体组成性状的相关分析

为探讨鸡FABP2基因多态性对肉鸡生长和体组成性状的影响,以东北农业大学F2资源群体为试验材料,对鸡FABP2基因3个多态性位点（c.601A＞T,c.1018C＞T和c.3267G＞A）利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法进行基因型分析,利用3个多态性位点基因型信息构建单倍型并分析单倍型与鸡生长和体组成性状的相关性.结果：FABP2基因3个多态性位点构建的单倍型对鸡2～12周龄体重、龙骨长和4周龄跖骨长有显著影响（P＜0.05）;对8和10周龄跖骨长、跖骨围、胸宽、腹脂率、胫骨长有一定的影响（P＜0.2）.由此推断：影响鸡体重和骨骼性状的QTL可能位于此单倍型区域内,ACG单倍型为提高体重和骨骼性状的有利单倍型.

鸡HOPX基因的克隆及表达分析

前期研究发现,HOPX基因在鸡脂肪组织高表达,为了解该基因在脂肪发育过程中的作用,采用RT-PCR方法,扩增和克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并进行序列分析;采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法,开展了HOPX基因的组织表达谱分析、HOPX基因在东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系脂肪组织发育过程中的表达差异分析以及鸡脂肪细胞分化过程中的表达分析。研究结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区为222 bp,编码73个氨基酸。HOPX基因在鸡的多种组织中表达,其中,在脂肪组织中的表达量最高;在高、低脂系肉鸡的脂肪组织生长发育过程中,HOPX基因的表达均随年龄增长而上升,且高脂系鸡HOPX基因的表达量高于低脂系;在鸡脂肪细胞分化过程中,HOPX基因的表达呈上升趋势。HOPX基因的表达分析结果提示,该基因在鸡脂肪组织生长发育过程中发挥作用。

肉鸡腹脂双向选择系中RNA编辑位点的鉴定研究

旨在准确获得肉鸡腹脂双向选择系脂肪组织中的RNA编辑位点信息,进而为脂肪相关研究提供更多的信息来源。本研究以东北农业大学肉鸡高、低腹脂双向选择品系第十九世代肉鸡为试验材料,使用转录组测序(RNA-seq)和基因组测序数据识别肉鸡腹部脂肪组织RNA编辑位点。通过生物信息学手段,设定严格的数据过滤与筛选策略,构建RNA编辑位点候选集。结果表明,在候选集中,通过对RNA编辑位点的分类和注释,在低脂系肉鸡脂肪组织中发掘转换型RNA编辑位点28个,颠换型RNA编辑位点101个,插入缺失型RNA编辑位点71个;在高脂系肉鸡脂肪组织中,发掘转换型RNA编辑位点30个,颠换型RNA编辑位点84个,插入缺失型RNA编辑位点77个。绝大多数RNA编辑位点落在内含子、基因间区域及基因上游区域(内含子区41.91%,基因间区域33.08%,基因下游20.59%,基因上游2.94%和外显子区1.47%)。试验验证了4个候选RNA编辑位点,其中3个位点落在与脂肪形成有重要关系的ATP1B3、SLC6A6和FLNB基因区域。本研究鉴定和验证了存在于肉鸡脂肪组织中的RNA编辑位点,为进一步研究RNA编辑影响脂肪组织生长发育的分子机制奠定了基础。

TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响

实验旨在研究TCF21基因在鸡前脂肪细胞增殖过程中的功能。以鸡永生化前脂肪细胞系(ICP1)和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞为实验材料,首先利用qRT-PCR实验方法分析TCF21在ICP1细胞和鸡原代前脂肪细胞增殖过程中的表达规律,其次利用CCK-8比色法研究过表达和干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖过程中细胞数的影响,最后利用qRT-PCR实验方法分析细胞增殖过程中标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的表达情况。结果表明:TCF21基因在ICP1细胞和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞的增殖过程中均呈下降趋势;过表达TCF21基因抑制鸡前脂肪细胞的增殖,且细胞增殖标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的mRNA表达水平下调;干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖无明显影响。综上所述,TCF21可能对鸡前脂肪细胞的增殖有一定的抑制作用。

绵羊Dlx3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联

【目的】通过开展绵羊Dlx3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示Dlx3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制。【方法】采用PCR扩增Dlx3基因起始密码子上游1.5 kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析Dlx3基因启动子活性,采用测序方法寻找Dlx3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型。【结果】①Dlx3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②Dlx3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③Dlx3基因启动子的-1 551—-1 108 bp与-1 108—-707 bp区域对启动子活性影响较大;④Dlx3基因启动子区SNP位点(G-1166A)多态性与羊毛卷曲度显著相关。【结论】①Dlx3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②Dlx3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是Dlx3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③Dlx3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记。

鸡转录因子C/EBPα、KLF2、KLF3、KLF7、PPARα对L-FABP启动子活性的影响

L-FABP是脂肪酸结合蛋白家族重要的成员。研究发现L-FABP在不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、胆固醇、胆汁酸等转运过程中扮演重要角色。目前,对哺乳动物L-FABP的活性调控机制的研究已经取得了一定进展,但在禽类上的相关报道还比较少见。为探讨鸡L-FABP基因的表达调控机制,本研究利用报告基因方法在人肝癌细胞系(HEGP2)中研究C/EBPα、KLF2、KLF3、KLF7、PPARα基因对鸡L-FABP基因启动子活性的影响。结果表明:C/EBPα显著抑制了鸡L-FABP基因的表达,KLF2、KLF3、KLF7、PPARα基因显著促进了L-FABP基因的表达,这些结果为深入研究鸡L-FABP基因表达调控机制奠定了基础。

BMP2基因在脂肪形成过程中的功能研究进展

骨形态发生蛋白2(BMP2)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,是一种分泌性蛋白,具有多重生物学功能。BMP2基因不仅可以诱导骨细胞的形成,还可以促进间充质干细胞向脂肪细胞分化,在脂肪的形成过程中发挥着重要作用。就该基因的结构、表达及其在诱导脂肪细胞形成方面的功能等进行综述。

DNA甲基化与脂肪组织生长发育

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方式,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。DNA甲基化最重要的作用是调控基因表达,它是细胞调控基因表达的重要表观遗传机制之一。近年来的研究发现,DNA甲基化在脂肪组织生长发育以及肥胖症发生过程中发挥着重要作用。DNA甲基化通过调控脂肪细胞分化转录因子、转录辅助因子以及其他脂肪代谢相关基因的表达,从而调控脂肪组织的生长发育。该文综述了脂肪组织生长发育过程中DNA甲基化的最新研究进展,探讨了脂肪组织DNA甲基化的研究趋势和未来发展方向。

人乳头瘤病毒癌基因诱导细胞永生化的研究进展

永生化细胞是研究细胞增殖、分化、凋亡及衰老等的理想细胞模型。目前人类已建立多种细胞永生的方法,其中人乳头瘤病毒(HPV)癌基因(E6和E7)被广泛用于永生化细胞研究。E6蛋白和E7蛋白主要通过灭活p53通路和pRb通路,从多个水平提高端粒酶的表达和活性,使细胞逃过细胞复制衰老而继续增殖,实现细胞永生化。综述人乳头瘤病毒癌基因E6和E7的最新研究进展,探讨未来研究的趋势和研究方向。

DNA与蛋白质的相互作用及其生物学研究方法

DNA和蛋白质是构成生物体最为重要的两类生物大分子,两者特异性或非特异性识别及相互作用在整个基因组表达调控过程中发挥着重要的作用,是了解生命活动基本过程的分子基础。为此,从DNA与蛋白质相互作用的概述及其作用形式入手,对目前应用较多的几种分子生物学检测方法,如电泳迁移率变动分析(EMSA)、DNase I足迹法(DNase I footprinting)、酵母单杂交技术(Y1H)以及染色质免疫沉淀技术(Ch IP)的原理、优缺点、优化方法及其最新应用等进行了综述。