大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。

大豆MPBQ-MT基因的克隆与生物信息学分析

以大豆品种合丰25和Bayfield为材料,克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMTase)基因,获得1 029 bp的MPBQ-MT基因c DNA序列。通过序列比对发现10个大豆MPBQ-MT基因c DNA区内的潜在SNP位点。采用生物信息学方法分析MPBQ-MT基因编码的氨基酸序列和蛋白质结构。结果表明:MPBQ-MT基因CDS区共编码342个氨基酸,其中缬氨酸(Val)含量最多,占该基因编码氨基酸总数的8.8%;半胱氨酸(Cys)含量最少,占该基因编码氨基酸总数的1.2%;MPBQ-MT蛋白N端包含由58个氨基酸组成的叶绿体转运肽,为亲水性蛋白质。合丰25与Bayfield的MPBQ-MT蛋白质二级结构有所不同,2个品种的MPBQ-MT蛋白质中α-螺旋分别约占25.44%和27.49%,β-转角分别约占9.36%和9.06%,无规则卷曲分别约占40.35%和38.60%。2个品种的MPBQMT蛋白质中片层结构均约占24.85%。两个品种的MPBQ-MT蛋白质均有1个S-腺苷基甲硫氨酸结合位点。对MPBQ-MT蛋白三级结构进行预测,发现去掉转运肽后,MPBQ-MT蛋白质三级结构主要由11个连续的α-螺旋区域和8个连续的片层结构区域组成。结合MPBQ-MT蛋白三级结构对MPBQ-MT基因的生物学功能进一步分析,提出了较为合理的MPBQ-MT作用模型。由系统发生树可知MPBQ-MT蛋白在大豆与菜豆中的亲缘关系较近。

大豆维生素E遗传图谱构建及QTL分析

在黑龙江省三地点对合丰25和Bayfield杂交后的144个重组自交系群体的维生素E中各个成分进行QTL分析。结果发现在哈尔滨共得到8个与维生素E含量相关的QTL,在呼兰共得到9个与维生素E含量相关的QTL,在绥化共得到11个与维生素E含量相关的QTL。通过分子辅助育种法筛选出11个高维生素E含量的品系。

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。

转基因大豆育种

大豆在中国具有古老的种植历史,同时中国也是重要的大豆发源地。大豆及其产品已经成为日常生活中必不可缺的一部分,无论在工业上还是人们对饮食的需求。目前大豆常规育种的速度不能完全的满足人们对于大豆的需求,转基因技术的应用对大豆育种起到了促进作用,能够更好的满足人们对于抗病虫害、抗逆、高品质大豆的需求。

大豆四向重组自交系群体蛋白质含量与油分含量QTL定位

蛋白质和油分含量是大豆重要的育种目标,蛋白质和油分含量QTL定位和优异等位变异的发掘对大豆分子设计育种具有重要意义。本研究以（垦丰14×垦丰15）×（黑农48×垦丰19）衍生的后代株系为材料,构建含有204个株系的大豆四向重组自交系群体,利用区间作图法,应用前期构建的SSR遗传图谱,对2013、2014和2015年在哈尔滨和克山2地共8个环境下的蛋白质和油分含量进行QTL定位分析。结果表明,8个环境中检测到29个蛋白质含量QTL和39个油分含量QTL。在所定位的蛋白质含量QTL中,有5个能够在2个以上环境被定位到,这些蛋白质含量QTL分布在A1、D2、J、N和O等6个连锁群上,对表型效应的贡献率为7.65%~20.08%,其中q PC-A1-1、q PC-D2-1、q PC-J-1和q PC-O-2的贡献率在10%以上。在39个油分含量QTL中,有10个在多环境下被重复检测到,这些QTL分布在8个（A1、A2、B1、D1b、G、I、J、N）连锁群上,对表型效应的贡献率为7.30%~25.68%,其中q OC-A2-1、q OC-B1-1、q OC-G-1和q OC-J-1的贡献率在10%以上。

轮回选择创新高蛋白质含量大豆种质资源

以蛋白质含量较高的D95-753-754、克辐9807-2、黑生101、克辐05-1480为亲本材料,在田间先以产量性状、农艺性状为主要指标优先择优,在室内再以蛋白质含量为指标进行二次择优的选择方法,主要经过三轮杂交、选择和鉴定,逐轮进行蛋白质含量、熟期、百粒重等农艺、产量、品质性状的协同优化,实现了这些性状的同步改良;各轮次育成的品系蛋白质含量不断提高,与主栽品种的产量差距不断缩小,提高了育成的新种质克交11-1615和克交11-1669的育种利用价值。在研究的过程中,坚持不同育种方法获得的中间材料和每一轮次杂交优选出的中间材料的持续利用,聚合了不同来源亲本高蛋白基因;利用基因的加性效应,部分组合实现了超亲遗传。创新了高蛋白育种方法和选择策略。选育出了生育日数115 d(克山)、蛋白质含量46.5%(高于多个亲本)、百粒重19 g大豆新品种质克交11-1615和生育日数105 d(克山)、蛋白质含量44.5%、百粒重20 g的大豆新种质克交11-1669。

大豆分子标记研究新进展

随着功能基因组学和高通量测序技术的发展和应用,以分子标记辅助选择育种和转基因育种为主要手段的生物育种技术越来越引起大豆育种家的重视。特别是伴随着新技术手段(如e QTL分析、GWAS分析、RNA-seq等)的发展,分子标记和QTL研究越来越趋向于高通量新标记开发、QTL精细定位以及新分析方法的应用等方面,进而推动了优质、多抗大豆新品种的培育,加快了大豆育种进程。为此,就2013年国内外大豆分子标记技术及其应用研究进展进行综述。

大豆蛋白和油分含量的QTL分析

以东农47和PI317334-B杂交衍生的136个F4∶8代重组自交系（RILs）为对象,对其蛋白和油分含量进行正态分布检验及分析,同时利用182个SSR标记构建遗传图谱,并定位分别与大豆蛋白和油分含量相关的QTL,为深入改良及培育优质的大豆新品种提供了重要依据。结果表明：RILs在蛋白与油分含量的表型上的变异系数较大,分离程度好,且基本上呈正态分布;共检测到9个QTL,其中与蛋白含量相关的QTL有3个,分别位于N、C1和B2染色体上的标记SSR03_0428、SSR04_1192和SSR14_1153附近,贡献率范围为7%~8%;与油分含量相关的QTL有6个,分别位于C2、B1、B2、D2、G和I染色体上的标记SSR06_1630、SSR11_0460、SSR14_0395、SSR17_0721、SSR18_0278和SSR20_0273附近,贡献率变化范围为7%~43%。

氮肥施用量对超早熟大豆源库关系、产量和品质的影响

为研究施氮量对超早熟大豆生长发育及产量和品质形成的影响,通过设置不同施氮量,测定了超早熟大豆品种‘黑河44’不同生长阶段源和库各器官的变化。结果表明,随着施氮量的增加,产量和蛋白质含量提高,油份含量下降。增施氮肥均可以提高从苗期至鼓粒期的叶鲜重积累速度,降低叶片的老化和脱落速度,在鼓粒期前,增施氮肥可以促进叶干重的增加。在苗期降低茎鲜重,花期和鼓粒期增加茎鲜重,在全生育期均促进茎干重提高。增施氮肥从全生育期降低根干重的增加速度,在花芽分化期至结荚期提高根鲜重增加的速度,在鼓粒期和完熟期降低了根老化的速度。增施氮肥时,提高鲜荚皮重量的增加,荚皮干重的积累量减少。籽粒鲜重和干重随施氮量的增加,积累速度加快。

转GmGT-2B基因大豆的耐盐性分析

采用盆栽试验方法,苗期在盐胁迫条件下,比较GmGT-2B转基因大豆与非转基因大豆的损伤程度、超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、脯氨酸和K^+、Na^+含量以及基因表达量变化差异。结果表明:盐胁迫对转基因大豆叶片的伤害程度明显低于对照;SOD活性、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量在盐胁迫5 d后均与对照有显著或极显著差异;植株的Na^+含量随盐胁迫时间的增加而升高,在胁迫第8天转基因大豆的Na^+含量达到对照约2倍;转基因大豆的基因的表达量呈上调趋势,在第8天达到表达高峰。基因表达量的变化趋势与生理指标SOD活性、脯氨酸含量和Na^+含量表现的一致。结果表明GmGT-2B基因与盐应答反应有关,其中转GmGT-2B大豆株系N11和N24盐害程度较低,该基因和转GmGT-2B基因大豆具有较大的应用价值。

大豆GmMP基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥AtMP(ARF5)在大豆中的同源基因,获得了GmMP基因序列。对GmMP基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:GmMP基因CDS序列全长2 802 bp,编码933个氨基酸。GmMP编码的蛋白为疏水性蛋白。结构域分析表明:GmMP含有B3和AUXIN RESPONSE FACTOR结构域,同时该基因是ARF家族的成员。GmMP预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、生物钟调控和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明MP在豆科植物进化过程中比较保守。组织特异性表达分析结果显示GmMP在叶片中表达量最低,在茎尖中表达量最高,推测其可能参与生长素的代谢途径。

大豆四向重组自交群体单株产量QTL单标记分析

以（垦丰14×垦丰15）×（黑农48×垦丰19）衍生的含160个株系的大豆四向重组自交系群体为试验材料，应用154个SSR标记鉴定个体基因型，利用单标记分析方法，对2013和2014年在哈尔滨和克山两地4个环境下的单株产量进行QTL定位分析。结果显示：共检测到46个与单株产量相关的QTL位点，主要分布在A1、A2、C1、C2、D2、D1b、L、K、B2、N、E、J、F、G和H连锁群上，遗传率为0.15%~9.37%。遗传率较高的标记位点有BARCSOYSSR_02_0607、BARCSOYSSR_03_1620、BARCSOYSSR_19-0451、Sat_153、Sat_367、Satt229和Satt529，优异等位基因型为BARCSOYSSR_02_0607（Q1Q1）、BARCSOYSSR_03_1620（Q2Q2）、BARCSOYSSR_09_0183（Q1Q1）、Satt229（Q2Q2）、Sat_367（Q3Q3）、Satt338（Q1Q1）、Satt229（Q1Q1）和Satt668（Q1Q1）。在检测的标记位点中，BARCSOYSSR_08_0966、Sat_36、Sat_153、BARCSOYSSR_02_0607和Satt529在两个环境中重复检测，表明这5个QTL可用于分子设计育种改良单株产量。

大豆小片段法HRM基因分型体系优化

应用高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve,HRM）技术进行基因分型简单有效,灵敏度高、特异性强。优化并建立基于HRM的大豆SNP基因分型体系,是准确进行SNP研究的前提和基础。本研究利用添加内标后的小片段法进行SNP基因分型体系优化研究,结果表明在设计SNP引物时,最好使其PCR产物长度为50～80bp,熔解温度在72～82℃,Tm值介于55～62℃之间;10μLPCR反应体系中应包含25ngDNA模板,0.6pmolSNP引物,1μLLCGreen染料;PCR反应后,应在各点样孔分别加入3pmol的高、低温内标,然后进行变性处理和HRM分析。同时利用建立的基因分型体系对重组自交系群体（RIL）进行了基因分型检测,能完全将其分成亲本的两种基因型,提高了SNP基因分型的准确性和效率。本研究建立的SNP基因分型体系为今后进行大豆SNP标记开发、高密度遗传图谱构建、QTL定位等研究提供了基础。

大豆光周期效应GmGBP1基因启动子多态性分析

GmGBP1基因是植物开花途径中的重要基因,其启动子也受到短日照条件的强烈诱导。但是目前大豆GmGBP1基因启动子序列的多态性变异以及其与开花期的关系还不清楚。本试验对开花习性不同的36份大豆种质资源的GmGBP1基因启动子序列进行了克隆测序,发掘了GmGBP1基因启动子序列的自然等位变异,探讨了GmGBP1基因启动子序列的自然变异与开花期的关系。研究结果表明,多态性位点SNP-796与开花期密切相关,其中SNP-796G为缩短大豆生育时期的优异等位变异。主要的3个单倍型与开花期也表现出极显著(P<0.01)的相关性,单倍型2和单倍型3为缩短大豆花期的优异单倍型。

大豆GmGBP1启动子受激素和外源环境诱导的研究

采用PCR方法克隆大豆光周期GmGBP1基因启动子,构建含有GmGBP1启动子驱动报告基因GUS的融合性表达载体pBI121-pGmGBP1::GUS,通过花序浸泡法,转化野生型拟南芥获得pBI121-pGmGBP1::GUS转基因植株,对T3代转基因拟南芥进行GUS染色,研究了GmGBP1启动子受激素和外源环境诱导的表达规律。结果表明:大豆GmGBP1启动子受水杨酸(SA)和干旱(PEG)以及高温等外源环境的诱导,与生物信息学预测GmGBP1启动子序列存在的逆境胁迫响应元件的结果相一致。

黑龙江省野生大豆疫霉根腐病抗病性评价

利用离体叶片接种法对黑龙江省的620份野生大豆资源进行了大豆疫霉菌1号生理小种的抗病性鉴定,获得抗病资源55份,占总数的8.87%;中间型资源237份,占总数的38.23%。对在1号生理小种鉴定过程中表现为抗病及中间型的资源进行了大豆疫霉菌3号、4号生理小种的抗病性鉴定,获得抗3号生理小种资源52份;抗4号生理小种资源62份。同时,获得兼抗资源27份,其中双抗资源23份,三抗资源4份。鉴定获得的抗病资源可为大豆抗疫霉根腐病育种提供基础。

转基因科普系列——转基因大豆

大豆是世界重要的粮食兼油料作物，也是人类优质蛋白的主要来源。大豆种子主要的营养物质是蛋白质和脂肪，两者约占大豆种子干重的60％。大豆是蛋白质含量较高的作物之一，

大豆GmAYI基因的克隆及初步功能预测

根据拟南芥At1G74730基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术在大豆中克隆得到GmAYI基因。对GmAYI基因的结构域和启动子元件进行分析,结果表明:大豆GmAYI基因位于4号染色体上,含跨膜结构域,属于膜蛋白。该基因启动子区域含有激素相关应答元件和胚乳表达所必须的顺式作用元件。推测该基因可能参与调控大豆生长发育及外界环境胁迫应答等过程。进而对14个大豆品种中GmAYI基因的转录水平进行了定量分析,对GmAYI基因在14个大豆品种中的转录水平与单株粒数、单株粒重、百粒重、株高等产量相关性状进行相关性分析,结果表明:GmAYI基因的表达量与百粒重呈显著负相关,推测GmAYI可能是参与大豆产量相关性状调控的基因。

大豆转基因技术

大豆既是粮食作物,又是经济作物,营养价值高。目前我国大豆产量和品质都不能满足人们的需求,迫切需要新品种的选育。大豆转基因技术的出现解决了常规育种中存在的育种年限长,远缘杂交不亲和及重组几率低等困难,在提高产量、抗性育种以及缩短育种周期等方面都有着极其显著的优势。文章概述大豆转基因技术常用方法:农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法和花粉管通道法,并简要介绍了该技术在培育抗病虫、高油、高蛋白的大豆新品种上的应用。