生命科学与人类疾病研究的重要模型——果蝇

黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)是生物学研究中最重要的模式生物之一,它在遗传的染色体理论建立中起到非常重要的作用。由于果蝇自身独特的优势,20世纪70年代以来,它又在发育生物学、神经科学、人类疾病研究等领域得到广泛应用,作出许多新的重要贡献。果蝇在神经退行性疾病研究中是非常有用的模型。可以预期,随着研究手段的丰富及科学的发展,果蝇将作为一种理想的模式生物在生物医学中发挥更大的作用。

SR蛋白研究进展

在真核生物众多拼接因子中 ,SR蛋白家族是一类重要的成员 ,它们与一些特定的RNA序列结合 ,帮助识别并选择正确的 5′及 3′拼接位点 ,与其它的拼接因子共同完成拼接任务 ,在决定组织细胞的特异性及个体发育的阶段性方面发挥着关键作用。本文就近 10年来有关SR蛋白的结构和功能的研究进展作一综述。

一中国遗传性血色病家系的HFE基因突变分析

目的以一个有2例遗传性血色病(HH)患者的中国家系为研究对象,初步探讨HH的发病原因。方法记录患者临床资料,采集患者家系成员的外周血,提取全血基因组DNA,针对已报道的血色病基因(HFE)C282Y,H63D和S65C 3个突变位点部位设计引物、PCR扩增并测序以筛检突变。结果14位家系成员中仅1位无症状的成员有H63D杂合突变,占7.14%,其他13位成员(包括已故的先证者和重病患者)均未发现C282Y,H63D和S65C突变。结论C282Y,H63D和S65C基因突变不是该家系的患病原因。HH的发病机制有待进一步研究。

丙型肝炎病毒NS5A区与干扰素敏感性间关系的研究

日本学者首先发现丙型肝炎病毒 NS5 A区存在干扰素敏感决定区 (ISDR) ,可预测干扰素疗效 ,但随后西欧学者的多项研究并不支持此观点。本文对 ISDR与干扰素疗效、病毒滴度、准种选择性的关系以及 ISDR的体外研究等方面的现状进行了综述。

CK19、CK20 mRNA在上皮性恶性肿瘤患者外周血中的表达及其意义

目的 :分析上皮性恶性肿瘤患者外周血中CK19、CK2 0mRNA的表达水平 ,探讨其临床病理意义。方法 :随机选择和收集 5 3例上皮性恶性肿瘤患者的外周血 ,应用巢式RT PCR法联合检测其CK19、CK2 0mRNA表达情况。另取 15例上皮性肿瘤组织为阳性对照 ,15例非肿瘤患者外周血为阴性对照。结果 :5 3例肿瘤患者外周血中CK19阳性率为 3 5 .8% (19/5 3 ) ,CK2 0阳性率 41.5 % (2 2 /5 3 ) ,两者至少 1项阳性者 69.8% (3 1/5 3 )。 15例肿瘤组织中CK2 0阳性率为 10 0 % (15 /15 ) ,CK19阳性率 86% (13 /15 ) ;15例阴性对照CK19阳性 2例 ,CK2 0阳性 1例。结合肿瘤的临床病理资料分析 ,肿瘤患者外周血CK19、CK2 0mRNA阳性表达与肿瘤浸润深度、临床分期及淋巴结转移间存在明显的相关性 ,而与肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤分化程度无明显相关。结论 :CK19、CK2 0mRNA可作为检测上皮性肿瘤外周血微转移的靶基因。联合检测肿瘤患者外周血CK19、CK2 0mRNA可增加外周血循环癌细胞的检测率。

RNAi及DNA芯片分析肝癌细胞系中受DNMT3B调控的下游基因(英文)

为揭示DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)在肝癌中是否参与了肿瘤的发生,应用Westernblotting及细胞免疫化学方法分析DNMT3B蛋白在人的正常肝细胞株、肝癌癌旁细胞株及肝癌癌细胞株中的表达。构建了DN-MT3B的RNAi稳定表达的重组载体,并转染入肝癌细胞株SMMC-7721中。以半定量RT-PCR及Westernblot-ting分别鉴定DNMT3BRNAi表达载体对内源性DNMT3B的抑制效率。用高通量的cDNA基因芯片分析了SMMC-7721中DNMT3B抑制后有影响的下游基因谱。结果显示,DNMT3B在肝癌细胞株中的表达水平明显高于肝癌癌旁和正常肝细胞株。DNMT3B的RNAi稳定表达重组载体转染SMMC-7721细胞株2个月后,观察到DNMT3B明显受到抑制。cDNA基因芯片分析发现,DNMT3B抑制后诱导26条基因表达下调,115条基因表达上调,包括一些发育相关基因以及肿瘤相关基因,如SNCG、NOTCH1、MBD3、WNT11、MAOA、FACL4等。提示DNMT3B的高表达可能与肝癌的发生有关,并以调控其他相关基因的表达而起作用,包括与发育相关的重要基因。

血液透析患者丙型肝炎病毒型特异性PCR基因分型

目的 建立一种丙型肝炎病毒型特异性PCR基因分型方法。方法 对 4 7份血液透析患者HCVRNA阳性的标本 ,用 5′非编码区 (5′ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物 ,进行逆转录巢式PCR扩增分型。结果 4 7份HCVRNA样本 4 3例可以分型 ;优势株为 1b亚型 ,1b及 1b相关型占总样本数的 87.2 3% (4 1 / 4 7) ;7例为混合感染 ,占可分型数的 1 6 .2 7% (7/ 4 3)。结论 本组血液透析患者感染的HCV基因型的分布可能与地区流行及医源性传播有关 。

应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA

目的 :探讨荧光定量PCR(FQ PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒 (HCV)含量的敏感性、特异性。方法 :采用FQ PCR和逆转录巢式PCR同步检测 76份HCV抗体阳性血清标本 ,并对两种方法的检测结果进行对照比较。结果 :FQ PCR定量HCVRNA拷贝数在 10 2 ～10 6拷贝·μl-1,其中低于 10 3 拷贝·μl-1占 2 0 .93 % ,10 3 ～ 10 5拷贝·μl-1占 60 .47% ,高于 10 5拷贝·μl-1占 18.60 %。 76份HCV抗体阳性血清中 ,巢式PCR检测阳性为 45份 ,FQ PCR检测阳性为 43份 ,二者相对符合率为 97.3 7%。结论 :FQ PCR检测HCVRNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致。

丙型肝炎病毒型特异性聚合酶链反应基因分型的临床应用

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)基因型在不同人群中的分布规律及流行优势型。方法 分别对健康体检者、住院患者和血液透析患者抗HCVIgG阳性标本 ,用自行设计的 5’非编码区 (5’ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型。结果 3组人群中血液透析患者HCV感染率最高 ,抗HCVIgG和HCVRNA阳性率分别为 5 5 .37%和 38.84%。基因型以 1b亚型为主 ,1b及 1b的相关型占 91.6 7%。结论 本地区HCV流行优势型为 1b亚型。

两种β2m重组质粒的构建及其表达与纯化

目的获得大量有活性的人β2m重组蛋白,为构建HLA与抗原肽的复合体及HLA四聚体作准备。方法采用RTPCR克隆法构建重组质粒,于BL21(DE3)菌中原核表达后,经金属螯合亲和层析纯化,BCAProteinAssayKit测定蛋白含量,应用SDSPAGE观察重组蛋白表达情况及Westernblot分析重组抗原的活性。结果成功地构建了两种融合表达载体PET22bβ2m及PET28aβ2m,两者的表达量分别为5～10mgL,40～80mgL,纯度均为95%。结论通过比较,确定了β2m最佳表达载体系统及表达条件,为研究轻链在原核系统中表达、纯化以及构建HLA复合体,探讨免疫识别机制奠定了基础。

棕色固氮菌nifS敲除菌株的构建

从Azotobacter vinelandii中通过PCR扩增了5’和3’端分别缺失264bp和261bp的nifS′片段,克隆至载体pUC18,形成重组质粒pUCS,再通过同源重组的方法,将pUCS插入Azoto-bacter vinelandii的nifS中,形成nifS阻断突变体SU1,经Southern杂交和PCR扩增,证明所得确为nifS阻断突变株。SU1在外加氮源的BBGN培养基中能够快速生长,但在Burk's无氮培养基中,生长却极其缓慢,表明nifS基因的破坏,已造成SU1的固氮能力接近完全丧失。该突变体的成功构建,为进一步从中纯化固氮酶两组分,研究nifS对固氮酶结构及功能的影响及iscS与nifS之间的关系奠定了良好的基础。

MHC基因多态性和肿瘤的发生

人类主要组织相容性复合物 (MHC)是一段约 3 6Mb的染色体区段 ,有 2 2 0多个基因位点 ,其中人类白细胞抗原(HLA)等位基因超过 2 0 0 0个 ,是迄今所知最复杂、多态态最高的遗传系统。几乎所有的HLA等位基因编码的蛋白质的差别都集中分布在其与抗原肽结合的分子凹槽中。这种差别决定了与抗原肽的结合强度 ,进而影响抗原肽的提呈 ,可能是肿瘤易感性的遗传基础之一。以病原微生物感染为诱因的肿瘤、非病原生物直接引起基因或染色体结构变化等原因导致的肿瘤 ,在与HLA等位基因的易感性上可能存在不同的机制。HLA等位基因的遗传易感性还与人种的遗传背景有关。由于技术上的原因 ,目前MHC多态性与肿瘤的遗传易感性研究主要集中在HLAII类等位基因或单倍型。HLAI类及其他MHC区域多态基因的等位基因与肿瘤易感性的研究值得关注。MHC有大量人群频率不一的等位基因和位点之间很强的连锁不平衡 ,要确定HLA等位基因与肿瘤发生的关系仍有困难 ,家系分析、群体规模的受累姊妹配对分析可获取更多信息。MHC单倍型和SNP分析相结合有利于准确分析MHC区域基因和肿瘤的关系 ,并鉴定和分析MHC中的新基因。理解MHC遗传多态性与肿瘤易感性对肿瘤的生物治疗有指导意义。

抗果蝇Dxl6蛋白抗体的制备及特异性分析

为了研究果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6的功能,通过RT PCR得到Dxl6的全长cDNA,并根据Dxl6基因产物的功能区,分别将Dxl6中间区域(Dxl6middlepart,Dxl6MP)、Dxl6C末端RS结构域(Dxl6RSdomain,Dxl6RSD)序列亚克隆至pGEX 4T 1(His)6C及pET32a表达载体中,表达和纯化获得融合蛋白。用纯化的融合蛋白GST Dxl6RSD His和GST Dxl6MP His免疫家兔,分别得到抗Dxl6RSD和抗Dxl6MP两种抗体。WESTERNBLOT结果显示两种抗体能特异地识别在原核表达系统内表达的抗原,抗Dxl6RSD的抗体对果蝇组织中的Dxl6具有较高的特异性。

人源抗CEA噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人癌胚抗原(CEA)特异性噬菌体抗体库,制备人源抗CEA单克隆抗体(mAb)。方法用常规RT-PCR法,直接从10例结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗CEA噬菌体。结果RT-PCR可有效地扩增出Fd和κ基因并以此构建成容量为5.2×106的噬菌体抗体库。经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集,并成功获得抗CEA噬菌体抗体阳性克隆。结论抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEA mAb的制备,为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础。

抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的: 制备抗醛糖还原酶(AR)的单克隆抗体(mAb),并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(ARL-1) mAb进行比较. 方法: 经RT-PCR获得AR基因, 将基因插入Pgex- 4T-1(His)6C中, 构建重组质粒Pgex- 4T-1(His)6C-AR, 以重组质粒转化E.coli Rosetta诱导表达GST-AR蛋白.以纯化的GST-AR蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb.应用间接ELISA和Western blot方法对mAb进行筛选和鉴定.使用Clustalx和 Antheprot软件, 比较AR与ARL-1的同源性, 表达GST-Dar[80～142氨基酸(aa)], 与ARL-1差异较大; 并分析AR的抗原性, 表达GST-Da1(1～79 aa)、GST-Da2(80～99 aa)、 GST-Da3(111～142 aa)、 GST-Da4(143～316 aa).利用AR全长及截短蛋白, 采用Western blot分析制备的抗AR mAb识别AR抗原的部位.结果: 获得3株稳定分泌抗AR mAb的杂交瘤细胞系ARB3、 AR7B3G4和ARF10.3株抗GST-AR的 mAb均为IgG1(κ型), 腹水mAb效价为1∶ 4×105, 细胞培养上清mAb效价为1∶ 1×104, 3株mAb均可与胎盘组织中的AR蛋白起反应, 而与GST-ARL-1和GST蛋白无交叉反应.它们分别为抗GST-Da1、GST-Da3和GST-Da4蛋白的mAb.结论: 成功地制备了3株特异性抗AR mAb,可分别识别AR的 1～79、111～142、143～316位氨基酸.将它们与抗ARL-1 mAb联合应用,将有助于进一步研究AR与ARL-1蛋白的功能, 并为深入探讨AR、ARL-1与相关疾病的关系及进行大规模的流行病学调查提供了有力的工具.

SARS病毒17株蛋白质序列的初步分析

SARS是一种传染性很强的呼吸系统疾病 ,分析其致病病毒各株的序列特征 ,旨在进一步研究SARS病毒的感染途径、免疫机制及预防治疗方案等。作者对已测序的 17株SARS病毒的核酸序列进行了N -J进化树分析 ,预测了各株病毒 5种主要蛋白的编码序列 ,初步分析了各株SARS病毒 5种蛋白核酸编码序列及氨基酸序列的突变情况。

DNMT1 siRNA稳定表达载体的构建及其沉默效率的评价

目的 构建能在肝癌细胞系SMMC- 772 1中稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体。方法 合成特异性干扰DNMT1的小分子干扰RNA (small interfering RNA,si RNA )分子,并与p SUPER- GFP载体连接。脂质体转染SMMC- 772 1细胞,并以G4 18筛选稳定表达细胞系。应用逆转录-聚合酶链反应和Western印迹方法对细胞系中DNMT1的RNA表达水平和蛋白表达水平进行了分析。应用甲基化聚合酶链反应方法分析该细胞系中甲基化的基因E-钙粘着蛋白的甲基化状态。结果 转染DNMT1沉默载体的SMMC- 772 1细胞中DNMT1的m RNA表达量为对照载体p SU PER转染SMMC-772 1细胞的4 3% ,而前者中DNMT1蛋白表达水平小于后者的10 %。DNMT1的si RNA沉默效率大于90 % ,所构建的DNMT1的si RNA有较高的沉默效率。DNMT1的表达抑制使E-钙粘着蛋白基因启动子区出现去甲基化。结论 成功构建了能稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体,但目的基因沉默后其RNA表达水平与蛋白质表达水平表现不一致,评价si RNA干扰作用时应以目的基因相应蛋白质的表达水平为准。

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。