从我国获批兽医诊断制品谈兽医诊断制剂发展现状

兽医诊断制品是兽用生物制品的组成部分,是科学开展动物疫病监测和诊断及动物免疫状态监测的重要保证,是依法防疫的物质基础,在动物疫病防控中发挥重要作用。近年来,我国出台一系列有利于兽医诊断制品行业健康发展的法律法规,农业农村部已经批准多项兽医诊断制品类新兽药注册证书。本文从国家兽药基础数据库中归纳并整理国内获批兽医诊断制品类新兽药注册证书相关数据,并对获新兽药注册证书的兽医诊断制品研发和应用特点以及我国兽医诊断制品发展中存在的问题进行探讨,旨在为主管部门、科研人员、临床兽医从事者和兽医诊断制品研发企业提供参考依据。

猪圆环病毒2型感染树突状细胞外泌体中差异miRNA分析

[目的]本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染中,树突状细胞(Dendritic cell,DC)外泌体miRNA在调节免疫反应中的作用。[方法]以正常的单核细胞来源树突状细胞(MoDC)来源外泌体(DEX)为空白对照组,病毒感染的MoDC来源外泌体(VDEX)为试验组,使用间接免疫荧光评估感染模型鉴定外泌体后,通过高通量测序技术分析两者中的差异miRNA。[结果]间接免疫荧光结果显示,与PCV2共孵育的MoDC中有特异性绿色荧光,表明PCV2感染MoDC模型建立成功。纳米颗粒追踪技术结果显示,超速离心法提取的外泌体直径分别为130 nm和120 nm。Western blot结果显示,两组外泌体均存在特异性标记蛋白CD63和TSG101。高通量测序结果显示,与DEX组相比,VDEX组共504种miRNA发生显著变化(P<0.05),其中161种表达上调,343种表达下调。qPCR结果表明,与DEX相比,VDEX中sscmiR10b、sscmiR199a3pR1、sscmiR5325p、sscmiR4255p、sscmiR210、sscmiR144R+1、ssclet7c、sscmiR107R2、sscmiR225pR1和sscmiR2963pR+1表达量显著下降(P<0.05),与测序结果一致。GO分析显示,差异靶基因参与的生物学功能主要有转录调控(DNA模板)、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正/负调控、信号转导和氧化还原等过程。KEGG通路分析发现,差异靶基因主要参与T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、癌症通路、细胞内吞作用和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等。通过差异miRNA显著性P值、Foldchange和KEGG富集分析,最终确定出个10目标miRNA。[结论]VDEX中差异性表达的miRNA及其靶基因通过调控T细胞的增殖分化来调节免疫反应。

新型药物递送系统在兽药制剂领域的研究进展

新型药物递送系统在新药研发中的应用近年来在国内外受到了广泛的重视。兽用新型载药系统的研究,解决了兽用药物在动物体内半衰期短、靶向性差、药物利用率低以及药物溶解性特定要求等问题,可开发出新型、高效、安全的生物药物剂型。兽药新型递药系统已在兽药领域展现出广阔的前景,并成为兽药研发的新方向之一。本文就目前主要递药系统(如缓控释递药系统、纳米递药系统、靶向给药系统、透皮给药系统、生物粘附给药系统、植入控释给药系统以及自乳化给药系统等)在兽药制剂领域的研究进展进行综述,并分析和探讨了新型递药系统在兽医领域应用瓶颈、现有研究面临的挑战及未来的发展趋势,以期为新型递药系统在兽药领域的应用提供参考。

不同产地蒙古黄芪的非靶向代谢组学分析

黄芪(Astragalus membranaceus)是一种传统的道地药材,药用历史悠久,分布范围广,不同产地黄芪的药材品质和疗效相差甚远,次生代谢物的类型和含量是决定药材品质的物质基础。为了研究不同产地黄芪次级代谢物的差异,为解析黄芪品质形成提供重要依据,同时为优质黄芪的选育奠定基础,试验对来自山西浑源(S2-7)、山西五台(S2-9)、甘肃和政药园(S2-10)的3种蒙古黄芪根进行基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学测定,利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法进行差异代谢物筛选,并通过KEGG数据库进行通路富集分析。结果显示,共鉴定出674种代谢产物,分为29类,主要包括萜类物质、黄酮类物质、苯丙素类物质和生物碱类物质。依据P<0.05、变量投影重要度(VIP)>1筛选差异代谢物,甘肃黄芪(S2-10)与山西黄芪组(S2-7、S2-9)间筛选出81种差异代谢物;山西五台(S2-9)和浑源(S2-7)2个产地黄芪间筛选出67种差异代谢物;这些代谢物在含量上存在显著差异。对通路进行富集分析可知,甘肃黄芪与山西黄芪组富集到3条差异显著的代谢通路:异喹啉生物碱生物合成、吲哚生物碱生物合成以及烟酸盐和烟酰胺代谢通路。综上可见,不同产地黄芪次级代谢物的类型和含量存在一定差异。

ZnSO_(4)通过干扰PRRSV的生命周期阶段抑制PRRSV的增殖

[目的]本文旨在探究硫酸锌(Zinc sulfate,ZnSO_(4))抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine respiratory and re⁃productive syndrome virus,PRRSV)复制的作用,明确Zn^(2+)载体槲皮素(Quercetin,QR)增强Zn抗PRRSV感染的作用,为进一步将ZnSO_(4)联合QR作为潜在预防和治疗PRRSV感染的有效策略提供理论支持。[方法]利用细胞培养半数感染量(Cell culture infective dose 50%,CCID_(50))的方法检测ZnSO_(4)和ZnCl_(2)对PRRSV滴度的影响。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白印迹(Western blot,WB)检测ZnSO_(4)处理Marc-145和PAMs细胞后,PRRSV N基因和N蛋白表达量的变化。利用qRT-PCR检测ZnSO_(4)预处理24 h后,在4℃和37℃处理下PRRSV N基因表达量的变化。同时,利用qRT-PCR检测ZnSO_(4)处理不同时间,培养基上清中PRRSV N基因表达量的变化。利用qRT-PCR和WB检测ZnSO_(4)、QR以及两者联合处理,PRRSV N基因和N蛋白表达量的变化。[结果]CCID_(50)结果表明:ZnSO_(4)和ZnCl2均可显著降低PRRSV滴度。在Marc-145和PAMs上,不同浓度ZnSO_(4)处理,均可显著抑制PRRSV N基因和N蛋白表达,且抑制作用呈明显的剂量-效应关系。不同浓度ZnSO_(4)预处理24 h,在4℃和37℃处理2 h后,均可显著降低PRRSV N基因表达,且呈明显的剂量-效应关系。100μmol·L^(–1)ZnSO_(4)处理,在不同时间段,可显著抑制上清中PRRSV N基因的表达。ZnSO_(4)联合QR处理结果表明,ZnSO_(4)联合QR可显著抑制PRRSV N基因和N蛋白的表达。[结论]ZnSO_(4)能显著抑制PRRSV的复制,它不仅可以阻止PRRSV的黏附和进入,而且可以抑制PRRSV的复制和干扰PRRSV的释放。此外,QR可以增强ZnSO_(4)抗PRRSV感染的作用。本研究为进一步明确ZnSO_(4)抗PRRSV感染的分子机制奠定了理论基础。

基于选择清除分析挖掘连翘异型花柱候选基因

连翘(Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl)为多年生木本植物,花柱二型具有自交不亲和性。挖掘连翘异型花柱发育候选基因,利于揭示连翘异型花柱的进化与发育机理。对40株长花柱型与短花柱型连翘植株进行全基因组重测序,检测样本基因组的SNP变异位点,开展选择清除分析。利用遗传分化系数Fst和核苷酸多态性πratio结合的方法筛选候选区域(前5%水平),对差异基因进行GO数据库和KEGG数据库功能注释分析,采用qRT-PCR对候选基因在花柱发育不同时期的表达量进行检测。选择清除分析显示受选择基因295个,主要在植物的生长发育以及代谢调控方面发挥重要作用。分析植物激素调节相关的部分通路,确定连翘异型花柱候选基因CYP734A1(EVM0010386)、BRI1(EVM0011829)、CYCD3(EVM0018316),基因表达结果显示CYP734A1基因在连翘短花柱发育的关键时期持续高表达,露冠期BRI1与CYCD3基因表达水平在短花柱型中显著高于长花柱型。本研究挖掘的候选基因在连翘长花柱与短花柱中存在差异表达,油菜素甾醇参与了连翘异型花柱的发育,是产生连翘花柱异型的原因之一。本研究为连翘异型花柱的进化以及遗传发育调控机制解析奠定基础并提供思路。

柴胡植物新品种DUS测试指南的研制

柴胡(Bupleurum chinens e DC.)为伞形科柴胡属多年生草本植物,以根入药。柴胡生产中种质混杂较为严重,新品种选育势在必行。为完善柴胡植物新品种特异性、一致性和稳定性(Distinctness,uniformity and stability,DUS)测试指南,本试验收集了22份不同产地柴胡,对二年生与三年生柴胡基于形态学性状开展了DUS测试指南的研制,与原指南相比,增加了根的产量与含量相关的性状,最终确定了41个测试性状,其中包括24个必测的基本性状,17个选测性状;有质量性状0个、假质量性状15个和数量性状26个;涉及到植株性状6个、茎性状4个、叶性状7个、基生叶性状7个、花性状6个、根性状10个、生育期性状1个。本指南为我国柴胡性状测试、新品种的授权提供了支撑,对柴胡新品种选育具有重大意义。

仿生树叶模型的制作及在琼脂糖微流控芯片中的应用

树叶的脉序可以更好模拟人体血管微环境,但以自然环境中树叶为模板进行实验存在一定的季节局限性;且不能保证每次实验所用树叶脉序形状相同,不易控制变量,且会对环境造成一定破坏.本文建立了一种简易的仿生树叶模型制作方法,并通过仿生模型构建了经济、易操作的琼脂糖微流控芯片.分别测定了芯片的一、二、三级脉序数目及尺寸,最大脉序尺寸值可达1038.02μm,最小脉序尺寸为36.32μm,宽度不一的通道构建为细菌趋化性实验提供了稳定可靠的梯度空间,对探索药物筛选、微生物利害等研究具有重要意义.

基于网络药理学研究苦参抑菌活性成分及其作用机制

本研究基于网络药理学及分子对接技术探究苦参的主要抑菌药效成分及其作用机理,为开发其为新型饲料添加剂提供理论基础。通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)预测苦参药效成分和靶点,并利用疾病数据库筛选抑菌靶点。利用Venny网站获取苦参药效靶点和抑菌靶点交集的靶点和韦恩图。利用STRING网站进行关键靶点蛋白相互作用(PPI)分析。基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析通过DAVID数据库在线分析。通过分子对接方法来确认关键药效成分与关键抑菌靶点之间的亲和力,并将对接结果作图。结果表明:经过一系列分析后,得到的苦参的药效成分、药物靶点、抑菌靶点、苦参和抑菌共同靶点分别是24、197、907、75个。PPI分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤蛋白P53(TP53)等32个蛋白可能是苦参抑菌作用的关键靶点。通过GO功能和KEGG富集分析,获得616个条目和156条通路。分子对接结果显示,度值排名前5位的活性成分(槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-异戊烯基山奈酚、菜豆素)和AKT1、TNF、TP53有较好的亲和力,AKT1、TNF、TP53可能是苦参发挥抑菌作用的主要靶点。通过分析得出,苦参主要通过槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等主要药效成分作用于AKT1、TNF、TP53等靶点,通过白细胞介素-17(IL-17)、TNF、C型凝集素受体等信号通路发挥抑菌作用,该研究结果表明了苦参通过多成分、多靶点、多通路实现抑菌作用。

基于网络药理学和分子对接分析野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制

【目的】基于网络药理学和分子对接方法探讨野黄芩苷抗卵泡闭锁的作用机制,以筛选野黄芩苷抗玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)致颗粒细胞损伤的作用途径。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SymMap和GeneCards数据库获得野黄芩苷发挥抗卵泡闭锁作用的靶点,使用Cytoscape v 3.7.2软件构建靶蛋白互作网络关系图并筛选关键靶点;利用DAVID数据库对靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析,构建药物-靶点-通路网络图;使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行分子对接验证。【结果】共获得34个交集靶点,筛选得到胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)、丝裂原活化激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1,CCND1)、纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、半胱天冬酶-3(caspase-3,CASP3)、神经源性基因位点切口同源物蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1,NOTCH1)和白细胞介素6(interleukin 6,IL6)共9个核心靶点。GO功能富集分析得到基因表达调控、细胞增殖正调控、凋亡过程负调控等264个生物过程条目;线粒体、内质网、细胞质等25个细胞组分条目;生长因子活性、蛋白质结合、细胞外基质结构组成等23个分子功能条目。KEGG通路富集分析得到癌症通路、IL17信号通路、PI3K-Akt信号通路等115条相关通路。分子对接验证结果显示,野黄芩苷与9个核心靶点蛋白的结合能均<0 kJ/mol,说明蛋白可与野黄芩苷自发结合。【结论】野黄芩苷可能通过多靶点、多通路来治疗卵泡闭锁,本研究结果可为阐明野黄芩苷抗ZEA致颗粒细胞损伤的作用机制提供思路。

猪重组NK-lysin抑制肝细胞性肝癌的转移:基于下调FKBP3表达、抑制氧化磷酸化和糖酵解

目的应用生物信息学方法探究猪重组NK-lysin(prNK-lysin)抑制肝癌细胞转移潜在的作用靶点和通路。方法将肝癌细胞设置为空白对照组,PBS处理组和prNK-lysin处理组,37℃作用6 h后,应用高效液相色谱串联质谱对肽段进行鉴定,按照Foldchange=1.2倍且P<0.05筛选出差异表达蛋白。基于GO、KEGG等数据库对差异表达蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析。运用RT-qPCR验证细胞中多肽-N-乙酰半乳糖胺基转移酶13(GALNT13)、跨膜蛋白51(TMEM51)和FKBP脯酰异构酶3(FKBP3)的mRNA相对表达量。Western blot验证FKBP3的蛋白表达量。结果蛋白组学表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组中有1989个差异表达蛋白;与PBS处理组相比,prNK-lysin处理组中有2753个差异表达蛋白;PBS处理组和空白对照组相比,有15个差异表达蛋白。相对于PBS处理组和空白对照组,prNK-lysin处理组中共有1909个差异表达蛋白。GO和KEGG分析表明差异表达蛋白主要参与Viral process、translational initiation、RNAbinding等过程,主要富集于Ribosome、Protein process in endoplasmic reticulum、RNA transport等通路。RT-qPCR表明,与空白对照组相比,prNK-lysin处理组显著升高了细胞内GALNT13(1.54±0.06 vs 1.02±0.17,P<0.05)和TMEM51(1.27±0.07 vs 1.00±0.04,P<0.01)的mRNA相对表达量,显著降低了FKBP3(0.43±0.06 vs 1.02±0.24,P<0.05)的mRNA相对表达量。Western blotting表明prNK-lysin处理组与空白对照组相比显著降低了细胞内FKBP3(0.68±0.02 vs 1.02±0.03,P<0.001)的蛋白表达量。结论prNK-lysin处理后肝癌细胞SMMOL/LC-7721的蛋白质组与空白组相比发生显著变化,prNK-lysin作用于FKBP3蛋白,并能通过影响细胞内氧化磷酸化和糖酵解等通路发挥其抑制作用。

基于溃疡性结肠炎模型探讨锦灯笼提取物的抗炎及抗氧化作用

【目的】探讨锦灯笼提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。【方法】将108只SPF级雄性昆明小鼠随机分为6组:空白对照组(CON)、模型对照组(DSS)、阳性对照组(SET)、锦灯笼提取物低(EPCF-L)、中(EPCF-M)、高剂量组(EPCF-H),每组18只。试验开始后,除CON组外的其余小鼠自由饮用3.0%DSS溶液,CON组小鼠正常饮水,不做任何特殊处理;从第8天起,SET组小鼠灌胃给予柳氮磺吡啶(100 mg/kg),EPCF-L、EPCF-M和EPCF-H组小鼠分别灌胃给予锦灯笼提取物0.25、0.5、1 g/kg,CON和DSS组小鼠以相同的方式给予蒸馏水,每日1次,每只0.2 mL,连续7 d。试验期间每日逐只称量小鼠体重,观察小鼠粪便情况,计算小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)及组织病理学变化,测定小鼠结肠组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及炎性因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1βmRNA表达水平。【结果】与CON组相比,DSS组小鼠体重下降明显,粪便不成型甚至出现血便,DAI评分和CMDI评分显著升高(P<0.05),结肠组织可见大量炎性细胞,肠黏膜结构被破坏,SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著升高(P<0.05),表明小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功。与DSS组相比,结肠组织中炎性细胞浸润、黏膜充血和出血等情况减少,SET、EPCF-M、EPCF-H组的DAI和CMDI评分显著降低(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】锦灯笼提取物对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用,其可能途径是提高机体的抗氧化功能及减少炎性因子的产生。

基于网络药理学和分子对接探讨莪术醇抗脑心肌炎病毒的作用机制

【目的】利用网络药理学和分子对接技术发现莪术醇抗脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的作用靶点及机制。【方法】利用PharmMapper、GeneCards数据库获得莪术醇抗EMCV的相关靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件、STRING和DAVID数据库构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建莪术醇抗EMCV靶点-通路网络;通过AutoDock Vina 1.1.2分析莪术醇与靶蛋白的结合能及结合模式。【结果】网络药理学分析结果显示,莪术醇抗EMCV的潜在靶点有9个,其中丝裂原活化激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、白蛋白(albumin,ALB)、白细胞介素2(interleukin 2,IL2)可能是莪术醇抗EMCV的核心靶点,所得靶点参与C型凝集素受体信号通路、神经营养素信号通路和JAK-STAT信号通路等代谢通路,功能涉及调节炎症反应细胞因子的产生、蛋白激酶活性和药物结合等;分子对接结果显示,4种核心靶蛋白与莪术醇之间存在较强的结合能,均存在疏水形式的结合,其中ALB、STAT1和IL2与莪术醇之间还存在氢键结合。【结论】本研究结果表明,MAPK14、STAT1、ALB和IL2是莪术醇发挥抗EMCV作用的潜在靶点,本研究为莪术醇作为抗EMCV药物的研发提供理论依据和线索。

苦参碱联合不同抗生素抗炎作用比较研究

旨在比较苦参碱与不同抗生素联合使用的抗炎作用。研究选取5种抗生素:阿莫西林、金霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考和替米考星,以猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)5′UTR RNA和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共刺激的原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAMs)为炎症模型,IL-1β为检测指标,筛选与苦参碱具有相似抗炎作用的抗生素,并采用qPCR和Western blot检测苦参碱与抗生素联合用药对IL-1β的影响。结果发现,5种抗生素中,阿莫西林和金霉素对IL-1βmRNA抑制效果与苦参碱相似。联合用药结果显示,苦参碱和阿莫西林之间存在交互作用,苦参碱可替代部分阿莫西林的用量,而苦参碱和金霉素之间不存在交互作用。在抗PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激诱导IL-1β表达的过程中,苦参碱和阿莫西林联合使用后,苦参碱能替代部分阿莫西林的药效,降低阿莫西林的使用量。本研究为苦参碱作为抗生素替代物的临床应用提供数据支持。

窄竹叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因表达分析

窄竹叶柴胡(Bupleurum marginatum var.stenophyllum)为柴胡属多年生高大型草本植物,以根入药称为藏柴胡,具有较高的药用价值。本试验采用实时荧光定量PCR技术,利用geNorm、NormFinder及BestKeeper3种不同数据分析软件,从5个常用的候选基因(Actin,α-tubulin,β-tubulin,Cyclophilin,EF-1α)筛选出可在窄竹叶柴胡不同器官稳定表达的基因作为内参基因,并利用筛选得到的内参基因分析皂苷合成关键酶基因(HMGR,IPPI,FPS,SS,β-AS)在窄竹叶柴胡不同器官的相对表达量。结果表明β-tubulin基因可作为窄竹叶柴胡不同器官稳定表达的内参基因;皂苷合成关键酶基因在窄竹叶柴胡的不同器官中表达量有显著差异,IPPI基因在种子中表达量最高,其他基因在根中的表达量均高于在其他器官中的表达量,其中HMGR,FPS,SS在侧根的表达量高于主根。因此,窄竹叶柴胡各器官皂苷合成关键酶基因的表达量不同,最适内参基因为β-tubulin基因,本研究为窄竹叶柴胡分子生物学研究提供一定依据,促进其合理开发和利用。

猪ECR1-Like免疫黏附功能对PAMs捕获GFP-E.coli的影响

【目的】探讨猪红细胞类Ⅰ型补体受体(erythrocyte complement receptor type 1-like,ECR1-like)免疫黏附功能是否能够促进猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)捕获致敏基因工程菌(GFP-Escherichia coli,GFP-E.coli),以期阐释猪红细胞免疫的分子机理及红细胞免疫在机体先天免疫中的作用。【方法】利用流式细胞术、菌落平板计数及RT-PCR技术检测PAMs捕获的GFP-E.coli的水平,分析猪ECR1-like免疫黏附对PAMs捕获GFP-E.coli的影响;运用流式细胞术、细胞免疫荧光化学技术检测猪ECR1-like免疫黏附的致敏GFP-E.coli被PAMs移除后,猪红细胞免疫黏附功能的变化及猪ECR1-like数量的变化。【结果】流式细胞术检测发现猪红细胞黏附组较空白对照组中的PAMs平均荧光强度显著提高(P<0.001),且PAMs阳性细胞率也显著提高(P<0.05);菌落涂板计数发现红细胞黏附组较空白对照组PAMs捕获GFP-E.coli情况显著增强(P<0.05);RT-PCR检测发现,红细胞黏附组PAMs中GFP-E.coli的相对数量显著高于空白对照组(P<0.01);进一步阻断猪红细胞表面的CR1-like,流式细胞术检测发现PAMs平均荧光强度降低至256301.56±9208.85(P<0.001),PAMs阳性细胞率降低至(88.32±0.92)%(P>0.05),菌落平板计数发现PAMs捕获GFP-E.coli情况减弱为(136666±8818)CFU/mL(P<0.05),RT-PCR检测发现PAMs中GFP-E.coli的相对数量显著减少(P<0.01);利用细胞流动循环互作技术发现:猪红细胞免疫黏附致敏GFP-E.coli的平均荧光强度由循环前2892.18±47.76降至2407.43±141.78(P<0.05),阳性细胞率由循环前(20.58±0.36)%降至(17.39±0.23)%(P<0.001),黏附水平显著低于循环前,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示:试验组循环后猪ECR1-like平均荧光强度由循环前344.33±37.92降低至291.56±11.99(P<0.05),阳性细胞率由(30.20±1.24)%减少至(28.27±0.64)%(P<0.05)。【结论】猪ECR1-like通过免疫黏附功能促进了PAMs对致敏GFP-E.coli的捕获。PAMs移除猪红细胞表面黏附的致敏GFP-E.coli后,猪红细胞的活性CR1-like减少,免疫黏附功能下降。

猪SsMT-1A和SsMT-2A的原核表达及金属结合特性研究

【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先,从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱(circular dichroism,CD)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和等温微量热仪(isothermal micrometer calorimetry,ITC)分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。【结果】生物信息学分析表明:SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量和排列基序完全一致,仅有8个非Cys位点差异。经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切,成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A。金属耐受性试验表明:与SsMT-2A相比,转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性。CD光谱表明:SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合,两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性,然而,SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力。MALDI-TOF-MS表明:apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为6047.5 Da和6048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定,与Cu(Ⅰ)的结合不稳定。ITC表明:SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定,与Cu(Ⅰ)的结合稳定,两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为7,SsMT-1A结合Zn(Ⅱ)的化学计量数为2。【结论】虽然SsMT-1A和SsMT-2A具有较高的同源性,然而,8个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别。尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为,然而,两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别,两者不应被认为是完全生理等价分子。在生理条件下:SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用,SsMT-2A可能发挥Zn内稳态的调控作用。本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态,发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础。

PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响

[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。

藿乌粉的提取工艺研究

为了优化藿乌粉的提取工艺,研究以乙醇浓度、固液比、提取时间、提取次数为影响因素,以2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B含量以及干膏得率为评价指标,采用层次分析法(AHP)、基于指标相关性的权重确定方法(CRITIC)、AHP-CRITIC混合加权法确定各评价指标的权重系数,根据单因素和正交试验结果优化提取工艺参数。结果表明AHP-CRITIC混合加权法确定出的权重系数更为科学、合理,优选出的最佳提取工艺为12倍量60%乙醇提取2次,每次1.5 h。3次验证试验综合评分均值为89.69,RSD值为0.63%。优选出的藿乌粉提取工艺经验证稳定可行,重复性好,可用于藿乌粉的制备。

博落回叶提取物对小鼠溃疡性结肠炎的影响

【目的】研究博落回叶提取物(Macleaya cordata leaf extract,MCLE)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)小鼠的保护作用,为博落回叶的资源利用和药物开发提供理论依据。【方法】选择60只C57BL/6小鼠,随机分成6组,即对照组(CON)组、DSS模型组、美沙拉嗪(MES)阳性对照组(200 mg/kg)及MCLE高(MCLE-H,450 mg/kg)、中(MCLE-M,150 mg/kg)、低(MCLE-L,50 mg/kg)剂量组,试验期14 d。通过小鼠的一般症状、体重变化、疾病活动指数(DAI)、脾脏指数、结肠长度及组织病理学等指标评价MCLE对DSS诱导的小鼠结肠炎模型的治疗效果。使用ELISA和实时荧光定量PCR分别检测血清和结肠组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平;比色法测定结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)和一氧化氮(NO)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;通过分析16S rRNA基因序列确定MCLE对肠道菌群的影响;采用气相色谱法测定结肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs)的含量。【结果】MCLE处理组均极显著抑制了UC小鼠的体重降低和结肠长度的缩短(P<0.01),并显著降低了小鼠DAI、脾脏指数及结肠组织病理学评分(P<0.05);MCLE显著下调了结肠和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(P<0.05),降低了结肠组织中MPO、NO和MDA的含量(P<0.05),增加了GSH-Px、SOD活性及CAT含量(P<0.05);与DSS组相比,拟杆菌属、另枝菌属、阿克曼氏菌属等有益菌属在MCLE给药组中丰度占比增加,病原菌如脱硫弧菌属等占比减少。此外,MCLE治疗还显著提高了UC小鼠肠内容物中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)的水平(P<0.05)。【结论】MCLE可能是通过调节炎症因子水平、减轻氧化应激影响、维持肠道菌群稳态和恢复短链脂肪酸的产生发挥抗结肠炎作用。