牛病毒性腹泻病毒遗传多样性与防控研究进展

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea)是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染引起牛的一种传染病,在全球范围内广泛流行,导致严重的经济损失。BVDV可分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3基因型和众多的基因亚型,宿主范围比较广泛,而且可形成持续感染,抑制宿主固有免疫和适应性免疫应答,给防控带来困难。虽然在北欧一些国家利用监测淘汰实现了BVD净化,但在BVD流行率较高的地区,免疫控制策略现实可行。目前我国各地均有BVD报道,基于BVDV-1毒株的灭活疫苗已用于该病的防控,但用于预防多病原引起牛腹泻或牛呼吸道综合征的联合疫苗匮乏,多联多价疫苗的创制将有助于我国BVD防控和净化。

青海省规模场动物疫病净化现状分析

为加快推进动物疫病净化工作,提高动物疫病防控条件和管理水平,促进养殖业健康发展,青海省于2014年启动动物疫病净化工作,10年来,该项工作取得了一定成绩,同时也遇到了很多困难。该文通过对青海省规模场情况调查,结合当前净化工作开展情况,对青海省目前净化工作的现状做出概况,分析疫病净化工作中存在的问题及原因,尝试提出对策建议,为其它规模场开展净化工作提供参考。

羊捻转血矛线虫病检测方法研究进展

羊捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫寄生于羊等小反刍动物皱胃内引起的一种危害严重的嗜血性寄生虫病。病羊临床表现为消瘦、贫血和衰弱等慢性消耗性症状,严重感染者可致死。该病在我国牧区普遍流行,目前暂无安全长效疫苗可用,加之耐药性严重,放牧羊群感染率和发病率居高不下,极大地降低了羊养殖业的经济效益。准确可靠的检测手段是诊断寄生虫感染、制定驱虫治疗方案、耐药监测及流行病学调查的关键环节。本文详细介绍了羊捻转血矛线虫病的检测技术研究现状,分析了病原学、免疫学及分子检测等方法的优缺点,并对未来检测技术发展趋势进行了展望,以期为该病新型检测方法的研发及综合防控策略提供参考。

牛支原体黏附相关因子的研究进展

牛支原体是严重危害世界养牛业的重要病原之一,可导致牛患肺炎、乳腺炎、关节炎等疾病,在全球范围内流行,给全球养牛业造成了较大经济损失。牛支原体的致病机理尚不清楚,黏附是牛支原体感染宿主并影响宿主细胞膜功能的关键步骤,而黏附相关因子是牛支原体黏附不同宿主细胞的主要参与者,与牛支原体的致病性相关。本文主要论述了牛支原体黏附相关因子及其作用研究进展,以期为牛支原体致病机制的阐释提供参考。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MGCD0103对小反刍兽疫病毒体外复制的影响

旨在探究组蛋白去乙酰化酶(HDACs)选择性抑制剂MGCD0103(Mocetinostat)对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)在山羊子宫内膜上皮细胞(EEC细胞)复制的影响。本研究通过RT-qPCR法测定PPRV感染后宿主细胞HDACs和抑制剂处理细胞中PPRV N基因的转录水平,通过Time of Addition Assay确定MGCD0103在PPRV复制过程的作用阶段,用Western blot检测PPRV N蛋白的相对表达量,并采用TCID50方法测定了病毒滴度。结果表明,PPRV感染引起EEC细胞HDAC1(P<0.001)和HDAC2(P<0.002)转录水平明显上升;MGCD0103在病毒入侵和复制阶段均发挥了抑制作用,且在复制阶段抑制作用更明显;MGCD0103显著降低PPRV N基因转录水平和表达水平及病毒滴度(P<0.002),且其抑制PPRV在EEC中的半数有效浓度(EC50)和药物选择指数(SI)分别是0.43μmol·L^(-1)和4.35。本研究确定MGCD0103显著抑制PPRV的复制,这对研发有效抗PPRV药物具有重要意义,为高效率产毒细胞株的构建提供新思路。

口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

口蹄疫病毒O型全自动磁微粒CLIA抗体定量检测方法的建立

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病,疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据,是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节,因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒(micromagnetic particles,MPs)化学发光免疫分析技术(CLIA),建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法,为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体,用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记检测抗体,经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原,37℃孵育;再加入适量酶标抗体(ALP-p Abs),37℃孵育;最后加入化学发光底物AMPPD,检测相对发光强度(relative light unit,RLU)。研究通过检测标准品拟合标准曲线,并应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)确定检测方法的判定标准;利用质控样本进行方法学评价,同时检测田间样本,并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA)比对,验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L^(-1)、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1000稀释、酶标抗体1﹕2000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成,反应时间20 min,在抗体含量0—1280 U(效价0—1﹕2048)范围内标准曲线R2>0.99,可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%;特异性为97.10%,检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%,与塞内卡病毒(SVV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛流行热病毒(BEFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、羊痘病毒(QRFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体阳性血清无交叉反应;重复检测变异系数CV值<10%;田间样本检测结果与LPB-ELISA符合率为94.69%,定量结果相关系数R2为0.8473,P<0.0001,相关性显著。【结论】建立的MP-CLIA方法耗时短、操作简便,配套国产全自动化学发光仪,可进行全自动化检测,是一种新型、高效的口蹄疫病毒O型抗体定量检测方法,本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验,在全国不同区域试用效果较好,具有较高的临床应用价值。

抗体工程在感染性疾病诊治中的研究进展

抗体作为免疫系统的主要效应分子,在抵御病原体感染和疾病发展中发挥着至关重要的作用。抗体不仅可以通过直接中和病原体保护机体免受感染,还可以通过调节免疫细胞的活动和参与炎症反应等机制发挥多种免疫调节功能。随着对抗体工程与抗体药物研究的不断深入,工程化改造抗体成为治疗疾病的重要手段之一。特异性和亲和力等特性是抗体生物学的基础,选择合适的改造策略是加速新型抗体药物研发和解决感染性疾病难治的有效途径。为更全面了解抗体在免疫系统的功能机制,本文将综述抗体工程在感染与免疫中的研究进展,为开发新的疾病治疗手段提供参考。

小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

本研究旨在建立小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法。以H蛋白4个反应原性较好的B细胞表位串联后为检测抗原,在确定抗原包被量和血清稀释度,优化血清和酶标二抗反应时间的基础上,用ROC曲线分析确定检测临界值,建立了小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法,然后对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价。结果显示,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法最佳抗原包被浓度为1.5×10^(-6)μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶100;血清及酶标二抗孵育时间均为10 min,检测方法的临界值为S/P=9.77%,批内及批间变异系数均小于10%;与口蹄疫、羊痘、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎阳性血清不发生交叉反应;用建立的化学发光法和市售小反刍兽疫抗体cELISA试剂盒平行检测247份田间血清,两者相对符合率为94.33%,但化学发光法敏感性更高。研究结果表明,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析方法灵敏、特异、稳定,可用于田间血清样品小反刍兽疫抗体检测。

RaeR对鸭疫里默氏杆菌外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用研究

旨在阐明鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株GE 296_RS05175基因编码的RaeR对外排泵RaeC-RaeA-RaeB的调控作用。构建RA-LZ01株的GE296_RS05160基因(编码内膜蛋白RaeB)缺失株ΔRaeB和回复株cΔRaeB,以及GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeR和回复株cΔRaeR。测定菌株的生长曲线、菌株对抗菌素的敏感性以及GE296_RS05160和GE296_RS05175基因在特异性底物刺激下的转录水平。结果显示,与亲本株相比,缺失株的生长能力无明显变化;与亲本株和回复株相比,缺失株ΔRaeB对卡那霉素、链霉素和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的敏感性上升,而缺失株ΔRaeR对卡那霉素、链霉素和SDS的敏感性降低;加入SDS刺激后,RA-LZ01和ΔRaeR株的GE296_RS05160基因的相对转录水平分别上升了2.26倍和4.64倍,ΔRaeR株中该基因的上调倍数明显超过了RA-LZ01株;在SDS刺激下,RA-LZ01和ΔRaeB株的GE296_RS05175基因的相对转录水平均明显下调。上述结果表明,外排泵RaeC-RaeA-RaeB与菌株的生长无明显相关性,可介导菌株对卡那霉素、链霉素和SDS产生耐受;底物SDS可刺激GE296_RS05175基因的转录水平降低,该基因编码的RaeR对RaeB的表达发挥负向调控作用。

西北地区羊种布鲁氏菌遗传相关性分析

目的调查西北地区羊源布鲁氏菌的种型、分布及遗传相关性,揭示西北地区羊种布鲁氏菌种群和流行特征。方法用常规鉴定和AMOS-PCR对西北4省区的13个地区分离的布鲁氏菌进行种型鉴定,采用MLST和MLVA-16分型方法对菌株进行基因特征分析。结果常规鉴定和AMOS-PCR检测显示,本研究共分离羊种布鲁氏菌59株,其中22株来自内蒙古,17株来自新疆,13株来自甘肃,另有7株来自青海。羊种3型布鲁氏菌58株,羊种1型布鲁氏菌1株。MLST分析表明90%(53/59)的羊种布鲁氏菌为ST8序列型,为该地区主导流行种群。MLVA-11调查显示59株羊种布鲁氏菌聚为6个MLVA-11基因型,87%的菌株为MLVA-11基因116型,提示西北地区的流行菌株属于东地中海谱系。MLVA-16将59株羊种布鲁氏菌分为40个基因型,其中8个为共享基因型且每个基因型由2~7株来自相同地区的菌株构成,表明各共享基因型的病例由来自相同传染源引起的暴发流行。所有的共享MLVA-16基因型均由来自相同省区的菌株组成,提示各省区菌株呈现明显的地域聚集性特征。基于人群和羊脾分离菌株遗传比较显示,不同宿主来源的菌株组成多个完全相同的MLVA-16基因型,提示由羊到人的传播途径。结论羊种3型布鲁氏菌是西北地区动物布病的主要病原菌,疫羊是该区域人群布病的主要传染源。ST8克隆群是该地区的主导流行种群,各地区菌株MLVA基因型呈明显的地域聚集性特征。

鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏,进行衣原体荧光PCR检测;将阳性样本匀浆和无菌处理后,接种L929细胞,连续传代培养,通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原体包涵体的形成;提取分离株DNA并测序,分析16S rRNA、16-23S IGS和ompA基因序列进行种属鉴定和基因分型。结果成功分离到1株鸭源鹦鹉热衣原体,基因型鉴定为A型。结论鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定扩大了对A型菌株感染宿主范围的认识,为其生物学特性、致病性和防控技术及公共卫生等相关研究提供基础资料。

藏獒IFN-γ基因在毕赤酵母中的表达与抗病毒活性分析

采用毕赤酵母表达系统表达藏獒γ-干扰素(Tibetan mastiff interferon gamma,TmIFN-γ)并分析其生物活性,为抗病毒生物制品的研发与临床应用奠定基础。将构建的TmIFN-γ的真核表达质粒pPIC9k-TmIFN-γ转化至毕赤酵母GS115细胞,用不同浓度的G418筛选得到多拷贝重组菌株;利用甲醇进行诱导表达,以镍层析柱纯化目的蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8试验检测重组TmIFN-γ蛋白的细胞毒性作用,利用VSV-MDBK系统检测其抗病毒生物活性。结果显示,成功筛选得到高拷贝pPIC9k-TmIFN-γ重组转化毕赤酵母菌株,利用甲醇诱导可获得TmIFN-γ重组蛋白,该蛋白对细胞无毒性,具有显著抗病毒活性,其抗病毒生物效价为1.727×10~5IU/mL。本研究获得了具有抗病毒活性的TmIFN-γ,有助于进一步探索TmIFN-γ的功能和开发新型基因工程抗病毒药物。

羊传染性脓疮病毒ORF047酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为研究羊传染性脓疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF047编码IMV上的膜蛋白在病毒与宿主互作过程中的功能,本研究选择pBT3-N和pBT3-SET两种不同表达特性的诱饵载体,分别成功构建了pBT3-N-ORF047、pBT3-SET-ORF047和pBT3-SETORF047-183AA三个诱饵质粒,并进行自激活作用和对酵母毒性作用的检测。结果表明:用诱饵载体pBT3-N构建的诱饵质粒pBT3-N-ORF047可用于筛选羊睾丸cDNA文库,这为后续以ORF047膜蛋白和羊睾丸细胞膜文库为研究系统、筛选病毒与宿主互作蛋白的研究奠定了基础。

猴痘流行现状与外溢动物风险及我国的防控策略和措施

猴痘(monkeypox,Mpox)是被世界卫生组织(WHO)认定的“构成全球突发公共卫生事件”的一种人兽共患性痘病毒病。猴痘2022疫情主要在欧美等地区的人际间流行,尽管一些输入我国的病例被有效识别、隔离和治疗,未造成较大危害和影响,但越来越多的社区隐匿存在的人间病例,人们担心可从人类再传播给动物特别是宠物,从而建立新的动物宿主种群而再次危害人类,使猴痘的预防和控制变得更为复杂和困难。本文通过猴痘病毒流行毒株演化趋势、流行病学特点以及感染动物的临床症状、危害与传播规律的介绍,以探讨我国人间猴痘外溢动物风险的防控策略与措施。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

新疆新地乡部分地区亚洲璃眼蜱的形态及分子生物学鉴定

目的了解新疆裕民县新地乡所采集蜱种的形态学及分子生物学情况。方法采集该地区家畜体表寄生蜱,借助超景深三维显微系统VHX 600对收集到的蜱进行初步的形态学鉴定。提取全蜱总DNA,采用PCR技术,基于COI和ITS2基因位点对蜱DNA进行扩增,将阳性的PCR产物进行测序。通过NCBI数据库中Blast在线分析软件,将测序所获序列与数据库中其他相关序列进行同源性比对分析。利用MEGA 7.0软件中的邻接法构建遗传进化树,确定蜱的进化生物学特性。结果经形态学鉴定,从裕民县新地乡采集的蜱均符合亚洲璃眼蜱的特征。基于COI和ITS2基因序列建立的遗传进化树表明,本次研究所采集的蜱与已知的亚洲璃眼蜱聚为一支。结论通过形态学及分子生物学鉴定,确定本次研究所采集的蜱为亚洲璃眼蜱。该结果为新疆新地乡蜱种分布提供一定数据资料,为蜱种鉴定和遗传进化特征分析提供参考。

塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离及抗体应答分析

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)在复制过程中可形成完整病毒和空衣壳,它们的分离条件和抗体应答差异目前还是未知的。本研究利用盐酸胍形成SVA空衣壳,通过优化不同的密度梯度、介质、转速、时间条件进行超速离心,获得分离SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件,并按SVA完整病毒12.5μg·只-1,空衣壳12.5μg·只^(-1)肌肉注射免疫BALB/c小鼠,免疫后1~7周检测特异性抗体和中和抗体。结果显示,SVA的MOI=1时感染细胞2 h加入100 mmol·L^(-1)盐酸胍可以使SVA完整病毒全部形成空衣壳;在10%~50%氯化铯,36000 r·min^(-1),离心2.5 h是区分SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件;而且SVA完整病毒与空衣壳诱导小鼠的特异性抗体和中和抗体水平无显著差异(P=ns)。本研究为塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离纯化、重组SVA病毒样颗粒疫苗的开发提供参考。

山羊痘病毒锚蛋白ORF140对NF-κB信号通路的调控作用

NF-κB通路是病毒调控宿主免疫功能的一个重要靶点,在病毒感染致病的过程中发挥重要作用。研究证明,一些痘病毒编码的锚蛋白可通过多种方式调控NF-κB通路,但山羊痘病毒编码的锚蛋白对NF-κB通路有怎样的调控作用尚未有研究报道。为了探究山羊痘病毒编码的锚蛋白ORF140对NF-κB通路的调控作用,作者通过双荧光素酶报告系统检测山羊痘病毒锚蛋白ORF140对NF-κB通路的影响;采用间接免疫荧光检测ORF140在HEK293T细胞中的定位;应用Western blot技术分别检测在NF-κB通路被激活的不同时间点ORF140对NF-κB通路相关因子的影响。结果显示:ORF140能够抑制NF-κB通路;ORF140定位于细胞质中,且在NF-κB通路被激活的情况下也未发生核移位;ORF140能够抑制NF-κB-p65的核移位与p-IκBα的降解。山羊痘病毒锚蛋白ORF140定位在细胞质中,通过抑制NF-κB-p65的核移位与p-IκBα的降解来下调NF-κB通路的活性。

敲低多房棘球蚴let-7-5p可抑制BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞极化和虫体生长

旨在明确敲低多房棘球蚴emu-let-7-5p对小鼠腹腔巨噬细胞极化和虫体生长的影响。构建表达多房棘球蚴emu-let-7-5p海绵序列的重组腺相关病毒载体,并在293T细胞上验证其抑制效果和特异性。70只清洁级BALB/c小鼠分别经尾静脉注射AAV8-si-let-7-5p、AAV8-control和PBS后两周,每组随机选取2只小鼠分别用Western blot和qRT-PCR分析肝组织中GFP、let-7-5p及其靶基因C/EBP δ的表达。随后,所有小鼠每只腹腔接种1 000个原头蚴,3个月后qRT-PCR检测腹腔巨噬细胞emu-let-7-5p、C/EBP δ、M1型(IL-1β、iNOS和IL-6)和M2型(Arg-1、IL-4和IL-10)相关分子的转录水平,并统计各组小鼠多房棘球蚴的包囊重量和原头蚴数量。结果表明,注射后第15天,AAV8-si-let-7-5p成功靶向小鼠肝脏,并引起emu-let-7-5p的敲低和C/EBP δ的上调表达。感染后3个月,AAV8-si-let-7-5p组小鼠腹腔巨噬细胞emu-let-7-5p和M2型相关分子Arg-1均显著下调,而C/EBP δ和M1型相关分子IL-1β和iNOS均显著上调。此外,AAV8-si-let-7-5p组IL-4和IL-6下调表达,而IL-10上调表达,且小鼠肝脏包囊重量和原头蚴数量显著低于对照组。敲低多房棘球蚴感染小鼠体内emu-let-7-5p,可促进C/EBP δ的表达,进而抑制M2型极化和虫体生长。