山羊ESR1·TENM1和THEM4多态性及其与繁殖性状相关性研究

[目的]分析ESR1、TENM1和THEM4单核苷酸多态性(SNPs)与山羊繁殖性状的相关性。[方法]采用MassARRAY SNP分型技术对ESR1、TENM1和THEM4 SNPs位点进行分型,检测其在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊3个群体中的遗传学特征,并对其多态性与山羊繁殖性状(产羔数、初生窝重、断奶窝重)进行相关性分析。[结果]群体遗传学分析结果表明,ESR1 g.76097125C>T位点在济宁青山羊和辽宁绒山羊中为低度多态(PIC<0.25),在云上黑山羊中为中度多态(0.25<PIC<0.50);ESR1 g.76139051A>G在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中为中度多态(0.25<PIC<0.50)。TENM1 g.17333655C>T和g.17372494A>G位点在3个山羊群体中表现为低度多态(PIC<0.25);TENM 1 g.17236451G>C和g.17586866T>C位点在3个山羊群体中的多态性(PIC)为0.05~0.36。THEM4 g.101275605G>A位点在3个山羊群体中为低度多态(PIC<0.25)。卡方检验结果表明,ESR1 g.76139051 A>G、THEM4 g.101275605G>A位点在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。相关分析结果表明,ESR1 g.76097125C>T位点CT和TT型山羊的初生窝重显著高于CC型(P<0.05);TENM1 g.17236451G>C位点GC型山羊的产羔数和断奶窝重显著高于GG型(P<0.05),g.17333655C>T位点CC型山羊产羔数显著高于CT型(P<0.05);其余位点多态性与云上黑山羊产羔数、初生窝重和断奶窝重无显著相关(P>0.05)。[结论]TENM1 g.17236451G>C位点可作为云上黑山羊产羔数和断奶窝重选择的潜在分子标记;TENM1 g.17333655C>T位点可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记;ESR1 g.76097125C>T位点可作为云上黑山羊初生窝重选择的潜在分子标记。该研究结果可为山羊分子育种和标记辅助选择提供理论基础。

促甲状腺激素受体调控动物季节性繁殖的研究进展

为了解绵羊季节性繁殖关键基因促甲状腺激素受体(Thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)的研究现状,对近年来国内外相关文献进行了整理与分析,总结TSHR基因特征及其调控动物卵巢功能和季节性繁殖的分子机制。结果表明:TSHR基因及其蛋白结构在动物中高度保守,并在动物多种组织中广泛表达;TSHR基因通过cAMP依赖性途径调控卵巢功能;TSHR与TSHβ相互作用间接调控T3浓度,T3通过作用于性腺轴调节动物发情性状。综上,TSHR基因对绵羊季节性繁殖至关重要,建议深入对TSHR在哺乳动物季节性繁殖调控中作用机制进行研究,以此解决绵羊季节性繁殖中存在的疑难问题。

雌激素介导circZNF423作为ceRNA调控oar-miR-541-3p/CALM3通路促进绵羊成肌细胞增殖

【背景】雌激素是雌性哺乳动物卵巢组织分泌的主要激素,其对肌肉的生长发育起着重要的调控作用,circRNA已被发现参与多种与肌肉生长发育相关的信号通路。【目的】根据团队前期卵巢摘除苏尼特羊与假手术苏尼特羊全转录组整合分析发现circZNF423可作为内源性竞争RNA(ceRNA)调控oar-miR-541-3p/CALM3的表达。为进一步探究雌激素在绵羊肌肉生长中分子机制,通过体外培养绵羊原代成肌细胞,检测成肌细胞中外源添加雌激素介导circZNF423调控oar-miR-541-3p/CALM3对成肌细胞增殖的影响,为进一步研究雌激素及circRNA在绵羊生长发育性状中的作用机制提供理论依据,为绵羊分子设计育种提供新的研究思路。【方法】采集绵羊背最长肌组织,对绵羊原代成肌细胞进行体外分离培养,通过免疫荧光染色、RNA原位杂交(FISH)和核质分离试验确定circZNF423在成肌细胞中的表达位置;RNAhybrid在线软件预测circZNF423、oar-miR-541-3p和CALM3存在结合关系,通过双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验验证circZNF423和oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p和CALM3结合情况;体外构建合成circZNF423过表达或干扰载体、oar-miR-541-3p的模拟物(mimics)或抑制剂(inhibitor)、CALM3过表达或干扰载体,在绵羊原代成肌细胞中进行转染,利用RT-qPCR、Western blot、EdU和CCK-8检测绵羊成肌细胞增殖标志因子的表达和成肌细胞增殖情况;为进一步明确雌激素在绵羊肌肉生长发育中的作用,体外添加不同浓度的外源性雌二醇(E2),利用RT-qPCR、Western blot、CCK-8和EdU检测绵羊肌细胞增殖标志基因的表达变化。【结果】免疫荧光染色显示分离的原代细胞为绵羊成肌细胞,可用于后续功能验证;RNA原位杂交和核质分离试验表明,circZNF423主要在绵羊成肌细胞质中表达。RNAhybrid、双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验结果表明,circZNF423与oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p与CALM33’UTR之间均存在显著的结合关系;抑制circZNF423/CALM3表达或过表达oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖标志因子PCNA、CDK2和Pax7 mRNA与蛋白表达水平一致,均显著上调(P<0.05或P<0.01);EdU和CCK8结果表明,抑制circZNF423/CALM3表达或过表达oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖率显著上升(P<0.05);过表达circZNF423/CALM3或抑制oar-miR-541-3p后则相反。添加不同浓度外源雌二醇(E2)后,在浓度为10 nmol·L^(-1)时绵羊成肌细胞增殖标志因子表达最高,显著高于1和100 nmol·L^(-1)的添加浓度(P<0.05或P<0.01);绵羊肌细胞增殖标志因子PCNA、CDK2和Pax7mRNA和蛋白表达水平一致,均显著上调,circZNF423和CALM3的表达量显著降低,oar-miR-541-3p的表达量显著升高(P<0.05或P<0.01);EdU和CCK8结果显示,体外添加雌二醇后绵羊成肌细胞增殖率显著升高(P<0.05)。【结论】绵羊成肌细胞中circZNF423作为ceRNA调控oar-miR-541-3p和CALM3的结合及表达,添加外源雌激素可通过抑制circZNF423/oar-miR-541-3p/CALM3通路促进绵羊肌肉细胞的增殖。这些结果为揭示雌激素及circZNF423在绵羊骨骼肌发育性状中的分子机制提供理论基础。

绵羊BMPR1A基因组织表达及其多态性与产羔数的关联分析

为探索BMPR1A基因在不同生理时期(卵泡期和黄体期)和不同繁殖力(单羔组和多羔组)小尾寒羊组织表达特征及其多样性与小尾寒羊产羔数的关系,采用qPCR技术检测BMPR1A基因在小尾寒羊14种组织中的表达特征。同时,采用Sequenom MassARRAY SNP技术对BMPR1A基因3个SNPs位点在大群中的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联。qPCR结果显示,BMPR1A在14种组织中均有表达,其中在大脑、下丘脑和甲状腺组织高表达;BMPR1A在卵泡期和黄体期多羔组下丘脑和卵巢组织表达量均高于单羔组,但未达到显著水平。分型发现BMPR1A基因g.41128335A>T和g.41127600C>T位点在单、多羔绵羊品种间的基因频率和基因型频率达到显著水平。卡方适合性检验结果显示,3个SNPs在大多数绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。关联分析结果发现,3个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关,但g.41128335A>T和g.41127598A>G位点突变型产羔数基本上均高于野生型。以上结果初步表明,BMPR1A基因表达与小尾寒羊产羔数增加存在一定程度的正相关,但3个SNPs与小尾寒羊各胎产羔数均无显著关联,说明它们可能均不是影响BMPR1A基因功能的关键位点。

策勒黑羊GDF9和BMP15基因多态性与产羔数关联分析

为了鉴定策勒黑羊BMP15和GDF9中的多态位点,并与产羔数性状进行关联分析,对相同饲养条件下81只具有产羔记录的策勒黑羊BMP15和GDF9基因完整ORF区进行测序。结果显示,在两个重要候选基因中共存在16个多态位点。GDF9基因有7个SNPs(分别为g.41769976G>A、g.41769833G>A、g.41769898G>A、g.41769246A>G、g.41769008T>C、g.41769002A>G)和g.41769723TCAA缺失,其中:g.41769833G>A位点AA型比GG型平均多0.22只(P<0.05),其余6个突变位点均与产羔数不存在显著相关(P>0.05)。BMP15基因存在9个突变位点:g.50986052C>A、g.50985229A>G、g.50985162T>C、g.50985071C>T、g.50983056C>G、g.50982538T>C、g.50981129A>G、g.50980656T>C和g.50981170T>A,且这9个SNP位点与产羔数均不存在显著相关(P>0.05)。结果可为策勒黑羊种群的保种育种提供理论参考。

TGF-β通路相关基因在绵羊性腺轴组织的表达分析

为探究候选基因INHBB、SMAD4和FGF18对发情性状及BMP6、TGFBR2和SKP1对产羔数的影响机制,利用荧光定量PCR分别检测INHBB、SMAD4和FGF18在FecB_(++)型卵泡期和黄体期小尾寒羊,以及BMP6、TGFBR2和SKP1在FecB^(++)和FecB^(BB)型卵泡期小尾寒羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫中表达差异。INHBB在小尾寒羊5个组织中均表达,垂体和卵巢中表达量最高,卵泡期卵巢和子宫中INHBB表达量极显著高于黄体期(P<0.01),黄体期输卵管中表达量极显著高于卵泡期输卵管(P<0.01);SMAD4在小尾寒羊5个组织中均表达,在垂体中表达量最高,黄体期子宫中SMAD4表达量极显著高于卵泡期子宫(P<0.01);在小尾寒羊5个组织中,FGF18在输卵管中表达量最高,垂体中表达量低,卵泡期输卵管中该基因表达量极显著高于黄体期(P<0.01);BMP6在小尾寒羊5个组织中均表达,垂体中表达量最高,FecB^(BB)型下丘脑中BMP6表达量极显著高于FecB^(++)(P<0.01);TGFBR2在小尾寒羊5个组织中均表达,卵巢中表达量最高,FecB^(++)型子宫中TGFBR2表达量极显著高于FecB^(BB)型(P<0.01);SKP1在小尾寒羊5个组织中均表达,下丘脑和垂体中表达量最高,FecB^(BB)型垂体中SKP1表达量极显著高于FecB^(++)(P<0.01)。研究显示这6个基因可能对绵羊繁殖力有一定影响。

绵羊DIO2基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

[目的]本试验旨在探明Ⅱ型脱碘酶(DIO2)基因在常年发情的小尾寒羊和季节性发情的草地型藏羊中的表达模式,并探讨其多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数之间的关系。[方法]通过荧光定量PCR(qPCR)检测DIO 2基因在不同品种绵羊的10种组织中的表达,同时利用SNP技术对3个常年发情绵羊品种(小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊)和3个季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草地型藏羊)的DIO 2基因2个SNP位点多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。[结果]qPCR结果显示,DIO2基因在小尾寒羊和草地型藏羊各组织中广泛表达,其中草地型藏羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管组织中的表达量显著高于小尾寒羊(P<0.05)。基因分型结果表明,绵羊DIO2基因g.88484603G>C位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情和常年发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P<0.01)。群体遗传学分析表明,绵羊DIO 2基因g.88484594T>C位点在滩羊和策勒黑羊中表现为中度多态(0.25<PIC<0.5),在其他4个群体中均表现为低度多态(PIC<0.25);g.88484603G>C位点在这6个绵羊群体中均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。卡方适合性检验结果表明,g.88484594T>C位点在这6个群体中均处于哈代温伯格不平衡状态(P<0.05),g.88484603G>C位点在这6个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。生物信息学分析表明,g.88484603G>C位点突变前、后的mRNA二级结构发生了改变,而且其最小结构自由能降低,结构稳定性增强,蛋白质二级结构没有发生变化,但三级结构有一些变化。关联分析表明,这2个SNP位点与小尾寒羊前3胎产羔数均无显著关联(P>0.05)。[结论]DIO 2基因与绵羊的季节性繁殖密切相关,其g.88484603G>C位点对绵羊季节性繁殖性状有一定的调控作用。

miR-221-3p靶向BCL2L11调控小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量(RT-qPCR)分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性(P<0.05),阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低(P<0.05);EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%(P<0.01)。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。

绵羊KIAA2012与UTP20多态、胴体品质性状关联与生物信息学分析

为探究KIAA2012和UTP20多态性与胸椎数间的关联性,筛选胸椎数相关重要分子标记,利用Sequenom MassARRAY^(■)SNP技术检测苏尼特羊和小尾寒羊中与胸椎数相关候选基因KIAA2012和UTP20的单核苷酸多态性(SNPs)位点,开展群体遗传学分析,并与胸椎数进行关联分析;利用生物信息学分析工具对KIAA2012和UTP20的遗传特征进行分析。结果表明,UTP20 g.170058254G>A位点在苏尼特羊群体中突变型(GA)胸椎数显著(P<0.05)高于野生型(GG),g.170053888G>A和g.170072471G>A在小尾寒羊和苏尼特羊中均与胸椎数没有显著相关;KIAA2012 g.203440537A>G、g.203424302A>G、g.203440384A>T在小尾寒羊和苏尼特羊中与胸椎数均没有显著相关(P>0.05)。SNPs与胴体长度分析结果表明,在小尾寒羊KIAA2012 g.203440537A>G中,突变型(GA)胴体长度显著(P<0.05)高于野生型(GG)。生物信息学分析表明,KIAA2012为亲水蛋白,UTP20为疏水蛋白,两者蛋白结构均不稳定,无跨膜结构域。综上所述,UTP20 g.170058254G>A位点与苏尼特羊胸椎数性状显著相关,KIAA2012 g.203440537A>G与小尾寒羊胴体长度性状显著相关,可作为调控绵羊胸椎数变异潜在的分子辅助标记。

绵羊甲状腺miR-370-3p靶向COL4A3基因调控繁殖力性状的初步研究

为探讨小尾寒羊甲状腺组织中与繁殖功能相关的miR-370-3p与COL4A3的靶向关系,本研究利用miRDB与Targetscan网站预测了miR-370-3p的靶基因,并取其交集进行功能富集分析,通过RNAhybrid与Targetscan网站预测绵羊miR-370-3p与候选靶基因的结合位点;随后检测了miR-370-3p与COL4A3基因在小尾寒羊甲状腺组织中的相对表达量。构建psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型/突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics/mimics NC共转染至HEK293T细胞并检测荧光活性。结果显示:1)miR-370-3p的靶基因可富集到孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路和FoxO信号通路等与动物繁殖有关的信号通路中。2)miR-370-3p可与COL4A3基因3′UTR区域结合,且两者在小尾寒羊甲状腺组织中表达呈相反趋势。3)共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics组的荧光素酶活性显著低于共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics NC组、共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-突变型和miR-370-3p mimics组、共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-突变型和miR-370-3p mimics NC组(P<0.05),而这三组间无显著差异(P>0.05)。综上,miR-370-3p与COL4A3存在靶向关系,且可靶向结合COL4A3-3′UTR区域,为进一步探究miR-370-3p影响绵羊甲状腺功能与绵羊繁殖力的分子机制提供了依据。

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135A>G和g.54412107C>A 2个位点。Izumo1基因g.54412135A>G位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107C>A在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P<0.01);群体遗传学分析得出g.54412135A>G多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC<0.25);g.54412107C>A多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25<PIC<0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC<0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135A>G和g.54412107C>A位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P>0.05)。