禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要危害3～6周龄的雏鸡。该病于1957年首次发现于美国Gumboro地区。50年来，IBD一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（OIE）已将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。

鸭β-防御素10基因的克隆、遗传进化分析及其生物学特性的初步研究

旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性。试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性。结果表明,鸭AvBD10 cDNA大小为169bp,编码55个氨基酸残基,与鸡AvBD10氨基酸同源性为85.5%。该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达。重组鸭AvBD10融合蛋白的分子量约为30 ku,重组蛋白占菌体总蛋白的34%。重组鸭AvBD10蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性。结果,从鸭肝脏组织中扩增了鸭AvBD10基因,该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达。重组鸭AvBD10融合蛋白具有广谱抗菌活性,该重组蛋白对温度和酸碱度有很高的稳定性。

重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因。经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204bp,编码68个氨基酸残基。根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树。发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%。将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32ku。对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定。结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性。重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250μg/mL。此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性。

鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性研究

将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因突变对细胞嗜性改变的研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)细胞嗜性改变的分子基础,本研究通过定点突变、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术,以vvIBDV HLJ-0504株为骨架构建了两组感染性克隆,并借助已建立的反向遗传操作技术进行病毒拯救。IFA检测、电镜观察及RT-PCR鉴定均显示:Q253H/A284T双点突变的pCAGGHLJ0504A889/980HRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF1细胞成功拯救出重组病毒(rHLJ0504HT),而未进行双点突变的pCAGGHLJ0504AHRT和pCAGGHLJ0504BHRT共转染组未获得重组病毒。上述结果表明,双点突变Q253H/A284T能使vvIBDV HLJ-0504适应非允许细胞CEF,但未进行Q253H/A284T双点突变的vvIBDV HLJ-0504不能感染非允许细胞CEF,因此,该研究表明VP2的Q253H/A284T两个氨基酸突变是vvIBDV细胞嗜性改变的分子基础。

表达LacZ基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特征研究

在山羊痘病毒(Goat pox virus,GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因克隆、鉴定的基础上,构建转移载体质粒。将痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnⅠ酶切位点,经酶切、PCR鉴定筛选出阳性重组子,命名为pTK-LacZ。质粒经纯化后用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸(Bovine testis,BT)细胞,待出现80%以上的细胞病变时收获病毒,经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定,获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒,命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示,LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力、生长特性与亲本株相似,保持原有疫苗株的生长特性,且在BT细胞和羔羊睾丸(Lamb testis,LT)细胞连续传20代遗传性状仍很稳定。本研究筛选、纯化的rGPV-LacZ为进一步研制表达外源基因的重组GPV活载体多价疫苗奠定了基础。

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LHLJ/04V的分离鉴定及致弱的初步研究

从黑龙江省某鸡场发病鸡群的肾脏中分离到一株病毒,通过病毒致SPF鸡胚病变特征、对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征以及RT-PCR鉴定等方面的研究,表明该病毒为鸡传染性支气管炎病毒,并命名为CK/CH/LHLJ/04V。通过对该病毒基因型分析以及对SPF鸡致病性试验发现该病毒为我国近年来流行的一类重要IBV的代表。将该毒株在SPF鸡胚连续传代110代(P110),取不同代次毒进行动物实验。结果显示,该毒株对SPF雏鸡的致病力随鸡胚传代次数的增加而逐渐降低。P110代毒以105.0 EID50/0.1 mL的剂量通过点眼滴鼻接种15日龄SPF雏鸡,鸡群发病率和死亡率均为0。不同代次毒接种SPF鸡对同源毒株P3代强毒的攻击均具有100%保护性。实验表明,IBV毒株CK/CH/LHLJ/04V P110对SPF雏鸡已无致病性,但仍具有良好的免疫原性,可作为研制IB弱毒疫苗的候选毒株。

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/121042毒株的分离鉴定及分子特征研究

鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),严重威胁养禽业健康发展。近年来,我国不断出现新型IBV毒株及变异株,给传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)防控造成困难。监测研究报告显示,IBV感染与多种类型毒株有关,主要以LX4型为主。我国部分地区近期出现LX4型与TW型重组毒株,但鲜有TWⅡ毒株报道,其分子特征和抗原特性目前尚不清楚。通过分离河北省某鸡场疑似IB病鸡肾脏,获得传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/121042,基因组全长27 675 bp,共10个开放阅读框,基因组特征为5'UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-3'UTR,Spike protein裂解酶识别位点为"Arg-Arg-Phe-Arg-Arg"。病毒基因型鉴定为TWⅡ型,基因组遗传进化分析表明,该毒株与2010年河北分离株ck/CH/LHB/100801亲缘关系最近,推测具有相同进化来源。研究结果对于阐明病毒起源、预测未来产生新型毒株和重组毒株等具有重要意义。

J亚群禽白血病流行病学研究新进展

J亚群禽白血病是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,J亚群禽白血病病毒(ALV-J)宿主范围开始扩展,已由肉种鸡扩大到蛋鸡以及地方品种鸡,对鸡群的致病性提高,发病鸡的临床表现越来越多样化,出现了血管瘤,严重威胁养禽业健康发展。ALV-J与其他免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,使疫病的诊断和防控难度加大。本文从分子流行病学的角度对ALV-J的发生发展进行综述,以期揭示ALV-J致病性增强的分子机制。

鸡传染性喉气管炎研究进展

鸡传染性喉气管炎（ILT）是一种由α-疱疹病毒，即鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的鸡的急性上呼吸道传染病。本病的特征为呼吸困难、喘气、咳出带血分泌物、喉部和气管黏膜肿胀、出血，并形成糜烂，该病急性暴发时的发病率为90％～100％，死亡率为5％～70％（平均20％），蛋鸡的产蛋量明显下降，是危害养禽业的重要疫病之一，被国际兽医局在《国际动物卫生法典》1999年版中列为B类疾病。

NDV La Sota株三个病毒克隆株间生物学特性的比较研究

为比较新城疫病毒(NDV)La Sota株不同克隆株之间的生物学特性,本研究通过挑取细胞病变区对LaSota株病毒进行纯化,并获得了3个病毒克隆株。通过血凝素热稳定性试验、病毒复制动力学试验和免疫原性试验,对3个病毒克隆株进行分析比较。结果显示,不同的病毒克隆株间在这些生物学特性上存在着不同程度的差异,表明为了获得性质均一、稳定的病毒,有必要进行病毒的纯化,并根据实验目的进行比较取舍。

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。

我国传染性法氏囊病病毒新型变异株分析研究

近期非典型传染性法氏囊病(IBD)给养禽业带来了新的威胁,本研究团队率先鉴定发现其病原为IBDV新型变异株。为了解该IBDV新型变异株流行规律和致病特点,本研究对2018年9月~2019年6月分离自黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南7个省的32个IBDV代表株的VP2基因高变区进行了遗传演化分析,结果显示,IBDV新型变异株虽然属于变异株分支,但却不同于美国早期变异株,其形成了一个独立的亚群。动物回归试验结果显示,IBDV新型变异株不致死鸡,但造成其中枢免疫器官法氏囊严重萎缩,B淋巴细胞崩解坏死,复制出了非典型IBD的症状。本研究测定了IBDV新型变异株的最低致病剂量,并依据病毒自身特殊性状,首次提出用法氏囊半数萎缩量(BAD50)作为IBDV新型变异株的病毒效价单位。本研究为IBDV新型变异株的流行规律监测和综合防控提供了数据支撑。

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/100801株的分离鉴定及分子特征研究

本研究于2010年8月从河北省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行电子显微镜观察、鸡胚致病性试验、血凝特性试验等生物学特性及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白基因RT-PCR方法鉴定,结果表明分离株为IBV,命名为ck/CH/LHB/100801。根据GenBank中登录的IBV基因组序列,设计扩增病毒全基因组的19对引物,并扩增病毒基因组,采用3`-RACE和5`-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。通过与已发表的参考病毒株全基因组序列比较表明,该分离株基因组全长为27675bp,共有10个开放阅读框,其基因排序为:5'-cap-Replicase-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly(A)-3',纤突蛋白裂解位点为534RRFRR538。序列分析表明ck/CH/LHB/100801与台湾分离株TW2296/95的结构蛋白序列相似性高达99.8%,进化亲缘关系最近,推测两分离株间可能具有相同的进化来源。

J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究

为构建J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株的感染性克隆并鉴定其对蛋鸡和肉鸡致病力的差异,本研究从黑龙江地区分离鉴定一株ALV-J分离株HLJ09SH01,以其核酸为模板,采用PCR方法分3段扩增其前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后依次连接,获得一个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBlue-HLJ09SH01。将其转染DF-1细胞,进行病毒拯救。通过间接免疫荧光、禽白血病抗原试剂盒检测及反转录酶活性试剂盒检验,表明拯救的病毒为ALV-J,命名为rHLJ09SH01。将其分别人工接种11日龄蛋鸡和肉鸡鸡胚,孵育出壳后隔离饲养32周。致瘤性试验结果表明,rHLJ09SH01可以导致57.9%的蛋鸡发生肿瘤,83.3%的肉鸡发生肿瘤。表明该感染性克隆具有亲本病毒的致病性。

野生鸟类传播禽免疫抑制性病毒的研究进展

禽免疫抑制性传染病是由禽免疫抑制性病毒引起的,以感染禽类免疫抑制为主要临床特征、严重威胁世界养禽业发展的一类传染病。以往禽免疫抑制性病毒的流行病学研究多局限于家禽,有关野生鸟类的数据十分有限。鉴于近些年来国内外学者在野生鸟类中检测到禽免疫抑制病病毒报道的增加,作者从禽免疫抑制病病毒在野鸟中的流行概况、可能宿主野鸟的种类、野生鸟类在病毒传播中的可能机制以及鸟类疾病的监测和预警等方面对野生鸟类传播禽免疫抑制性病毒的研究进展加以综述,以丰富禽免疫抑制性病毒的流行病学资料,为禽免疫抑制疾病的有效控制奠定基础。

禽网状内皮组织增生病诊断与防制研究进展

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,鸡群中REV流行比较严重;REV与马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)、鸡贫血病病毒(Chicken infectious anemia,CAV)和J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J)等几种免疫抑制性病毒的混合感染也比较普遍。鉴于REV正越来越受到重视。本文就RE的诊断和综合防制作一综述。

三种传染性法氏囊病疫苗对文昌鸡免疫效果的研究

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是危害文昌鸡的重要传染病之一。为了筛选最适合文昌鸡的IBD防控措施,试验选用新型重组疫苗(rGt HLJVP2)和商品化的弱毒疫苗、中毒力疫苗,评价其免疫效果。结果显示,重组疫苗(rGt HLJVP2)组表现更高的抗体滴度,且致死性攻毒后保护率为100%,为文昌鸡的疫病科学防控提供了新思路。

中国1995-2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995-2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白（Membrane,M）基因片段。序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672-681bp组成,编码由223-226个氨基酸残基组成的多肽。与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2-17位、221-223位,其中4-6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异。与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群。我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切。此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组。