2型猪链球菌pnp基因缺失株与回补株的构建及其生物学特性的研究

为研究2型猪链球菌(SS2) pnp基因的生物学功能,本研究通过基因无痕操作技术构建SS2 05ZYH33pnp基因缺失株Δpnp以及回补株CΔpnp,经PCR和测序鉴定结果表明,正确构建了pnp基因无痕缺失株和回补株。将05ZYH33、Δpnp以及CΔpnp分别在不同温度(28℃、37℃、42℃)培养后测定OD_(600nm)值,绘制各菌株的生长曲线;利用革兰氏染色后经镜检及透射电镜观察各菌株的形态结构;通过滴定微孔平板结晶紫法检测各菌株的生物被膜形成能力;采用接触法分析各菌株的溶血特性;于含不同抗生素的THB平板上培养各菌株,分析各菌株的药物敏感性;于氧化条件与酸性条件下培养各菌株,通过统计存活率评价各菌株的氧化耐受与酸耐受能力。结果显示,缺失株的生长速率明显低于野生株和回补株,且在冷应激条件下的生存能力下降;与野生株和回补株相比,缺失株细胞壁肽聚糖层的结构更加松散、溶血能力下降、生物被膜形成能力下降、对不同类型抗生素的敏感性增强、抗氧化与抗酸能力均下降。上述结果表明pnp基因是SS2的一个重要调节因子,参与调节细菌对外界环境变化的适应能力。本研究为科学防控猪链球菌病以及研发新型抗菌药物奠定基础。

毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失对肠炎沙门菌形态、毒力和免疫原性影响的研究

沙门菌毒力岛基因SPI-1和SPI-2分别编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的T3SS-1和T3SS-2,T3SS可以将沙门菌分泌的效应蛋白转运至宿主细胞中。为分析毒力岛基因SPI-1和SPI-2缺失对肠炎沙门菌生物学特性、致病性和免疫原性的影响,本实验室前期构建了肠炎沙门菌SM6株毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失株(SM6ΔT3SS),本研究通过绘制亲本株和缺失株的生长曲线,采用扫描电镜观察二者的形态,并测定二者对人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)的黏附性与侵袭力。生长曲线结果显示,培养5 h时,SM6ΔT3SS株的生长速度显著快于亲本株SM6(P<0.05),自6 h起SM6ΔT3SS株的生长速度极显著快于SM6株(P<0.01)。扫描电镜观察可见,亲本株菌体多单个存在,而缺失株则出现明显的菌体聚集,且其表面被类似胶状物包裹。黏附性与侵袭力结果显示,与亲本株SM6相比,缺失株SM6ΔT3SS黏附及侵入Caco-2细胞的数量均极显著下降(P<0.001、P<0.001)。上述结果表明,毒力岛基因SPI-1和SPI-2的缺失可能改变了细菌的生长、代谢、分泌及或结构等特征,导致沙门菌的生物学特性的改变及降低了其对肠上皮细胞的黏附性和侵袭力。以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射感染7日龄SPF鸡,并于感染后不同时间检测缺失株在SPF鸡盲肠、肝脏和脾脏的载菌量;将缺失株以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射免疫7、21和35日龄鸡,在首免后不同时间采血,采用间接ELISA检测各组鸡血清中的IgG抗体水平;在首免后42 d时经腹腔注射1×10^(9)cfu/100μL/只的沙门菌SM6株,并于攻毒后7 d和14 d采血连同免疫期间采集的血一起采用间接ELISA检测各组鸡血清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。在攻毒后14 d内观察并统计各组鸡的临床症状及死亡率。攻毒后7 d各组均剖杀部分鸡,采集其盲肠和肝脏组织制备病理切片观察各组织病理变化,评价该缺失株的免疫效力。载菌量结果显示,感染后2 d,缺失株在鸡脾脏和肝脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.001),但在盲肠中的载菌量极显著高于亲本株(P<0.01);感染后4 d,缺失株在肝脏和盲肠中的载菌量极显著和显著低于亲本株(P<0.01、P<0.05);感染后8 d,缺失株在脾脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.01),且两组鸡在上述脏器中的载菌量均降至较低水平;抗体和细胞因子的ELISA检测结果显示,首免后14 d,免疫组鸡的抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。从免疫后21 d,免疫组鸡的抗体水平均极显著高于对照组鸡(P<0.001);免疫期血清中IFN-γ的分泌水平无明显变化,IL-4的含量在免疫后42 d极显著高于对照组(P<0.01);攻毒后鸡血清中IFN-γ和IL-4的含量均显著高于对照组(P<0.05)。整个实验期SM6ΔT3SS免疫组鸡均存活且无明显的临床症状、无死亡,肝脏和肠黏膜仅出现轻微病理损伤,对照组鸡组鸡攻毒后14 d内死亡率达80%,肝脏和肠黏膜均出显较明显的病变。上述结果表明,SM6ΔT3SS株能够刺激SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫反应,对SPF鸡的致病性降低,并对鸡有较好的免疫保护效力。本研究为阐明沙门菌致病机制和研发安全有效的沙门菌减毒活疫苗奠定了良好基础,也为沙门菌病的防控提供了新思路。

高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。

2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性。结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h~15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107cfu/mL。进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2368195 bp,GC含量40.88%,含有2299个编码基因,其中有1822、1830和1077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S r RNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等。本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据。

一株猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

为确定黑龙江省某养殖场因呼吸道症状急性死亡病猪的致病菌,并探究其主要生物学特性,本研究采集病死猪内脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S r RNA基因的PCR扩增、测序、系统进化树的构建对分离菌进行种属鉴定;通过微量肉汤稀释法分析该菌对8类10种抗生素的敏感性;通过Illumina PE150对细菌全基因组测序,采用ResFinder软件分析分离菌的耐药基因,并分析耐药基因与耐药表型的相关性。利用VFanalyzer软件、BLASTN比对分离菌的毒力基因。结果显示,该菌株在10%脱纤维羊血平板培养基上培养24 h后形成表面光滑具有β-溶血环的单菌落;革兰氏染色结果显示呈蓝紫色短棒状杆菌;生化鉴定结果显示该分离菌的生化特性与化脓隐秘杆菌符合。16S r RNA基因的PCR结果显示,扩增到1397 bp的目的基因序列,与GenBank中序列比对结果显示该菌株与已报道的化脓隐秘杆菌同源性高达99%。16S r RNA基因系统进化树分析结果显示分离菌与辽宁沈阳的牛源化脓隐秘杆株TZQ 01株处于同一分支,与日本的猪源分离株NIAH13531处于较近分支,以上结果可确定该分离菌为化脓隐秘杆菌,并将其命名为FY-4-Z-1。药敏试验结果显示,该菌株对头孢菌素类的头孢噻呋,青霉素类的青霉素、阿莫西林,大环内酯类的红霉素,截短侧耳素类的泰妙菌素等抗生素敏感,对四环素类的四环素,氨基糖苷类的链霉素耐药。利用组装软件SPAdes对获得的全基因组测序数据组装后获得了分离菌全基因组草图,结果显示分离菌基因组大小为2399.961 kb;耐药基因分析结果显示,该菌株基因组包含3种耐药基因,分别是氨基糖苷类的ant(6)-la、大环内脂类的erm(X)、四环素类的tet(W)耐药基因,其中在化脓隐秘杆菌中首次检测到ant(6)-la基因。该菌株对四环素和链霉素的药敏试验结果与其耐药基因检测结果相符,而红霉素敏感表型可能与其耐药基因erm(X)的移码突变有关。利用BLASTN和VFanalyzer软件进行毒力基因检测,结果显示共检测到8个已知毒力基因和24个候选毒力相关基因。本实验进一步丰富了猪源化脓隐秘杆菌的相关研究,为规模化猪场化脓隐秘杆菌病的防治提供了重要的参考依据和用药指导。

猪肺炎支原体Mhp-1株的分离鉴定及其全基因组测序分析

为了分离与鉴定引起的猪群疑似支原体性肺炎的病原体,本实验收集了20份病死猪肺脏病变组织,采用猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)特异性引物进行PCR鉴定、分析培养特性、颜色变化单位(CCU)测定、传代培养后扩增16S rRNA基因并测序分析等,并进一步采用BLAST分析分离菌16S rRNA基因序列的同源性,采用邻接法构建16S rRNA基因的系统进化树,对该分离株MLST分型、全基因组测序和毒力基因预测。结果显示,20份临床样品仅3份样品为Mhp单阳性,接种KM2液体培养基后仅1份生长良好,颜色规律性变黄;接种KM2固体培养基培养7 d后呈现特异性“煎蛋样”的菌落形态;瑞氏姬姆萨染色结果可见环状、点状、丝状、两级状等形状且大小不等的菌体形态,传12代后经特异性PCR检测结果为Mhp单阳性,表明该分离株可以稳定传代,且无Mhr污染;该分离株在KM2培养基上为1×10^(7)CCU/mL;16S rRNA基因序列比对结果显示该分离株与GenBank中登录的Mhp菌株ES-2(CP038641.1)同源性达100%。以上结果确定本研究分离出一株Mhp,并将其命名为Mhp-1。16S rRNA基因系统发育树分析结果显示,分离株Mhp-1与国外猪源Mhp分离株F7.2(KY264125.1)处于同一分支,亲缘关系最近;MLST分型结果显示Mhp-1分离株属于ST184型;全基因组测序获得序列大小为0.91 Mb,与已报道的Mhp基因组大小基本一致;毒力基因预测结果显示其存在EF-Tu、Lttp、P216、P102、P46、P97、PDH-B、Capsule、HlyA等毒力因子编码基因。本研究进一步丰富了Mhp的研究数据,为规模化猪场猪支原体性肺炎的防控提供参考数据。