猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。