一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD600值变化测定其对温度、p H、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1,噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1—2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目(Caudovirales),肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为ds DNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10—100 k D,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围(31—317 kb);生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28—50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在p H 3—8的范围内均有较强的裂解活性,当p H值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0—9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。

一株对TMV和PVY具有拮抗活性生防菌的筛选与鉴定

【目的】筛选对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)具有显著拮抗活性的菌株。【方法】从山东诸城等植烟区采集烟草病毒病高发区健康烟株中烟100(Nicotianatabacum var.Zhongyan 100)的根际土壤,分离抗TMV的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定确定菌株。采用Real-time PCR技术定量检测该菌株对TMV和PVY的抑制作用进一步验证该菌株的抗病毒活性。田间试验进行3个处理,菌液与病毒混合,2 h后接种(I),喷菌液2 h后接种病毒汁液(II),接种病毒汁液2 h后喷施菌液(III),以8%宁南霉素和肥皂水分别与等体积病毒汁液混合为阳性对照,以LB培养基与病毒汁液混合为空白对照。利用菌株发酵液对剪刀上病毒的钝化作用进行验证试验。【结果】筛选到的菌株通过枯斑寄主半叶法显示其对TMV的抑制效果达98%以上,命名为4A1,分子鉴定结果显示该菌株16S rDNA序列与Pseudomonas monteilii的16s rDNA序列同源率达到99%;菌株4A1为革兰氏阴性,氧化酶、淀粉水解VP、吲哚等反应为阴性,明胶液化、葡萄糖反应为阳性,能运动,确定该菌株为蒙氏假单胞菌(P.monteilii)。Real-time PCR检测结果显示其发酵液对TMV、PVY具有显著的抑制活性。田间试验结果显示,处理I可有效降低大部分病毒侵染,TMV和PVY发病率分别为5.3%和7.7%,病情指数分别为0.8和2.9;处理II可显著减少TMV和PVY的侵染几率,发病率分别为33.3%和36.7%,病情指数分别为4.2和6.0;处理III烟株发病率为95.0%和92.0%,病情指数为24.5和20.1;CK组TMV、PVY发病率分别为99.3%和95.4%,病情指数为别为38.6和45.1。菌株对剪叶工具的处理,钝化病毒效果可达95%以上,防效显著高于其它处理。【结论】在烟叶生产上,该菌株可以作为生产工具的生物消毒剂和抗病毒剂。

TMV侵染烟草诱导寄主产生细胞自噬

细胞自噬(autophagy)—自体吞噬,是真核生物中一种高度保守并普遍存在的物质循环利用过程。为明确烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染烟草是否引起细胞自噬,本研究利用TMV-U1和普通烟(Nicotiana tabacum cv.Blight yellow)为主要研究材料,利用透射电子显微镜观察、单丹磺酰尸胺(M DC)荧光染色技术、自噬标记分子ATG8f-ECFP荧光观察和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分别检测TMV侵染烟草后的烟草细胞内自噬结构的形成、酸性细胞器的存在和细胞自噬相关基因(Autophagy related gene,ATG)ATG3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a的表达特征。结果表明,TM V侵染72 h后,在液泡边际和液泡内发现大量疑似自噬体结构。利用M DC荧光染色和ATG8f-ECFP瞬时表达技术,通过激光共聚焦显微镜观察,在TMV侵染72 h后发现点状荧光信号。TMV侵染48 h后,除ATG5外,烟草ATG3、ATG4、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a表达均上调并在72 h达到顶峰。表明TM V侵染后感病烟草均可检测到细胞自噬现象,推测TMV侵染普通烟可诱导寄主产生细胞自噬反应。

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】筛选不同温度下烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染后枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS),48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90(N.tabacum var.TN90)基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA),并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8000万条clean reads,共获得4737条已知lncRNA、40169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】不同温度(25℃和31℃)条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。

20%双草醚悬浮剂防除水稻直播田杂草的药效

为有效控制水稻直播田草害,研究20%双草醚悬浮剂的防除效果、适宜用量和应用安全性.本研究中防除对象为水稻直播田稗草、马唐、莎草、鸭跖草等1年生杂草,以10%双草醚悬浮剂为对照药剂,以清水为空白对照,试验测定4种浓度(有效成分22.5,30.0,37.5,60.0g/hm^2)的20%双草醚悬浮剂的防效,同时跟踪其使用安全性及水稻产量变化.试验结果发现,20%双草醚悬浮剂对目标杂草具有良好的防除效果,优于对照药剂10%双草醚悬浮剂;20%双草醚悬浮剂有效成分60g/hm^2处理的防效显著高于其他3个低浓度处理.对杂草总数量的防效在药后1个月内保持在72%以上,药后45d降至44.91%~62.74%,但对杂草总质量的防效仍达72.33%~89.29%.20%双草醚悬浮剂在水稻直播田具备使用安全性,水稻增产率(与人工除草相比)为-2.70%^-10.81%,所以为水稻直播田理想除草剂,推荐使用剂量为有效成分22.5~37.5g/hm^2.