家蚕幼虫消化管的结构和功能及先天免疫研究进展

家蚕不仅是一种家养经济昆虫,也是鳞翅目模式昆虫,广泛用于基础与应用研究。同时,蚕丝业对许多发展中国家的经济和农业发展具有重要意义。家蚕饲养成功的关键在于它消化食物和吸收营养的能力,这种能力发生在消化管。由于食源植物对昆虫摄食的主动防御机制和环境微生物在摄食过程中很容易进入消化管,因此消化管的结构特征和物理屏障机制可以进行功能性物质和蛋白质摄取,以及防止机械损伤、毒性侵害和微生物入侵感染,确保了家蚕幼虫期对营养物质的高效摄取、消化、吸收、代谢与积累。

家蚕滞育关联基因的研究进展

昆虫滞育是受基因控制与外界环境多种因素影响的生物学过程,涉及基因众多,调控网络复杂,目前其分子机制仍未清晰。国内外滞育调控的相关研究多数基于家蚕、果蝇、麻蝇等模式昆虫。介绍了家蚕滞育关联基因的研究现状及进展,包括分类、生理功能、基因间互作、部分基因涉及的信号通路及研究热点等,为促进其在农林害虫的防治途径或天敌保护利用等方面的应用提供参考。

柞蚕幼虫黄体色与白体色的遗传分析及类胡萝卜素组成比较

为深入探讨柞蚕幼虫体色多样性的形成机制,分析柞蚕品种豫大1号(黄体色)和白一化(白体色,略带黄色)幼虫体色的遗传规律,并比较二者在体壁类胡萝卜素组成上的差异。杂交试验发现,F_(1)的幼虫体色为黄色,F_(2)有黄色和白色两种表型,且分离比符合3∶1;回交BC_(1)(F_(1)×豫大1号)均为黄色,而BC_(1)(F_(1)×白一化)则有两种表型,即黄色和白色,分离比符合1∶1。遗传分析表明,豫大1号的基因型为YYGG,白一化的基因型为YYgg,豫大1号的黄体色对白一化的白体色属于完全显性遗传。代谢组学分析发现,豫大1号中的类胡萝卜素含量(10.259μg/g)远高于白一化(1.167μg/g);白一化体壁中的叶黄素、β-胡萝卜素和玉米黄质含量远小于豫大1号。综上认为,体壁中类胡萝卜素的缺乏是导致白一化形成白体色的原因之一。

家蚕品种秋丰×白玉耐氟性状的遗传分析及耐氟主效基因的初步定位

家蚕品种秋丰×白玉是一对耐氟性较强的夏秋用蚕品种,其中以亲本白玉A的耐氟性最强。以白玉A与耐氟性较弱的皓月B为亲本组配各种杂交世代进行耐氟性的遗传分析,结果表明在一定浓度的氟化物添食范围内,其耐氟性遗传呈显性遗传,受主效基因控制,并且具有部分伴性遗传效应和明显的杂种优势。利用SSR分子标记对耐氟性状进行连锁分析,初步确定耐氟主效基因与第12连锁群中的2个标记(chr12-2990-1和chr12-2990-2)紧密连锁。

果蝇和家蚕体型调控机制研究进展

体型是昆虫最明显和最基本的特征之一,研究昆虫体型调控分子机制有助于了解生命的奥秘,对于治疗某些人类体型疾病也具有借鉴意义。通过对果蝇、家蚕等模式生物的研究发现,昆虫体型受多种因素调控,受遗传和环境因素的双重影响。微调基因、激素和信号通路等内在因素通过控制细胞生长、蛋白质合成以及有丝分裂等过程对昆虫的体型调控起着决定性作用,营养、温度等外界环境因素也影响体型大小。本文综述了影响果蝇体型的基因、信号通路、激素等,以及家蚕体型突变体的研究进展,旨在为昆虫体型调控分子机制的研究提供参考。

家蚕微孢子虫Ubc9蛋白的基因克隆与功能研究

SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研究NbUbc9在家蚕微孢子增殖中的作用提供了参考,也为开发微粒子病防治药物提供了新的方向。

二化性家蚕滞育、非滞育和即时浸酸卵中糖代谢相关酶mRNA水平和活性的变化

【目的】探究家蚕Bombyx mori胚胎发育早期卵内糖代谢与滞育的关系。【方法】以家蚕二化性品种"秋丰"活化越年卵为材料,一部分于17℃暗催青,孵化后常规饲养,制备非滞育命运卵(ND);另一部分于25℃明催青,孵化后常规饲养,制备滞育命运卵(DD),再用盐酸溶液处理部分DD卵制备即时浸酸卵(IA)。在卵产下或浸酸后0,2,6,12,24,48,72和96 h分别取样,利用qRT-PCR测定家蚕卵中己糖激酶(hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和海藻糖酶(trehalase,TRE)5种糖代谢相关酶基因的mRNA表达水平,利用紫外-可见分光光度法测定家蚕卵中这5种酶的活性。【结果】家蚕糖酵解途径关键酶己糖激酶(BmHK)和磷酸果糖激酶(BmPFK),以及糖分解代谢关键酶山梨醇脱氢酶(BmSDH-1)和海藻糖酶(BmTRE)在ND和IA中的mRNA水平和活性均普遍高于在DD中的;而糖异生途径相关的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(BmPEPCK)在DD中的mRNA水平和活性均高于在ND和IA中的。【结论】结果提示,DD因胚胎滞育的需要,胚胎发育早期卵内糖代谢以能量和物质的贮存为主;而ND和IA由于胚胎发育进程较快,糖代谢以物质分解代谢为主。本研究初步揭示了家蚕卵内糖代谢与滞育的关系,有助于更好地理解家蚕滞育的分子机制。

家蚕己糖激酶基因进化分析及其多转录本在胚胎早期发育过程中的表达特性

【目的】明确家蚕(Bombyx mori)二化性品系胚胎早期发育过程中己糖激酶基因(BmHK)不同转录本的表达特性,为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蚕胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。【方法】从NCBI检索并下载家蚕等12种昆虫的HK氨基酸序列,采用MEGA 7.0的邻接法(NJ)构建基于HK氨基酸序列相似性的系统发育进化树。以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵(丙2胚胎)为材料,分别制备非滞育命运卵(ND)、滞育命运卵(DD)和即时浸酸卵(IA),采用实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性。【结果】BmHK基因属于HSP70-actin家族,存在4个不同的转录本,其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp,依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3种蚕卵胚胎早期发育过程中整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,IA蚕卵中的BmHK-a相对表达量于发育2 h达峰值,在ND蚕卵和DD蚕卵中于发育48 h达峰值,此后其表达快速下调,至发育96 h均处于较低水平;BmHK-b在3种蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,3种蚕卵中的BmHK-b相对表达量变化趋势基本一致,均随发育时间推移呈逐渐上升趋势;BmHK-c在3种蚕卵中的表达差异明显,初产蚕卵中已有较高的表达水平,受精后迅速升高,至发育72 h后BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高;BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵,但IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵。【结论】BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育(产卵或浸酸后3 d)过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程,但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切,通过糖酵解为胚胎发育提供能量。

家蚕BmVNCP基因表达与BmNPV感染增殖相关性的鉴定分析

为解析家蚕AN品系高抗BmNPV的分子机制,采用家蚕抗性品系AN与易感品种C108杂交及多代回交,结合累代BmNPV攻毒选择,构建了高抗BmNPV的近等基因系C108_AN;在5龄起蚕经口添食BmNPV多角体1×10^(8) mL^(-1)悬浊液浸渍桑叶对C108及C108_AN攻毒,对感染后12、24、36、48、60 h的中肠组织进行转录组测序发现,C108_AN样本中检出BmNPV基因个数与表达量均大幅减少,病毒虽然能够侵染但不能完成复制;转录组中编码230 aa的家蚕病毒核衣壳蛋白基因(命名为BmVNCP)在C108_AN样本中显著高表达,表明与BmNPV抗性可能具有关联性。在BmN细胞中过表达BmVNCP基因可以抑制BmNPV的增殖,在BmN细胞中进行靶向BmVNCP的CRISPR/Cas9基因编辑,未能观察到BmNPV增殖和vp39基因表达的稳定增加;BmN细胞内过表达BmVNCP基因可以明显提高宿主IMD信号通路中Dredd基因的表达水平,对FADD基因转录水平无影响,PGRP-LB和PGRP-LF基因表达量极低以致qRT-PCR无法检出。综合分析上述结果认为,家蚕细胞或组织中BmVNCP基因高水平表达不能够阻止BmNPV侵染,但能够降低BmNPV侵染后病毒基因的表达以及病毒增殖,BmVNCP基因产物可能是通过IMD信号通路触发免疫机制。

一个二化性家蚕醛酮还原酶基因的克隆及序列与表达分析（英文）

醛酮还原酶(aldo-keto reductase,AKR)超级家族成员以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为其辅酶,将醛酮类化合物还原成相应的醇类,其作用底物范围广泛,包括糖类、脂肪醛和甾体类激素等,在许多重要生物学反应中发挥关键作用。以二化性家蚕品系秋丰为材料,利用RT-PCR分别从滞育命运组和非滞育命运组克隆出AKR蛋白的cDNA序列。AKR蛋白序列由343个氨基酸组成,与黑腹果蝇和人的AKR分别有43%和38%的序列一致性。基于蛋白质序列构建的系统发育树显示,家蚕AKR蛋白属于AKR2E亚家族,其氨基酸序列与该家族成员序列一致性超过30%,故命名为AKR2E-like。将akr2e-like基因的cDNA序列克隆进表达载体pET-28a(+)中进行原核重组表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析显示重组蛋白被成功表达。qRT-PCR分析表明,ark2e-like基因表达受发育环境调节:在滞育诱导条件下,该基因在家蚕化蛹早期的表达量持续增加,在化蛹后第4天mRNA丰度达到最高值;而在非滞育诱导条件下,化蛹后ark2e-like基因表达量并无明显波动。上述结果表明,ark2e-like基因有可能在家蚕二化性品系的滞育准备期起关键作用。

家蚕不同化性品系间DNA甲基转移酶基因转录特性及胚胎早期甲基化水平差异分析

DNA甲基化修饰参与昆虫胚胎发育。家蚕是典型的胚胎滞育昆虫,为探明家蚕DNA甲基化在胚胎发育及滞育调控中的作用,以不同化性家蚕品系为材料,包括一化性品系安康4号(V^(1)AK4)和鲁一(V^(1)Lu1)、二化性品系秋丰(V^(2)QF)和P50(V^(2)P50)、有滞育多化性品系四海(V^(3)SH)、无滞育多化性品系Nistari(V^(3)Nistari),利用qRT-PCR技术分析家蚕甲基化酶基因BmDnmt在家蚕不同化性品系的表达水平,并利用免疫荧光法测定胚胎发育早期DNA甲基化水平。结果显示,在胚胎发育早期BmDnmt1和BmDnmt2在V^(1)AK4、V^(2)P50和V^(3)Nistari品系中表达水平较高,在V^(3)Nistari品系中BmDnmt1的表达水平显著高于V^(3)SH品系;在幼虫期,BmDnmt1和BmDnmt2在多化性家蚕卵巢或精巢组织中表达水平显著高于二化性家蚕,且它们在V^(3)Nistari中的表达水平显著高于V^(3)SH。采用免疫荧光法测定子代蚕卵的DNA甲基化水平,发现不同化性品系中DNA甲基化水平整体呈上升趋势,在产卵后96 h,多化性品系的DNA甲基化水平显著高于二化性品系。以上结果表明,BmDnmt在家蚕不同化性品系胚胎发育早期的表达水平和DNA甲基化水平均存在差异,推测家蚕幼虫期卵巢组织及胚胎发育早期的DNA甲基化水平与家蚕滞育性及化性有关联。研究结果为进一步解析DNA甲基化在家蚕胚胎发育和滞育中的调控机制提供了新的见解。

家蚕bmo-miR-0031-3p体内下调丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了研究家蚕微RNA(microRNA, miRNA)对丝素轻链基因BmFib-L表达的调控作用,以BmFib-L mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)为靶标,通过RNAhybrid软件分析,筛选出种子序列与BmFib-L 3′UTR完全互补的家蚕miRNA——bmo-miR-0031-3p(简称"miR-0031-3p")。分别构建miR-0031-3p表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和BmFib-L 3′UTR融合萤光素酶报告基因重组表达质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40],以海肾萤光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,通过检测双萤光素酶活性验证miR-0031-3p的功能;人工合成miR-0031-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),再进一步验证miR-0031-3p对BmFib-L的调控功能。结果显示,在BmN细胞中,miR-0031-3p显著抑制BmFib-L的表达。为了进一步验证miR-0031-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用,在5龄第2天幼虫体腔内注射转染物,分别在体内过表达和抑制内源性miR-0031-3p,荧光定量分析靶基因表达水平。结果显示,miR-0031-3p在幼虫体内能够下调BmFib-L的表达。该研究结果有利于阐明家蚕miRNA功能和蚕丝蛋白表达调控的分子机制。

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物。采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL。此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖。上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础。

天宫二号航天蚕后代小茧突变体sc的发现与基因定位

【目的】从2016年天宫二号空间实验室经历33 d后返回的1头成活“秋丰×白玉”杂交后代雌蚕Bombyx mori与地面“白玉”雄蚕交配的后代个体中,发现有结小茧突变体,进而分离并建立了飞天蚕(space silkworm)正常茧品系TG和小茧突变体品系sc。本研究通过对sc进行遗传分析和基因定位,旨在揭示产生小茧突变体的基因。【方法】对TG和sc进行表型分析;以sc,TG和正常大茧品系0223V_(1)为试验材料,组配(sc♀×0223V_(1)♂)F_(1)及回交群体BC1F——(sc♀×0223V_(1)♂)F_(1)♀×sc♂和BC1M——sc♀×(sc♀×0223V_(1)♂)F_(1)♂。以sc,0223V_(1)和F1基因组DNA为模板,每个连锁群随机选10个SSR引物进行PCR扩增,筛选多态性SSR标记。利用雌性家蚕减数分裂染色体不交换的特点,用BC1F确定sc基因所属连锁群;再根据家蚕SSR分子标记连锁图谱,用BC1M进行基因定位。【结果】表型分析表明sc幼虫体型小于TG幼虫的,蚕茧重约为TG的1/2。遗传分析表明突变受一对隐性基因sc控制;基因定位结果表明该基因位于家蚕基因组第3连锁群S2930-363和S2930-289 SSR标记之间,物理距离为684 kb,包含33个候选基因。【结论】飞天蚕小茧突变受位于家蚕基因组第3连锁群的一对隐性基因sc控制。

色素代谢相关基因在家蚕褐色类鹑斑突变品系q-l^b 4龄眠蚕表皮中的表达分析

家蚕体表色素主要有黑色素、蝶啶类色素和眼色素,不同家蚕品种的体色和斑纹都是表皮中黑色素、眼色素和蝶啶类色素等相互作用的结果。为了解家蚕褐色类鹑斑突变体(brown quail-like,q-l^b)幼虫表皮色素的代谢情况,利用qRT-PCR 技术分别检测q-l^b突变体和其对应的野生型品种0223金黄(0223JH)在4龄入眠后18 h新生表皮中37个色素代谢相关的基因的表达水平。结果表明,相对于野生型品种,大多数与黑色素、蝶啶类色素合成相关的关键基因在q-l^b突变体中表达上调,而与眼色素合成相关的关键基因表达下调,表明黑色素、蝶啶类色素在q-l^b突变体表皮中的含量都增加,而眼色素在q-l^b突变体表皮中的含量相对减少;与几丁质合成及尿酸转运相关的基因在q-l^b突变体表皮中也存在表达差异,其中大部分关键基因表达上调,表明更多的几丁质在q-l^b突变体新生表皮中合成,并伴随更多的尿酸被转运到表皮,与其他色素一起参与表皮构建,形成q-l^b突变体特殊的体色斑纹。此外,部分保幼激素代谢和核受体基因差异表达也可能影响了相关色素的合成及代谢。q-l^b突变体相对于野生型具有更复杂的体色和斑纹,这些基因的差异表达可能与此有关。研究结果为进一步阐述家蚕褐色类鹑斑产生的分子机制打下了基础。

Bmo-miR-2788对家蚕丝胶蛋白基因Ser-1的表达调控

通过生物信息学分析发现,家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1的3′非翻译区(3′-UTR)存在微小RNA Bmo-miR-2788的结合位点。半定量PCR结果显示,Bmo-miR-2788在家蚕5龄第4天幼虫的8个受试组织中均有表达,但在中部丝腺中表达水平最高;而BmSer-1仅在中部丝腺中被检测到。分别构建BmSer-13′-UTR和Bmo-miR-2788的表达载体pGL3.0(A3-luc-BmSer-1-3′-UTR-SV40)和pcDNA3.0(ie1-egfp-pri-Bmo-miR-2788-SV40),共转染BmN细胞,结果表明Bmo-miR-2788上调BmSer-1表达(P<0.01);当将上述载体与合成的Bmo-miR-2788抑制剂共转染BmN细胞时,BmSer-1表达显著下调(P<0.05)。为验证Bmo-miR-2788在蚕体内对BmSer-1表达的调控作用,将Bmo-miR-2788表达质粒与其阴性对照(pcDNA3.0)分别注射到家蚕5龄第3天幼虫体内,qRT-PCR分析结果显示,与阴性对照相比,注射Bmo-miR-2788后36 h中部丝腺中的BmSer-1表达显著上调(P<0.01)。上述结果表明Bmo-miR-2788正向调控BmSer-1基因的表达。

限食对家蚕寿命和繁殖性能及部分生理指标的影响

为了探讨限食对模式昆虫家蚕寿命等的影响,以二化性家蚕品系秋丰为对象,设置自由采食组(AL组)--每日给桑2次、24 h自由进食,限制给食组(DR组)--每日给桑1次,16 h自由进食、停食8 h,调查了幼虫期和蛹期经过时间、成虫交配繁殖性能和存活时间,利用qRT-PCR技术分析了限食对家蚕3个果蝇寿命相关基因的同源基因Bmchico、Bmrpd3和BmAkh2在5龄3 d幼虫不同组织的表达水平;分析了血淋巴超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力,可溶性蛋白含量和海藻糖水平。结果显示, DR组的给食量为AL组的61.03%,限食后蛹期3 d雌、雄蛹平均体质量分别为AL组的63.34%和63.52%;雌雄平均寿命955 h,比AL组延长131 h,差异达到显著水平(P<0.05);限食后雌蚕的造卵数没有明显变化(P>0.05),雄蛾交尾正常。3个寿命相关基因在DR组与AL组的不同组织中均呈现不同程度的表达差异。限食后血淋巴中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力整体水平提高,可溶性蛋白含量降低,海藻糖水平发生改变。该结果可为研究限食对人体的影响提供思路和借鉴。

限食影响模式生物家蚕Sir2等寿命相关基因的表达并延长寿命

为探讨限食延长寿命的分子机制,以家蚕品种秋丰为研究对象,从2龄幼虫起限制采食(DR),每日1次给桑,自由采食16 h后强制停食8 h;以每日2次给桑的全天自由采食(AL)为对照。4-5龄期雌、雄分开饲养,选取3个与无脊椎动物寿命相关基因的家蚕同源基因BmSir2(Bombyx mori silencing information regulator 2)、BmAmpk(Bombyx mori adenosine activated protein kinase)和BmCox(Bombyx mori cytochrome C oxidase),利用qRT-PCR技术分析5龄3 d时的mRNA水平。进一步用RNAi技术敲减上述3个基因,调查其对成虫寿命的影响。结果显示,家蚕幼虫各组织中,3个寿命相关基因在DR组与AL组均呈现不同程度的表达差异;与雌性相比,限食后雄性的BmSir2、BmAmpk、BmCox在各组织中的表达上调更加明显;RNAi后3个基因的表达均显著下调,与对照组(dsGFP)相比成虫寿命显著缩短。结果表明限食促进寿命相关基因表达上调,且促进寿命延长。

家蚕bmo-miR-3385-3p抑制丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了探究家蚕中miRNA对丝素蛋白轻链基因(BmFib-L)表达的调控作用,以BmFib-L 3'UTR序列为靶序列,用RNAhybrid软件在线预测miRBase数据库中对靶基因具有调控作用家蚕miRNA,筛选到1个候选miRNA bmo-miR-3385-3p;采用荧光定量方法分析miR-3385-3p在幼虫5龄第1~7天后部丝腺和5龄第3天不同组织及BmFib-L在5龄第1~7天后部丝腺的表达水平;构建miR-3385-3p表达载体pcDNA3.0(ie1-egfp-pre-miR-3385-3p-SV40)和含萤火虫荧光素酶报告基因的BmFib-L 3'UTR重组质粒pGL3.0(A3-luc-BmFib-L-3'UTR-SV40),并人工合成miR-3385-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,利用双荧光素酶检测系统验证miR-3385-3p对BmFib-L表达的调控作用。同时,对预测的BmFib-L 3'UTR上miR-3385-3p的靶位点进行了突变,在BmN细胞中进行了验证。进一步采用丝腺离体培养瞬时表达和5龄幼虫体腔注射转染物的方法,通过荧光定量分析后部丝腺靶基因表达水平的变化,验证miR-3385-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用。结果表明,miR-3385-3p和BmFib-L在后部丝腺都有较高的表达水平,miR-3385-3p具备调控BmFib-L的可能性;在BmN细胞中miR-3385-3p对BmFib-L的表达具有显著抑制作用,预测的靶位点突变后miR-3385-3p对BmFib-L基因的表达没有抑制作用。在离体培养丝腺中和幼虫体内miR-3385-3p都显著下调BmFib-L基因的表达。由此证明,BmFib-L是miR-3385-3p的靶基因之一,miR-3385-3p可抑制BmFib-L的表达。

家蚕Ras3基因全长cDNA克隆及在感染BmNPV家蚕组织中的表达谱分析

Ras(rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白是GTPase超家族成员之一,该蛋白质可以将细胞外信号传导到不同的细胞,从而调控细胞的吞噬作用、凋亡、抗微生物侵染的酶防御系统等生理过程。运用RACE技术,从家蚕中肠中克隆出一个新的BmRas3基因,该基因cDNA全长987 bp,包含5′UTR(153 bp)、3′UTR(279 bp)和一个编码184个氨基酸残基的ORF(555 bp)。BmRas3具有小G蛋白的典型特征,其氨基酸序列中含有3个GTP/GDP结合结构域,1个效应子结合结构域以及1个烯丙基化的CAAX基序。多重比对发现BmRas3与海波斯莫科马属蛾(Hyposmocoma kahamanoa)Rap1、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)Rap-1b、烟草天蛾(Manduca sexta)Rap1的序列相似性较高,系统进化分析也显示BmRas3与这些蛋白质的亲缘关系最近。BmRas3在食桑期的表达量高于眠期;在感染BmNPV的家蚕中肠和脂肪体中,BmRas3的表达量有不同程度提高,且与正常对照相比差异显著,暗示BmRas3可能作为免疫活化因子,在家蚕抵抗BmNPV的入侵过程中发挥着重要作用。研究结果为下一步探讨BmRas3对BmNPV感染的应答提供了理论基础。