糖尿病小鼠皮肤与胰腺微循环功能受损

目的探讨糖尿病小鼠微循环功能变化。方法 BALB/c小鼠随机分为对照组(n=10)和糖尿病组(n=20)。常规STZ制备糖尿病模型,心脏灌流后取材,HE染色观察胰腺组织及胰岛微血管形态学及病理改变。用免疫组织化学染色,观察胰岛及胰岛微血管内皮细胞的形态学及病理改变、胰岛素及胰岛微血管PECAM-1的表达。用Moor LDLS检测皮肤微循环血流灌注水平;用Moor VMS-LDF检测胰腺微循环血流灌注及微血管自律运动功能。结果糖尿病小鼠胰岛形态不规则,完整性破坏;胰岛微血管内皮细胞PECAM-1表达失去连续性;胰岛中胰岛素染色阳性面积显著低于对照组(P<0.05)。糖尿病组小鼠皮肤微循环总血流灌注显著降低(P<0.01)。糖尿病组小鼠胰腺微血管自律运动频率和振幅均显著低于对照组(P<0.01,P<0.001)。结论 STZ诱导的BALB/c糖尿病小鼠微循环功能受损。

两种细胞增殖分析方法的比较性研究

目的比较MTT法和EdU标记法两种常用测定细胞增殖的方法的优劣。方法以化疗药物顺铂浓度梯度处理前列腺癌细胞株PC-3,分别采用MTT法和EdU标记技术进行细胞增殖变化测定。结果 MTT组顺铂浓度增至5μg/mL时细胞活力和增殖明显受抑(P<0.05);EdU掺入组顺铂浓度增至2μg/mL时增殖细胞阳性率和胞内荧光强度均显著下降(P<0.05)。结论 MTT法简单、快速、经济,结果与活细胞数有关,间接反映细胞的增殖状态;EdU标记技术灵敏、客观,特异性标记分裂期细胞,直接反映细胞的增殖。

微血管周细胞收缩功能的研究进展

周细胞定位在微血管壁外侧,是微血管的重要组成细胞之一,它在微血管的形成及局部血流调节中发挥重要作用。周细胞是类似平滑肌细胞的一类细胞,表达多种收缩蛋白,具有收缩性。周细胞收缩可调节微血管管径及血流,控制局部微血流的灌流量。近年,越来越多的研究表明周细胞的收缩功能与多种微血管疾病的病变过程有关,因此日益受到关注。对其收缩功能的进一步理解,可能为治疗微血管疾病提供新的方法。

激光多普勒对糖尿病小鼠微循环自律运动功能的评估

目的:探讨激光多普勒对糖尿病小鼠微循环自律运动功能的评估价值。方法:20只BALB/c小鼠随机分为糖尿病组(n=10)和对照组(n=10)。连续5天腹腔注射40 mg/kg STZ诱导糖尿病模型;应用Moor LDLS检测糖尿病小鼠皮肤微循环血流灌注水平;应用Moor VMS-LDF检测糖尿病小鼠胰腺微循环血流灌注及微血管自律运动功能。结果:糖尿病小鼠皮肤微循环血流灌注显著降低,皮肤总血流灌注量(P=0.009)、胰腺微血管自律运动频率(P<0.001)和振幅(P<0.001)均显著低于对照组小鼠。结论:联合应用Moor LDLS激光多普勒扫描成像系统及Moor VMS-LDF激光多普勒血流灌注监测系统可作为糖尿病小鼠微循环功能状态的评估手段。

mTOR信号通路与相关疾病的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种进化上高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族,主要调控细胞生长、增殖、凋亡和自噬。生理和病理状态下,mTOR信号通路在蛋白质翻译、合成、细胞代谢和应激反应中发挥重要作用。mTOR与特定的接头蛋白形成复合体mTORC1和mTORC2。近年研究表明,mTOR和mTOR信号通路与心血管疾病(高血压和心肌梗死)、葡萄糖和脂质代谢相关疾病(糖尿病)及自身免疫性疾病(多发性硬化症)密切相关。因此,ATP竞争性mTOR激酶抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂和mTORC1/mTORC2选择性抑制剂及mTOR和mTOR信号通路靶向抑制剂在上述疾病的临床治疗中具有一定的价值。

1型糖尿病小鼠胰岛微血管内皮细胞超微结构受损

目的:探讨1型糖尿病小鼠胰岛微血管内皮细胞的超微结构改变。方法:BALB/c小鼠随机分为糖尿病组和对照组,每组6只。应用免疫组化染色检测胰岛素及胰岛微血管血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)表达水平;应用透射电镜观察糖尿病小鼠胰岛β细胞及胰岛微血管超微结构变化。结果:糖尿病组小鼠胰岛β细胞数量、β细胞/α细胞数量比、β细胞分泌颗粒数量及胰岛素阳性染色面积百分比显著降低(P<0.01)。糖尿病组小鼠胰岛微血管数量,CD31表达水平显著降低(P<0.01);微血管内皮细胞及胰岛周细胞线粒体肿胀变性;微血管基膜厚度显著升高(P<0.01)。结论:1型糖尿病小鼠胰岛微血管内皮细胞超微结构受损。

氯化钴致低氧诱导肺癌细胞系A549 DLL4表达上调并分泌促HUVEC迁移物

目的探讨氯化钴(CoCl2)化学模拟低氧对肺癌细胞(A549)DLL4表达的影响及其与内皮细胞迁移的关系,为寻找抗肿瘤血管新生的潜在靶点提供理论依据。方法 A549分为对照组和CoCl2干预低氧组,EdU掺入法测定细胞增殖;用免疫荧光细胞染色和Western blot测定DLL4和低氧诱导因子HIF-1α在A549细胞中的表达;细胞划痕实验检测脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移变化。结果低浓度氯化钴(200μmol/L)干预12 h后,A549细胞增殖没有明显抑制,DLL4和HIF-1α的表达均明显上调,低氧组DLL4蛋白表达为0.194±0.028显著高于对照组的0.098±0.015(P<0.05)。培养上清液促进HUVEC迁移。结论低氧明显上调A549细胞DLL4的表达,其对内皮细胞的迁移趋化作用提示其为抗肿瘤血管新生治疗的潜在靶点。

高脂饮食诱导小鼠血糖增高损伤睾丸微血管功能

目的观察高脂饮食诱导C57BL/6雄性小鼠血糖升高对睾丸微血管功能及雄性生殖的影响。方法将小鼠随机分为对照组(control)和高脂组(HFD),各20只。HFD组高脂饮食20周,每周测血糖及体质量;腹腔注射伊文思蓝观察血睾屏障通透性;激光多普勒检测睾丸微循环血流量及微血管自律运动频率和振幅;HE染色观察睾丸组织形态;免疫组化检测睾丸微血管血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)及生精细胞增殖细胞核抗原PCNA表达;TUNEL染色法观察生精细胞凋亡。结果 HFD组小鼠体质量及血糖均高于对照组(P<0.01);血睾屏障完整性破坏,生精小管通透性增高;睾丸平均血流灌注水平及微血管自律运动频率和振幅均低于对照组(P<0.01);生精上皮细胞数量减少、生精上皮变薄;微血管内皮细胞CD31及生精细胞PCNA表达水平均低于对照组(P<0.01);生精细胞凋亡水平高于对照组(P<0.01)。结论高脂饮食可诱导小鼠血糖水平增高致睾丸微血管损伤破坏血睾屏障完整性使小鼠生精上皮结构受损。

血红素加氧酶-1上调自发性高血压大鼠肝脏MMP-2与MMP-9表达

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对自发性高血压大鼠(SHR)肝脏基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与-9(MMP-9)表达的影响。方法大鼠随机分为4组:Wistar诱导组(WH)与SHR诱导组(SH)按15 mg/kg每天连续4天腹腔内注射浓度为8 g/L的氯化血红素(hemin)诱导HO-1表达;Wistar对照组(W)与SHR对照组(S)腹腔内注射等体积0.1 mol/L NaOH(pH 8.3)。检测大鼠尾动脉收缩压。免疫组化法分析肝脏HO-1及MMPs表达。明胶酶谱法检测血浆MMP-2及MMP-9的相对活性。结果 WH组与SH组肝脏HO-1、MMP-2与MMP-9表达量均显著高于W组与S组。HO-1诱导可显著降低SHR大鼠血压。S组血浆MMP-2及MMP-9相对活性显著高于W组。WH组与SH组血浆MMP-2及MMP-9相对活性显著高于W组与S组。结论 HO-1可上调SHR肝脏MMP-2与MMP-9表达。

大鼠胰岛周细胞的分离培养与鉴定

胰岛周细胞分布于胰岛毛细血管和微血管管壁,是胰岛微循环的重要组成细胞之一,具有维持胰岛β细胞正常生理功能的作用.胰岛周细胞数量及功能异常可能是糖尿病及其并发症的病理生理基础.周细胞具有组织来源特异性,应用胰岛周细胞研究其在糖尿病发病机制中的作用更为合理.本研究旨在建立大鼠原代胰岛周细胞的分离培养及鉴定方法,为研究周细胞及胰岛微循环在糖尿病发病机制中的作用提供细胞学基础.

SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定

目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。方法以经体外培养及10μmol/L褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象,分别采用Tricine-SDS-PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋白分离及结果比较,以FT-MS二级质谱鉴定。结果经Tricine-SDS-PAGE分离后,选取分子量为53 ku左右的趋势性差异表达蛋白进行FT-MS分析,质谱鉴定为微管蛋白-α3(吻合度评分为87)。经双向凝胶电泳分离后,于凝胶近酸性端、分子质量在72～95 ku之间区域,选取蛋白表达量较高的一点,质谱鉴定其为人热休克蛋白90-α(吻合度评分为91)。结论 Tricine-SDS-PAGE对于大致35～62 ku范围的蛋白分离较清晰、重复性好且样品用量少,2-DE对最低上样量有较严格要求,但它能提供分子质量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋白点,且对大分子质量蛋白的分离效果更佳,经质谱鉴定结果理想。

脑微血管内皮细胞与周细胞共培养构建体外血脑屏障模型

目的应用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell，BMVEC）与脑周细胞共培养建立可模拟在体状态的稳定体外血脑屏障（blood—brain barrier，BBB）模型。方法原代分离、纯化培养大鼠BMVEC和周细胞，通过免疫细胞化学染色方法鉴定分离的细胞，应用Transwell插槽（孔径0．4μm）共培养构建体外BBB模型，经4h渗漏试验、紧密连接蛋白鉴定、跨内皮电阻检测以及通透性试验评价其屏障功能，比较共培养模型与单纯BMVEC模型膜两侧电阻值差异以及对小分子荧光素钠（sodium fluorescein，Na-F）通透性的差异。结果融合的BMVEC单层呈现典型的鹅卵石样外观，脑周细胞呈典型的不规则外形并具有重叠生长等特性。免疫双标法鉴定显示，脑周细胞阳性表达ol一平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）和神经元一胶质抗原2（neuron-glial antigen2，NG2）；共培养模型内皮细胞融合后，液面渗漏试验呈阳性；免疫细胞化学染色显示，内皮细胞间形成连续而致密的紧密连接；与BMVEC模型相比，共培养模型跨内皮细胞电阻[（190．762±10．326）Q耐对（96．503±8．012）Ω／cm^2；t=-24．489，P〈0．01]显著增高，通透性显著降低（为单内皮模型的56．149％±3．572％；卢19．330，P〈O．01）。结论原代分离大鼠BMVEC和周细胞共培养体外模型的形态、结构及屏障功能具备BBB的基本特征，为研究BBB提供了一种有用工具。

高脂饮食诱导C57BL/6小鼠睾丸微血管损伤导致非感染性睾丸炎症反应

目的探讨高脂饮食诱导雄性C57BL/6小鼠睾丸微血管损伤与高脂诱导的睾丸非感染性炎症反应的关系。方法雄性C57BL/6小鼠,完全随机法分为高脂组(high fat diet,HFD,n=20)和对照组(control,n=20)。对照组普通喂养,高脂组小鼠高脂饮食喂养,共喂养20周,每周检测体质量及血糖。激光多普勒血流灌注监测系统检测两组小鼠睾丸微血管血流灌注量。HE染色观察生精细胞及睾丸微血管形态学变化;免疫组化法检测睾丸微血管内皮细胞CD31、炎症因子TNFα及巨噬细胞特异性标志物F4/80的表达水平;ELISA法检测血清及睾丸组织匀浆中炎症因子TNFα和MCP-1的含量;TUNEL染色法检测小鼠睾丸生精细胞凋亡水平。结果高脂组小鼠体质量及血糖水平均显著增加与对照组比较,差异具统计学意义(P<0.01);睾丸微血管平均血流灌注水平显著低于对照组(P<0.001);HE染色显示高脂组小鼠成熟生精细胞减少,睾丸间质膨大,结构松散;高脂组睾丸微血管CD31表达低于对照组(P<0.05),TNFα及F4/80表达水平高于对照组(P<0.01);TNFα和MCP-1在血及睾丸蛋白中的表达量显著高于对照组(P<0.001);TUNEL染色结果显示生精细胞凋亡水平高于对照组(P<0.01)。结论高脂饮食诱导C57BL/6小鼠血糖增高致睾丸微血管损伤并发非感染性睾丸炎症反应。

聚乙二醇交联血红蛋白辅助肿瘤化疗下调移植瘤模型中EPO／EPOR的表达

目的检测血液代用品——聚乙二醇交联血红蛋白（PEG—Hb）联合顺铂对肿瘤促红细胞生成素及其受体（EPO／EPOR）表达和血管新生的影响。方法HeLa细胞接种到裸鼠右腋下建立宫颈癌荷瘤模型。40只荷瘤裸鼠随机分为4组：对照组，顺铂（5mg／kg）组，聚乙二醇交联血红蛋白组（0．6g／kg），聚乙二醇交联血红蛋白（0．6g／kg）联合顺铂（5mg／kg）组。治疗4周，观测绘制移植瘤生长曲线，计算各组肿瘤生长抑制率，CD31免疫组化染色定量分析瘤体微血管密度（MVD），免疫组化染色测定肿瘤组织低氧诱导因子-c（HIF-1α）和EPO／EPOR的表达，Western—blot分析肿瘤EPOR蛋白表达，ELISA测定血清中EPO含量。结果PEG-Hb联合顺铂组（第4组）与其他各组比较瘤体明显缩小，CD31、HIF-1α和EPO／EPOR表达下调；第4组肿瘤组织内皮细胞EPOR表达较其他组明显降低；Western—blot测定EPOR蛋白表达在第4组明显降低，血清EPO水平也下降。结论PEG-Hb具有辅助化疗增敏作用，抑制瘤体血管新生，下调EPO／EPOR的表达，为探讨PEG-Hb在辅助肿瘤化疗中的作用机制提供了依据。