实验室小规模微生物琼脂平板发酵培养操作模式优化

微生物发酵主要分为固态和液态两种模式，在实验室和工业生产中，固态和液态发酵培养均具有广泛的应用。在科研单位微生物实验室中，琼脂平板（或培养皿）和摇瓶分别是微生物固态与液态发酵培养的常用器皿；琼脂培养基平板不仅可以用于制备液态发酵的起始种子或孢子悬液，更可以为科研单位微生物实验室提供一定数量的发酵培养物，用于分离纯化或积累目标样品化合物。

海洋放线菌天然活性产物的发掘

海洋微生物生活在高盐、高压、低温、低营养或无光照等特殊生境,造就了其种类的多样性和特殊性,能产生海洋微生物所特有的结构新颖、作用特殊的生物活性物质。在海洋微生物中放线菌具有较为复杂的发育分化过程,还能产生大量次级代谢产物。该文综述了近年来从海洋放线菌中筛选天然活性化合物的有效方法,包括优化培养基,改进培养方法和检测技术,运用基因组挖掘技术等。这些有效方法的运用使得从海洋放线菌中筛选生物活性物质具有广阔的开发应用前景。

利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌

可利霉素(Carrimycin,CAM)是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferase gene,ist)导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成基因簇相距较远,且具有两种抗性基因,难以对其进行基因改造,因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点,将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游,获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2,经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株,以54IA-2为出发菌株,利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin,RFP)抗性菌株,在RFP浓度为40μg/mL的抗性菌株中,ISP的产量明显提高,最高可达842.9μg/mL,比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析,每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸,在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述,本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2,并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8,为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。

复合诱变选育抗菌肽Sublancin高产菌株

Bacillus subtilis BF168可以产生一种新型的抗菌肽Sublancin,Sublancin具有明显的抗革兰氏阳性菌活性,但产量较低。为了获得Sublancin高产菌株,对其产生菌B. subtilis BF168进行诱变选育研究。以B. subtilis BF168为出发菌株,采用加热、紫外(Ultraviolet,UV)、氯化锂(Li Cl)、微波(Microwave,MW)和UV-Li Cl、UV-MW、MW-LiCl处理技术分别进行单一诱变和复合诱变,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在培养基平板上培养后获得单菌落,通过菌株致死率和正突变率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果表明:单一诱变最佳参数分别是热诱变为80℃处理10 min;UV诱变为功率30 W、照射距离30 cm、照射时间90 s;Li Cl诱变浓度为12 g/L;MW诱变为脉冲频率2 450 MHz、功率800 W、辐射时间100 s。在不同诱变方法对比中发现,UV-Li Cl复合诱变方式可获得最高的正突变率,以突变株的发酵效价为指标的正突变率和致死率分别为21.05%和92.18%,复筛效价是出发菌株1.6倍以上的有4株,占复筛菌株的10%。经过多种方法复合诱变,最终获得一株遗传性状稳定的Sublancin高产菌株UL2,在培养温度为37℃、210 r/min的条件下,经过28~30 h培养后,该菌株的相对效价达到(204±2.83)%。实验证实UV-LiCl复合诱变可以显著提高BF168菌株的Sublancin发酵产量。

利用CRISPR-Cas9系统构建新型异戊酰螺旋霉素Ⅰ产生菌

异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)Ⅰ是必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)的一种主组分,其抗菌活性与BT相似,而且作为单一组分在质控和剂型上更具优势,目前正在进行临床前研究。原有的 ISPⅠ工程菌株经过3次基因改造,已经具有2种抗性基因,很难再进行遗传操作。前期研究利用经典同源重组的方法无法构建无抗性的ISPⅠ产生菌,文中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在螺旋霉素(Spiramycin,SP)产生菌中成功将3位酰基化酶的基因bsm4替换为组成型强启动子ermEp~*控制下的异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltansferase gene,ist)。删除bsm4后突变株只能产生SPⅠ组分,外源基因ist的表达产物催化SPⅠ在其4″位进行异戊酰化修饰形成ISPⅠ。经过HPLC和质谱鉴定,阳性菌株ΔEI的发酵产物中只有ISPⅠ一种ISP组分,证实新的ISPⅠ工程菌株构建成功。ΔEI菌株不带有抗性基因,可重复利用CRISPR-Cas9系统进行基因操作来获得新的改良菌株。