新西兰白鼠狼疮性肾炎易感基因的染色体定位

目的 :探讨新西兰白鼠 (NZW)狼疮性肾炎 (LN)的遗传易感基因。 方法 :建立 (NZBxNZW )F1xNZB回交小鼠模型 ,采用覆盖小鼠除性染色体以外全部 19条染色体的多态性微卫星遗传标记及数量性状位点 (QTL)分析进行基因定位 ,并应用限制性长度多态方法比较LN易感基因的多态性 ,将小鼠的累积蛋白尿定性作为LN的表现型。 结果 :QTL分析结果显示 ,(NZBxNZW)F1xNZB回交小鼠LN易感基因位点分别与NZW小鼠第 11染色体微卫星遗传标记D11Mit2 6 3及 17染色体微卫星遗传标记D17Mit6 1肯定连锁 (Lod值 >3)。D11Mit2 6 3位点附近存在粒细胞集落刺激因子 3基因 ,D17Mit6 1位点附近存在 (TNF)α和H 2基因。同时携有D17Mit6 1基因B/W型和D11Mit2 6 3基因B/W型两个易感基因位点组的蛋白尿的阳性率比单基因组增高。 结论 :NZW来源的Csf3基因及TNFα(或H 2 )基因是新西兰小鼠LN重要的易感基因。

HepG2细胞构成的生物人工肝脏体外氨与安定的代谢能力

目的:为增强HepG2细胞的氨和苯二氮(?)类代谢活性, 在Enosawa et al的HepG2-GS细胞基础上以转基因技术,建立一种谷氨酰胺合成酶(glutamine sythetase,GS) 和细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)都过表达的HepG2- GS-3A4细胞.并在人工肝脏循环器中培养此细胞,以检测此人工肝脏的氨和安定(Diazapam,DZP)的代谢率. 方法:以Western杂交和免疫组化等方法证实CYP 3A4 蛋白过表达后,将HepG2-GS-3A4细胞接种于一种人工肝脏循环器,待细胞数量增至足够后,充入含NH4Cl和安定的培养液,孵育24 h,定时取样,分别以Berthelot反应法检测氨浓度,以HPLC法检测DZP 及其代谢产物. 结果:CYP 3A4蛋白在HepG2-GS-3A4细胞中表达显著强于HepG2细胞(P=0.02).在接种有HepG2-GS- 3A4细胞的生物人工肝脏循环器中与HepG2细胞和无细胞组相比,氨浓度明显降低(P=0.04),氨浓度约降低约31.7%;DZP浓度也明显降低(P=0.03),且有DZP 的代谢产物生成产生,DZP浓度约降低36.7%. 结论:接种有HepG2-GS-3A4细胞的生物人工肝脏有明显的DZP和氨的代谢能力,代谢能力虽弱于文献中的猪原代肝细胞,但具有性质稳定,易于传代和储存,获取细胞数量不受限制等优点.

不同处理技术对流式细胞术检测淋巴细胞免疫表型的影响

通过比较全血法和提取单个核细胞法两种不同处理方法对淋巴细胞免疫表型检测结果和细胞活率的影响。证明上述两种方法对免疫表型和细胞活率的影响存在明显差异性,本试验将为正确选择所需试验方法提供理论依据。

一特殊的可变性红斑角化症家系的研究

收集一个特殊的可变性红斑角化症的北方汉族家系血样,从血样中提取DNA,利用直接测序法测定其GJB3和GJB4序列。在本家系中未发现GJB3与GJB4的突变。

人肾癌组织中热休克蛋白70的纯化与鉴定分析

目的探讨人肾癌组织中热休克蛋白70纯化的有效方法,并进行鉴定分析。方法应用两次亲和层析和离子交换层析获得目的蛋白,经电泳和Western-blot定性分析,应用改良的Bradford法定量分析。结果经过二次亲和层析和MonoQ柱的分离后,得到纯度较高的分子量约为70kDa的蛋白质,经免疫印迹分析证实该蛋白质即为HSP70。与其他方法相比HSP70的纯度更高,获得率接近。结论该文所述方法是一种简单有效的纯化肿瘤组织中HSP70的方法。

乳腺癌手术前后血清中可溶性E-钙黏连蛋白的表达及临床意义

目的检测乳腺癌患者手术治疗前后血清中可溶性E-钙黏连蛋白(EC)的表达并探讨其临床意义。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测42例乳腺癌患者手术前后、18例乳腺良性病变患者手术前后以及30例健康人血清中可溶性EC的表达水平。并分析乳腺癌手术前后血清中可溶性EC的水平变化及与其临床病理特征的关系。结果乳腺癌患者术前血清可溶性EC较乳腺良性病变患者和健康人显著升高;乳腺癌患者术后血清可溶性EC水平较术前明显下降;高分期以及伴有淋巴结转移的乳腺癌患者的血清可溶性EC明显高于低分期及无淋巴结转移患者(P<0.05)。结论乳腺癌患者血清可溶性EC在手术前后的表达具有特异性并且与肿瘤病理分期以及淋巴结转移显著相关,可能成为乳腺癌患者预后的预测因素。

肾动脉结扎法制作慢性肾功能衰竭犬模型方法的探索

采用肾动脉分支结扎法制作慢性肾功能衰竭犬模型,发现该方法简单、有效、易行,术后长期存活率高。

幽门螺杆菌cagA菌株感染对IL-8蛋白在胃癌组织中表达的影响

目的 探讨胃癌组织中HpcagA菌株感染对IL 8蛋白表达的影响。方法 采用流式细胞技术 ,对 2 7例胃癌及相应的癌旁正常组织中IL 8蛋白的表达进行定量检测。用PCR法 ,对 2 7例胃癌组织中HpcagA基因进行扩增。结果 2 7例胃癌组织中 ,有 2 5例 (92 % )可明显表达IL 8蛋白 ;而相应的癌旁正常组织中 ,基本没有IL 8蛋白的表达或仅有弱表达。HpcagA感染的胃癌组织中 ,IL 8的表达水平为 6 4 .2 7% ,高于未感染HpcagA的胃癌组织 (39.86 % )。结论IL 8在胃癌组织中的高表达与HpcagA感染有关 ,即HpcagA菌株感染可上调IL

直肠癌组织CD44v6,DNA含量的联合检测及临床意义

目的:探讨直肠癌CD44v6表达情况和DNA含量及其临床意义.方法:应用流式细胞术同时检测40例直肠癌及10例正常组织中CD44v6 表达量和DNA含量.结果:直肠癌中CD44v6表达量和DNA含量均显著高于正常组织(70％vs 0％,1.11± 0.6 vs 0.9±0.65,P<0.01),肿瘤组织中CD44v6阳性表达与直肠癌浸润深度(0％vs50％vs 80％vs 100％)、淋巴结转移(93.3％vs 56.0％)及Dukes分期(56.0％vs 93.3％)有关(P<0.05);DNA异倍体与淋巴结转移(100％vs 68％)及 Dukes分期(68％vs 100％)有关(P<0.05).CD44v6表达与肿瘤细胞DNA倍体无关(85.7％vs68.7％,P>0.05).结论:CD44v6表达异常及DNA倍体异常在直肠癌进展和浸润转移中起作用,联合检测CD44v6和DNA倍体可作为预测直肠癌进展程度、淋巴结转移有用的指标.

反相高效液相色谱法测定人乳腺癌MCF7细胞中基因组DNA甲基化水平

目的利用反相高效液相色谱法检测MCF7细胞系中基因组DNA的甲基化水平。方法采用Nano LC(75μm×15 cm,5μm)和Micro LC(1.0 mm×15 cm,5μm)的C18反相色谱柱,以甲醇-醋酸铵缓冲液(pH 5.0)为流动相,使用线性梯度程序,将MCF7细胞中基因组DNA水解产物进行分离,两种体系流速分别是300 nl/min和40μl/min,在273 nm波长处检测,利用外标法分别检测DNA中脱氧胞嘧啶(dC)和甲基化脱氧胞嘧啶(5mdC)含量。结果 MCF7基因组DNA的水解产物,经反相色谱分离得到的峰图有较好的准确性与重复性;DNA水解后的产物为弱保留化合物,且Micro LC分离效果优于Nano LC;乳腺癌细胞MCF7甲基化水平为19.3%,高于正常细胞中基因组DNA甲基化水平。结论成功的将MCF7细胞中基因组DNA水解产物经反相色谱分离;使用Micro LC分离DNA水解后的弱保留产物较佳;MCF7细胞系基因组DNA甲基化水平高于正常细胞。

血清抗甲状腺球蛋白抗体测定在甲状腺结节中的诊断意义

目的测定血清抗甲状腺球蛋白抗体（anti-TgAb）对甲状腺结节的诊断意义。方法对176例术前诊断为甲状腺结节患者的血清采用化学发光免疫分析法测定anti-TgAb。术后经石蜡病理确诊为甲状腺癌（TC）、腺瘤（TA）、结节性甲状腺肿（NG）、桥本病（HD）分别有69,40,55,12例。比较各组间anti-TgAb中位数和anti-TgAb超出正常值的例数的差异。结果HD的anti-TgAb测定值显著高于TC、TA和NG（P均〈0.05）。HD中anti-TgAb〉102IU/ml的例数显著高于TC、TA和NG（P均〈0.05）;TC中anti-TgAb〉102IU/ml的例数显著高于TA和NG（P均〈0.05,95%CI分别为1.25-26.43和2.09-127.33）。结论血清anti-TgAb测定值增高最常见于HD,而且测定值越高越有诊断意义。血清anti-TgAb测定值中度以上增高除HD外最常见于TC。anti-TgAb中度增高不是甲状腺结节的手术禁忌证。

米诺环素后处理通过抑制PARP过度活化减轻心肌缺血/再灌注损伤

目的:探讨米诺环素后处理能否通过抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)过度活化减轻大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤。方法:结扎大鼠冠状动脉左前降支45 min,再灌注2 h,建立心肌I/R模型。将90只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组,I/R组,低、高剂量米诺环素组及PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)组。氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思蓝双染法检测心肌梗死范围,HE染色观察心肌组织形态学改变,TUNEL法评估心肌细胞凋亡程度,酶联免疫吸附法测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)含量,Western blot法检测再灌注心肌及外周血白细胞内PARP-1活化产物多腺苷二磷酸核糖(PAR)的表达。结果:与sham组比较,心肌、外周血白细胞内PAR表达及血清TNF-α、IL-1β含量明显升高。与I/R组比较,米诺环素低、高剂量及3-AB后处理组均能显著减少梗死范围及心肌细胞凋亡程度,同时明显降低心肌、外周血白细胞内PAR表达及血清TNF-α、IL-1β含量。米诺环素高剂量组与3-AB组比较无显著差异。结论:米诺环素后处理可能通过抑制心肌及外周血白细胞PARP过度活化减轻大鼠心肌I/R损伤。

核转录因子κBp65在子宫颈鳞癌中的表达及意义

目的: 探讨核转录因子κB(NF- κB)p65蛋白在人宫颈鳞癌组织中的表达及意义。方法: 32例人宫颈鳞状细胞癌为实验组,慢性宫颈炎及正常宫颈组织各30例为对照组。应用免疫组织化学方法检测NF- κBp65蛋白在组织中的表达水平。结果:免疫组织化学方法显示32例宫颈癌组织中NF- κBp65蛋白阳性表达率为68. 7.%,慢性宫颈炎组织中NF -κBp65蛋白阳性表达率为6. 66%,而30例正常组织中无表达,实验组与对照组之间差异显著(P<0.05)。结论:NF- κB活化与宫颈癌的发生有关,NF -κBp65可能成为人宫颈癌治疗的新靶点。

IL-10RA基因多态性及其与系统性红斑狼疮关系的研究

目的:确定SLE模型小鼠IL-10RA基因变异及其与SLE表现型是否存在关联。方法:用微卫星遗传标记及数量性状位点(QTL)分析方法确定SLE模型小鼠B/W F1的SLE易感基因精确染色体定位并选取候选易感基因,对候选易感基因进行测序分析,选取有基因序列异常的候选易感基因进行PCR-SSCP分析,确定候选易感基因碱基序列变异位点与抗染色质抗体、抗DNA抗体,抗组蛋白抗体及蛋白尿等SLE表现型的相关关系。结果:QTL分析结果表明B/W F1×NZB小鼠抗染色质抗体易感基因与NZW型IL-10RA基因紧密连锁;测序分析发现IL-10RA基因编码区有18处碱基变异,其中7处碱基变异将导致编码氨基酸的变异;抗染色质抗体、抗DNA抗体,抗组蛋白抗体及蛋白尿等SLE表现型与NZW型IL-10RA基因密切相关。另一种SLE模型小鼠MRL的IL-10RA基因存在相同变异。结论:NZW小鼠IL-10RA基因编码区碱基序列存在变异,B/W F1×NZB小鼠SLE表现型与NZW小鼠第9染色体IL-10RA编码区碱基变异相关,提示IL-10RA可能是SLE模型小鼠的一个SLE易感基因。

白细胞介素10信号转导机制对C57BL/6和MRL/lpr^-小鼠腹腔巨噬细胞功能及活性影响的比较

目的:体外比较白细胞介素10(IL-10)信号转导机制对C57BL/6和MRL/lpr-小鼠腹腔巨噬细胞功能及活性的影响。方法:分别分离C57BL/6和MRL/lpr-小鼠腹腔巨噬细胞进行培养;用不同浓度IL-10(0.01、0.1、1和10ng/ml)进行刺激,用MTT法测定比较两种品系小鼠腹腔巨噬细胞的增殖反应能力;Real time PCR分别测定其产生前炎性细胞因子IL-1α、M-CSF、TNF-α的量;用100ng/mlIL-10分别刺激两种品系小鼠腹腔巨噬细胞10分钟,免疫印迹法比较两种细胞中JAK1、TYK2、STAT3及磷酸化水平。结果:C57BL/6小鼠巨噬细胞数及其产生的前炎性细胞因子量随IL-10刺激浓度的增加而递减;MRL/lpr-小鼠巨噬细胞数及其前炎性细胞因子IL-1α、M-CSF的量随IL-10刺激浓度的增加而递增,但巨噬细胞产生TNF-α的量随IL-10刺激浓度的增加而递减;MRL/lpr-小鼠细胞内信号转导分子的磷酸化水平低于C57BL/6。结论:MRL/lpr-小鼠的细胞免疫和炎症反应不能被IL-10抑制,可能是由于其信号转导过程中的缺陷所致。

流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的免疫学相关研究

目的研究用流感病毒反向遗传技术合成的rH5/PR8融合病毒株的免疫学特性,为人工合成的融合流感病毒株,作为疫苗株的免疫性、有效性、稳定性及可持续性提供科学数据。方法用流感病毒反向遗传技术合成减毒rH5/PR8融合病毒株,用动物实验确认此病毒株的免疫原性、免疫稳定性及免疫防御实验确认防御效果。结果人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外,均来自A/PR/8/34(PR8),HA来自H5N1强致病性鸡流感病毒,剪除第346-349的碱性氨基酸(RKKR)部位。用灭活rH5/PR8病毒免疫鸡后,平均抗体水平HI Titer达到29以上,持续达1个月之久;免疫原在一定条件下保存2个月及4个月后重复上述实验,抗体水平上升与立即免疫组相似,有效抗体水平可持续到免疫后7个月以上,表明rH5/PR8病毒HA5抗原稳定,不易被降解;免疫防御实验表明:非免疫组鸡的死亡率达到60%左右,而免疫组无死亡,防御率达到100%,表明免疫防御有效。结论用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合减毒病毒rH5/PR8株,外来基因HA5抗原性安定、免疫原性可靠,有效抗体持续时间长,免疫防御有效。

流感病毒反向遗传技术合成rH_5/PR8融合病毒的生物学活性

目的探讨用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株的生物学活性,对人工合成的融合流感病毒株进行全面、系统地研究,对其作为疫苗株的可行性、有效性提供科学依据。方法用流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8减毒病毒株,测定5代病毒与原代病毒HA基因序列,确认外来基因的遗传稳定性;用细胞实验确认其增殖性,用动物实验确认其致病性的强弱。结果人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外,均来自A/PR/8/34(PR8),HA来自H5N1型强致病性禽流感病毒,第1050碱基从G定点突变成C,导致344号氨基酸从精氨酸变为苏氨酸,并剪除第1054～1065碱基,致使第346～349的碱性氨基酸(RKKR)部位被去除。该病毒的增殖能力可以达到109PFU/ml,外来基因HA5基因遗传稳定、不易变异,达到疫苗株的要求;鸡脑内即静脉接种活病毒实验证实病毒呈现弱毒性。结论用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株有良好的增殖性及基因遗传稳定性,用基因剪切技术对HA的碱性氨基酸连续序列的敲除可以减低病毒的致病性,对鸡呈现弱毒性。

结直肠癌组织的二维荧光差异凝胶电泳分析

目的以二维荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)技术分析结直肠癌(CRC)组织及正常结直肠组织的蛋白质表达差异。建立二者间的蛋白质表达差异图谱。方法6对样品分别取自6例CRC手术切除的新鲜的癌和正常肠黏膜组织,进行2-D DIGE,TyphoonTM多功能扫描仪进行图像扫描,并以DeCyderTM2-D差异分析软件分析。结果正常肠黏膜组织和癌组织有统计学差异(P<0.05)的表达蛋白点共有315个,癌组织中表达上调(>1.5倍)的有138个,下调(>1.5倍)的有103个。结论建立了CRC与正常肠黏膜组织的2-D DIGE图谱,发现并经统计学证实癌组织中有表达上调或下调的蛋白存在。

5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的利用原代培养的人外阴正常皮肤成纤维细胞,观察中药对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响。方法胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维细胞;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;测定细胞生长曲线;MTT法测定莪术、黄芪、丹参、川穹及当归5种中药作用后细胞增殖能力。结果生长曲线测定结果显示:传6代内以及传6代内复苏人外阴皮肤成纤维细胞增殖能力均很强。MTT检测结果显示:5种药物在特定浓度范围内均能抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖。分别作用于人外阴皮肤成纤维细胞72 h后,莪术5、10、100 mg/L浓度组,黄芪500、1 000 mg/L浓度组,丹参1 000 mg/L浓度组,川穹500、1 000 mg/L浓度组,当归100、500、1 000 mg/L浓度组均显示抑制增殖作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其中莪术和川穹的抑制强度呈剂量依赖性。结论成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法;特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖。

直肠癌远端直肠系膜内DNA含量的检测及其临床意义

目的 :探讨直肠系膜内DNA含量 ,为全直肠系膜切除术切除范围提供理论依据。方法 :采用流式细胞术对 37例直肠癌切除标本的癌组织、远端 3cm ,5cm处直肠系膜以及 10例正常结肠系膜中的DNA含量、细胞增殖活性进行检测 ,分析比较各组间DNA指数 (DI)、增殖指数 (PI)及S期细胞百分比 (SPF)等指标。结果 :癌组织、癌远端 3cm ,5cm处直肠系膜中异倍体率及PI,SPF值均显著高于正常组织 (P <0 .0 5 ) ;远端直肠系膜中异倍体率与癌组织无显著差异 ;不同范围内的远端系膜中异倍体率、PI及SPF无显著差异。结论 :直肠癌远端 3cm ,5cm处直肠系膜中存在着DNA含量及细胞增殖活性的异常改变 ,呈现出恶性肿瘤生物学特性 。