橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

海南热研73397等5个橡胶树品种全年割胶周期生胶质量变化

天然橡胶的质量和性能与橡胶树品种、割胶生产、气象、物候等遗传和环境因素密切相关。为了探明橡胶树不同品种之间及4—12月全年割胶周期内生胶质量的差异与变化规律,本研究分析比较了PR107、RRIM600、热研917、热研73397和热研879等5个橡胶树品种胶乳所制备生胶的质量,并分析了各品种5月份胶乳所制备生胶的硫化特性和硫化胶的力学性能。结果表明:5个橡胶树品种生胶的门尼黏度值、氮(蛋白质)含量、挥发物含量、P0和PRI值等在4—12月全年割胶周期内表现出增加或下降的趋势,这些质量指标既反映出橡胶树品种间的基因型差异,又表现出受气象等环境因素变化的影响。其中,4个品种12月生胶的蛋白质含量均超过3.0%;热研917混炼胶的硫化特性与其他4个品种有明显差异;在S/2 d/3割制下,热研879硫化胶的拉断伸长率和拉伸强度最小。本研究结果一方面有助于指导橡胶树品种选育和割胶生产,另一方面也可以为高性能天然橡胶生产加工提供科技支撑。

橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值

本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。

适合全周期间作的橡胶树品种热垦628花药再生体系研究

在橡胶树体胚发生再生体系研究中,如何快速获得胚性愈伤组织是能否成功建立再生体系的关键。本研究基于课题组前期的研究基础,以橡胶树花药为外植体,通过正交试验设计方案研究了毒莠定、KT、6-BA、IAA四种激素的不同浓度组合对橡胶树花药胚性愈伤组织诱导的影响,结果表明:橡胶树花药愈伤组织诱导的最优组合培养基为MS基础培养基,硫胺素0.4 mg/L、天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸-盐酸盐50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝胶2.2 g/L,并添加毒莠定浓度20 mg/L、KT浓度2 mg/L、6-BA浓度1 mg/L、IAA浓度0 mg/L,愈伤组织诱导率达73.3%~100%。所有处理在诱导愈伤组织25~28 d左右,愈伤组织达到快速增殖时期,对胚性愈伤组织的诱导起主要作用的是毒莠定浓度,其浓度在20~30 mg/L之间时,对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。低浓度的毒莠定虽然也能诱导愈伤组织产生,但是这些愈伤组织几乎为无胚胎发生能力的非胚性愈伤组织。同时用获得的11个体胚进行植株再生,其中出苗2株,7个只长根不抽芽,2个既不抽芽也不长根,植株再生率达18%。因此,在此研究的基础上,对愈伤组织诱导培养基配方进行进一步优化,使其能够更快地从花药中诱导出胚性愈伤组织,缩短胚性愈伤组织的诱导时间,降低变异几率,可为RITA生物反应器提供更好条件的愈伤组织起始原料。

橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)作为氧化还原调节蛋白在植物抵御非生物逆境胁迫中发挥重要作用。本研究采用RT-PCR从橡胶树(Heveabrasiliensis)中克隆了硫氧还蛋白基因HbTRXo2,该基因编码区长594bp,编码197个氨基酸。预测HbTRXo2蛋白的分子量为21.90 kDa,理论等电点为7.59。蛋白保守结构域和系统进化分析结果显示,HbTRXo2含有TRX保守结构域,与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一起,表明该蛋白属于o型硫氧还蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,HbTRXo2基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花组织中均表达,其中在胶乳中的表达量显著高于其他组织。同健康橡胶树相比,割面干涸橡胶树树皮和胶乳中HbTRXo2的表达量显著降低。在低温、聚乙二醇(PEG)诱导的干旱以及过氧化氢(H_(2)O_(2))和甲基紫精(MV)诱导的氧化胁迫处理下,HbTRXo2基因的表达显著上调,表明该基因参与了橡胶树对非生物胁迫的应答。为了研究HbTRXo2在抗逆中的功能,本研究构建其酵母表达载体,并转入酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)。比较重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)和转空载体对照酵母INVSc1(pYES2)在H_(2)O_(2)、PEG和低温胁迫处理后的存活差异。结果显示,重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)在PEG和H_(2)O_(2)处理后的存活率明显高于对照酵母,而在低温胁迫处理后的存活率明显低于对照酵母,表明转HbTRXo2基因提高了重组酵母对干旱和氧化胁迫的抗性,但降低了对低温胁迫的抗性。以上研究结果证明,HbTRXo2在橡胶树产排胶和抗逆过程中起着重要作用。本研究为进一步解析HbTRXo2在橡胶树中的生物学功能提供重要的参考依据。

橡胶树野生种质资源产量相关性状的灰色关联度分析

【目的】天然橡胶是重要的工业原料和战略物资,在国民经济发展中具有十分重要的地位和作用,属资源约束性产业,其主要来源于巴西橡胶树,在已知的产胶植物中以橡胶树的产胶量最高,质量最好。巴西橡胶树以收获胶乳为主要经济产出,胶乳产量是受微效多基因控制的数量性状,影响因素较多,其表型值受遗传效应和环境效应影响,为全面了解橡胶树野生种质资源产量与主要相关农艺性状的关系,对橡胶树干胶产量及主要农艺性状进行研究,以期为橡胶树种质资源鉴定评价筛选以及新品种选育种研究提供科学依据。【方法】采用灰色关联度分析法,对种植于中国热带农业科学院试验场红星队的13份橡胶树野生种质资源产量及生长等相关农艺性状进行研究分析。【结果】与株次干胶产量相关的8个主要农艺性状的关联顺序为茎围>干胶含量>平均乳管个数>平均乳管列数>树皮厚度>茎围增长>侧脉胶等级>胶值比,对应权重分别为茎围0.1380、干胶含量0.1338、平均乳管个数0.1322、平均乳管列数0.1264、树皮厚度0.1205、茎围增长0.1182、侧脉胶等级0.1178、胶值比0.1143。综上,茎围、干胶含量、乳管数目、树皮厚度等性状与干胶产量的关联度较密切,对株次干胶产量影响较大。【结论】在橡胶树种质资源鉴定评价中,应以茎围、干胶含量、乳管数量等性状为重点,并兼顾其他性状对产量的潜在影响。

橡胶树蛋白激酶基因SnRK2.7的克隆及表达

为了探索蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(Sucrose non-fermentating1-related protein kinase 2,SnRK2)在巴西橡胶树响应低温胁迫应答中的作用,采用RT-PCR技术,从橡胶树抗寒无性系93-114的叶片中克隆了SnRK2亚家族的一个成员,命名为HbSnRK2.7。该基因包含一个1095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。HbSnRK2.7的分子量为41.39 kD,等电点为4.70,具有保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,预测其能催化磷酸基从ATP转移到蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基上,也是磷酸化位点的集中区域,还具有非生物胁迫所需的结构域和ABA(脱落酸)依赖的HbSnRK2.7激活所需结构域。q-PCR结果显示,HbSnRK2.7基因响应ABA诱导,呈下调表达模式。在ABA处理8 h时,表达量下调到最低点。在低温胁迫下,HbSnRK2.7的表达量极显著降低。低温胁迫4 h和8 h时,HbSnRK2.7持续下调表达,低温胁迫24 h时,HbSnRK2.7表达量下调到最低,大约为非胁迫表达量的1/2。而且,HbSnRK2.7在不抗寒种质中的表达量显著高于抗寒种质。这些结果表明,HbSnRK2.7可能作为负调控因子介导橡胶树依赖ABA的低温胁迫抗性形成。

橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库构建及HbSRPP7互作蛋白筛选

橡胶树橡胶粒子上的蛋白质在橡胶生物合成一系列反应过程中起着关键作用,它们直接决定着橡胶烃分子的数量和大小,影响天然橡胶的产量和质量。小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)是丰度仅次于橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)的橡胶粒子蛋白组分,与橡胶粒子发育和橡胶生物合成密切相关。目前已知橡胶粒子上存在多种SRPP家族蛋白,但大部分成员的功能尚不清楚。SRPP可能通过与其他橡胶粒子蛋白相互作用发挥功能。为了筛选SRPP蛋白家族成员之一Hb SRPP7的互作蛋白,本研究利用位点特异性重组技术构建了原始库容为1.5×10^(7)CFU的均一化橡胶树胶乳膜蛋白酵母双杂交系统(membrane yeast two-hybrid system,MYTH)cDNA文库,该文库插入片段平均长度大于1500 bp,重组率约为100%。构建了用于MYTH系统筛选HbSRPP7互作蛋白的pBT3STE-SRPP7和pBT3SUC-SRPP7诱饵载体并确认其能在NMY32酵母菌株中正确表达,无自激活活性。使用pBT3STE-SRPP7诱饵质粒对胶乳MYTHcDNA文库进行筛选,获得21个HbSRPP7候选互作的蛋白,包括3个REF家族蛋白(HbREF1、HbREF3和HbREF8)、2个SRPP家族蛋白(HbSRPP1、HbSRPP2)、2个活性氧清除相关蛋白(thioredoxin H-type-like、L-ascorbate peroxidase 2)以及5个胁迫相关蛋白(high mobility group Bprotein 2-like、RPM1-interacting protein 4-like、stress-related protein-like、salt stress-induced hydrophobic peptide ESI3-like和F-box/kelch-repeat protein)。结果显示HbSRPP7除了可能通过与橡胶生物合成相关的橡胶粒子蛋白互作参与橡胶生物合成,也可能通过与生物和非生物逆境胁迫相关蛋白互作,响应橡胶树乳管生物和非生物逆境胁迫系统信号,参与橡胶粒子上的橡胶生物合成调控。该研究结果有助于了解SRPP家族蛋白的功能,为揭示橡胶粒子上参与橡胶生物合成的蛋白复合体组成,阐明橡胶生物合成及其调控的分子机制奠定基础。

橡胶树树皮细胞木质素显示方法的比较分析

巴西橡胶树是最重要的人工栽培产胶植物,树干割胶是当前从橡胶树乳管组织中获取天然橡胶的唯一途径。割胶后的排胶特性直接决定胶乳的产量,但其排胶机理目前尚不完全清楚。橡胶树树皮的膨压是乳管排胶的主要初动力,而细胞壁的主要成分木质素含量的高低与膨压密切相关。目前关于橡胶树树干树皮细胞中木质素含量的研究较少,缺乏通过形态结构研究分析木质素含量高低的研究。以橡胶树RY8-79和PR107成龄树树皮为研究材料,制备石蜡切片,分别以Wiesner反应方法、Maule反应方法以及番红染色结合荧光显色的方法对树皮组织中的木质素进行了染色定位分析。研究结果表明:光镜明场下,Wiesner反应方法和Maule反应方法能显色薄壁细胞壁中的木质素成分,但颜色浅淡,很难区分不同品系之间的差异;番红染色后能观察到薄壁细胞中浅紫红色的木质素成分,但不同组织以及不同品系之间同样很难区分;番红显色后结合546 nm绿光激发则能观察到木质素组织明显的红色荧光,不同细胞类型和不同品系之间差异明显,RY8-79薄壁细胞中木质素荧光明显弱于PR107,表明该品系中木质素的含量低于PR107。碘-溴染色显示次生乳管的结果表明,次生乳管分布的位置和木质素显色较深尤其是荧光强的部位一致。由此推测乳管及其周围的细胞中木质素含量较高,这一现象在PR107中尤其明显。此外,Wiesner反应和Maule反应不仅需要间苯三酚、盐酸和高锰酸钾(KMnO_(4))等危险化学试剂,而且反应时间不好把控,切片容易从载玻片上脱落以及细胞壁易破损;而番红染色结合荧光观察所用试剂则是安全无毒的且细胞结构完整。综合比较不同的方法,番红染色结合荧光显色是当前最适合橡胶树树皮组织细胞中木质素显色的方法,不仅能清晰区分木质素含量的高低,而且安全、简便易操作。

凝胶渗透色谱测试天然橡胶相对分子质量及分布的优化方法建立

为摸索凝胶渗透色谱仪器测试条件对天然橡胶相对分子质量及分布测试结果的影响,利用凝胶渗透色谱对同一天然橡胶样品进行分子量及分布测试,确定了最佳的凝胶渗透色谱测试条件:检测器为示差折光检测器,流动相为四氢呋喃,流速为1.0mL/min,柱温和检测器温度为40℃,进样体积为30μL。将其运用在不同品种天然橡胶样品的测试分析中,结果表明该方法准确度高(>98%),重现性好(RSD<5%),为今后利用凝胶渗透色谱仪测试天然橡胶相对分子质量及分布测试提供了试验指导和理论基础。

非生物胁迫对橡胶树热激转录因子家族成员表达的影响

热激转录因子(heat shock transcription factor,Hsf)是一类重要的调节因子,能够使植物响应多种逆境胁迫,赋予植物多种抗逆性。通过qPCR技术,分析了30个橡胶树HbHsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114’和‘热垦501’叶片中的表达模式,结果显示多个HbHsfs基因可被低温诱导上调表达,尤其是HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在低温胁迫下‘93-114’叶片中的表达量显著高于‘热垦501’。此外,HbHsfA4a和HbHsfA4d在干旱和高盐胁迫下显著上调表达,HbHsfA9b在干旱条件下极显著上调表达,HbHsfC1a和HbHsfC1b响应高盐胁迫上调表达。橡胶树HbHsfs基因响应多种逆境交叉胁迫,暗示着基因功能的多样性和复杂性。本研究为进一步解析Hsf家族成员的抗逆机理提供理论依据。

巴西橡胶树去泛素化酶UCHs基因的克隆及功能分析

为探究去泛素化酶中泛素羧基末端水解酶(UCHs)在巴西橡胶树乳管泛素化过程中发挥的潜在功能,从巴西橡胶树中成功分离2个UCHs家族成员(HbUCH-L3和HbUCH-L5)的全长序列,开放阅读框分别长993、558 bp,编码330、185个氨基酸,具有典型的UCHs结构域;qRT-PCR结果表明HbUCH-L3和HbUCH-L5在各组织中均有表达,且在胶乳中表达丰度较低;HbUCHs重组蛋白的体外泛素化底物切割试验表明,HbUCH-L3和HbUCH-L5均具有水解泛素的功能。HbUCHs显著降低C乳清中总蛋白整体泛素化水平,且HbUCH-L3去泛素化酶活性高于HbUCH-L5。由此推测橡胶树UCHs在乳管中参与维持泛素化动态平衡进而发挥其特定的生物学功能,但具体的作用及调控机制尚不清楚。

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等20个基因的表达模式进行分析,并将基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现:茉莉酸生物合成关键酶基因HbAOCa和橡胶生物学合成关键酶基因HbHevb7在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明:eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。

海藻酸钠/壳聚糖基橡胶树死皮康复营养剂微胶囊的制备工艺优化

橡胶树死皮已成为制约天然橡胶生产发展的重要因子之一,研发轻简、高效的死皮防治技术是目前生产中亟需解决的问题。本文以海藻酸钠/壳聚糖为壁材,橡胶树死皮康复营养剂主要有效成分为芯材,通过复凝聚反应将橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊。以微胶囊的包封率、载药量为制备工艺优化指标,通过L16(45)正交实验得出微胶囊的最佳制备工艺条件。研究结果表明,当壳聚糖浓度为2.0 mg/mL、营养剂用量为1 g,体系反应温度为40℃,pH为5,10%戊二醛用量为30 mL时,该工艺条件下制备的微胶囊相对圆整、粒度分布相对均匀(10~40μm),其包封率达69.31%、载药量达14.35%。所得的最佳工艺制备条件为后期实现木质部埋植橡胶树死皮康复营养剂缓释微胶囊打下良好基础;为最终实现新型高效的橡胶树死皮康复技术应用提供依据。

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

【目的】克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考。【方法】采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系。【结果】从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77。二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体。HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体。qRT-PCR检测结果显示,HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性。经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达。在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异。HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达。【结论】HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记。

橡胶树HMGS编码基因的分离鉴定

羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶(HMGS)将乙酰辅酶A转化为羟甲基戊二酸单酰辅酶A,是甲羟戊酸代谢途径的限速酶之一。本研究从橡胶树热研879和热研7-33-97品系的胶乳中分离出HbHMGS1和HbHMGS2基因。相比HbHMGS1基因在胶乳和树皮中的共表达模式,胶乳中高丰度表达的HbHMGS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶合成的主效基因,而HbHMGS1是功能冗余基因。HbHMGS2基因在橡胶树高产品系热研879胶乳中的表达量亦高于测序品系热研7-33-97,表明HbHMGS2基因的高水平表达可能有助于橡胶的合成。其上游启动子的顺式作用元件差异可能与该基因在热研879和热研7-33-97的差异表达有关。HbHMGS2基因的转录亦受茉莉酸诱导,可能参与了茉莉酸信号调控天然橡胶的合成过程。HbHMGS2基因在大肠杆菌中成功表达为后续研究该基因的功能、利用该基因生产活性物质提供新的基因资源。

死皮康复组合制剂在橡胶树品种‘93-114’上的应用

为有效解决橡胶树品种‘93-114’死皮高发的问题,进一步验证死皮康复组合制剂的防治效果,采用死皮康复组合制剂对其死皮进行防治。设置药剂处理、空白对照2个处理,2次重复试验分别于2015—2016年、2016—2017年进行,观测处理前后死皮植株割线症状、死皮相关指标及其胶乳产量的动态变化。处理植株死皮长度恢复率均值为79.84%,比对照增加45.20%;死皮指数降低68.36,防效可达71.41%,2次重复试验防效均值为59.34%;死皮植株胶乳产量显著增加,2次重复试验处理植株单株单刀鲜胶乳产量分别达204 g和144 g,处理植株胶乳分别比对照增产1.68倍和6.2倍。死皮康复组合制剂及其配套施用技术显著改善了‘93-114’死皮植株的割线症状,防效显著,显著增加植株胶乳产量,是目前相对较理想的橡胶树死皮防控技术。

一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

研究植物体内H_2O_2的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti(Ⅳ)-PAR-H_2O_2比色法灵敏度高、特异性强、稳定性好,广泛用于植物H_2O_2测定,但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中,系统优化了Ti(Ⅳ)-PAR-H_2O_2比色法的反应条件,并比较了丙酮提取法和TCA提取法对橡胶树萌条韧皮部H_2O_2的提取效果。结果表明,丙酮提取法稳定性差,TCA提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮H_2O_2的方法,为进一步研究橡胶树中H_2O_2的生理功能打下良好基础。

TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示:TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。