纳米技术与生物学实验的微型化

纳米技术是近年来发展迅速的新技术,有着几乎无限的潜力。一方面生物分子的尺度是纳米与亚纳米级的,纳米技术可以从生物科学学到许多生物分子作用的奥秘;另一方面,纳米技术为生物学的研究提供新材料、新方法,使生物学研究可以多快好省地进行。本文简单介绍几种利用纳米技术开展生物学研究的思路与方法。

合成生物学

近年来用化学合成的手段合成生物物质的研究进展很快。有感染活力的小儿麻痹症病毒RNA 与φX-174噬菌体基因先后合成成功。估计2006年可能会有能合成1百万bp DNA的仪器问世。此外, 目前已能向蛋白质中引入80种非常见氨基酸,从而使蛋白质获得新的性质。化学合成的进展使合成与改造生命成为现实,这对研究生物学基本规律有很大的意义,但这也是一把“双刃剑”,带来伦理与反恐的问题及对可能的潜在威胁的担忧。2004年6月在美国麻省理工学院举行了第一届合成生物学国际会议。2005年8月在美国旧金山举行的合成生物学会议,讨论了生物合成这个领域对药物发展、细胞重编程、生物机器人等方面的潜在意义。

生物学中的数学建模

生物学与其它学科的交叉是近年来学术界讨论的一个重要话题 .系统科学这一类横断科学从其产生之初就具有其鲜明的一般性和普适性 ,尤其适合对生命这一开放的、有序的、复杂的系统进行研究和探讨 .近年来 ,这方面的发展非常迅速 ,生物学研究的新思路、新方法层出不穷 ,这无疑为广大研究人员带来崭新的研究工具和更优化的解决方案 .本文从生物建模的角度对这方面最新的研究进展进行总结、归纳 ,以求集思广益、触类旁通 .

miRNA的生物合成过程

MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA,通常为18～25nt长,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控.近几年来,在动物细胞和植物组织中,上百种miRNA被陆续发现.这些小分子调控RNA是从60～200nt的具有发夹状结构的前体中被切割出来而成熟的,在动物细胞中,miRNA基因的转录初产物(pri-miRMA)很快被一种核糖核酸酶ⅢDrosha加工成为miRNA前体(pre-miRNA),然后由细胞核转运至细胞质中,经另一种核糖核酸酶ⅢDicer识别剪切为成熟miRNA.对这一过程进行了简要的综述,并且对植物miRNA的成熟过程也进行了探讨.对miRNA的生物合成过程的深入了解,将有助于研究这一类起重要调控作用的RNA是如何行使功能的,从而进一步研究其在生长发育及各种疾病中所起的重要作用.

吡咯赖氨酸:第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸

吡咯赖氨酸在产甲烷菌的甲胺甲基转移酶中发现,是目前已知的第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸,与标准氨基酸不同的是,它由终止密码子UAG的有义编码形成.与之对应的在产甲烷菌中也含有特异的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯赖氨酸tRNA(tRNAPyl).tRNAPyl具有不同于经典tRNA的特殊结构.产甲烷菌通过直接途径和间接途径这两种途径生成吡咯赖氨酰-tRNAPyl(Pyl-tRNAPyl),它还可能通过mRNA上的特殊结构以及其他还未发现的机制,控制UAG编码成为终止密码子或者吡咯赖氨酸.比较了吡咯赖氨酸与另一种非标准氨基酸,第21种氨基酸——硒代半胱氨酸的相似点与不同点.

A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。

雄激素/雄激素受体对小鼠附睾Caveolin-1表达调控机制的研究

目的:探讨雄激素和雄激素受体(AR)对小鼠附睾Caveolin-1表达的调控机制。方法:通过搜索前期染色体免疫共沉淀-测序(ChIP-seq)实验得到的小鼠附睾AR结合位点的数据库,寻找Caveolin-1基因相关联的AR结合位点。分别取正常小鼠、睾丸阉割小鼠以及睾丸阉割后补充外源雄激素的小鼠的附睾组织,一方面,抽提总RNA,利用逆转录PCR以及逆转录荧光定量PCR检测Caveolin-1基因的mRNA表达水平;另一方面,利用AR抗体进行染色体免疫共沉淀(ChIP),采用ChIP-PCR以及ChIP-qPCR的方法,检测Caveolin-1基因相关联的AR结合位点在体内与AR的结合情况。结果:从小鼠附睾AR结合位点的数据库中找到两个Caveolin-1相关联的AR结合位点,均位于第二内含子区域。睾丸阉割后,Caveolin-1基因的表达显著升高(P<0.05),表达量是对照组的(1.8±0.17)倍;两个AR结合位点的富集倍数分别由正常状态下的(13.5±1.47)倍和(10.5±1.03)倍降至(1.05±0.17)倍和(1.4±0.14)倍(P<0.01)。补充雄激素后,Caveolin-1基因的表达又降至正常水平(P<0.05),为正常对照组的(1.03±0.06)倍。两个AR结合位点的富集倍数则分别升至(16.4±2.6)倍和(10.0±0.92)倍(P<0.01)。结论:Caveolin-1在小鼠附睾内是AR的一个直接靶基因,其表达受雄激素的负调控。该研究为理解雄激素/AR在小鼠附睾内的调控网络提供了新的视角。

哺乳动物氨基酰-tRNA合成酶的研究

1氨基酰-tRNA合成酶及哺乳动物细胞中氨基酰tRNA合成酶的特点 1.1氨基酰-tRNA合成酶催化的反应 氨基酰-tRNA合成酶家族（aaRS）参与生物体中的遗传解码过程.它们催化氨基酸与其对应的tRNA之间的酯化反应,生成氨基酰-tRNA参与蛋白质的生物合成,它反应的专一性确保了蛋白质生物合成的精确性.氨基酸与其对应的tRNA之间的反应发生在tRNA的3＇-末端腺苷酸核糖的2＇或3＇羟基上.根据aaRS一级序列中的特征结构花式（motifs）以及催化功能域拓扑结构,aaRS被分为两类.每类有10种aaRS.本文用氨基酸单字符或三字符后缀RS代表专一于某一氨基酸的氨基酰-tRNA合成酶.

三链形成寡核苷酸对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成影响的研究

目的观察原位注射血小板源生长因子(PDGF)B链基因(PDGF-B)的三链形成寡核苷酸(TFO)对大鼠脑胶质瘤生长和血管生成的抑制作用。方法实验大鼠18只均在立体定向导引下行右尾状核区微量灌注1×106C6胶质瘤细胞,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种后第8d开始分别原位注射TFO1.5mg/20μl和3.0mg/20μl的生理盐水,以后每隔72h原位注射相同剂量的TFO,共注射3次。对照组仅在相同时间原位注射20μl生理盐水。实验3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,观察肿瘤PDGF-B的表达、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤核增殖抗原(PCNA)表达。结果实验Ⅰ组的成瘤抑制率为66.0%,实验Ⅱ组为92.2%,两组比较差异有极显著性(P<0.01)。TFO对C6胶质瘤细胞PDGF-B、VEGF、PCNA表达有明显的抑制作用;原位应用TFO能抑制PDGF-B表达,使胶质瘤细胞增殖能力降低,抑制血管生成。结论TFO抑制肿瘤生长与抑制胶质瘤细胞增殖及抑制血管生成有关。

白念珠菌CaPPEl的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控。转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPEl同源的基因,命名为CaPPEl。CaPPEl的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白。在单倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长。在双倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用。结果表明CaPpel在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同。

端粒和端粒酶的发现及其生物学意义

2009年的诺贝尔生理学或医学奖授予了美国加州大学旧金山分校的Elizabeth H.Blackburn、约翰霍普金斯大学的Carol W.Greider以及哈佛医学院的Jack W.Szostak三位科学家,肯定他们在发现端粒以及端粒酶保护染色体末端方面所做出的贡献。端粒以及端粒酶的发现历经近半个世纪,追溯起端粒和端粒酶的整个发现过程,却是耐人寻味,给人启发。端粒是真核生物中位于染色体末端的DNA和蛋白质的复合物,它对于维持基因组的完整性以及染色体的稳定性都有着至关重要的作用。端粒DNA可以被一种特化的称为"端粒酶"的逆转录酶延伸。端粒长度的维持以及端粒结构的稳定在细胞衰老、癌症发生以及干细胞全能性自我更新能力维持等生命过程中都起重要作用。

核酶对人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖和TIMP-1表达的影响

目的:探讨核酶对人金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP 1)基因表达的特异性抑制作用,以寻找治疗增生性瘢痕的新方法。方法:应用特异切割TIMP 1 的嵌合型核酶基因克隆pU6 Rz182 转染增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar derived fibroblasts,HSF),G418筛选稳定表达核酶的细胞克隆,MTT法检测并绘制细胞生长曲线,观察核酶对细胞生长的影响;RT PCR检测核酶对靶基因TIMP 1 表达的抑制。结果:在mRNA水平,与正常对照组相比,稳定表达活性核酶Rz182的HSF中TIMP 1的表达被抑制了87.9%,而点突变核酶抑制达36.4%,两者之间差异非常显著(P<0.01)。HSF细胞生长进入平台期后,转染核酶基因组与点突变组及对照组相比,活细胞数显著降低(P<0.01),而点突变组与对照组无明显差异。结论:核酶U6Rz182能特异地抑制HSF中TIMP 1的表达,并使HSF的增殖受到抑制。

氨酰tRNA合成酶的分子网络和功能

氨酰tRNA合成酶是生命进化过程中最早出现的一类蛋白质 ,氨酰tRNA合成酶帮助氨基酸转移到相应的tRNA上 ,进而参与蛋白质的合成保证了生命体的严谨性和多样性 .随着后基因组时代的到来 ,氨酰tRNA合成酶的结构和功能成为新的研究热点 .结构生物学和生物信息学的研究结果表明 ,氨酰tRNA合成酶在真核生物体内以多聚复合物的形式行使功能 ,形成复杂的分子网络体系 .最新的实验证据显示 ,氨酰tRNA合成酶不但是蛋白质合成过程中一类最重要的酶 ,而且参与了转录、翻译水平的调控、RNA剪接、信号传导和免疫应答等众多生命活动 .

PDGF-B链基因的TFO对大鼠脑胶质瘤细胞增殖和凋亡影响

目的 观察原位注射血小板源生长因子(platelet derivedgrowthfactor,PDGF)B链基因的三链形成寡核苷酸(Triplexformingoligonucleotide,TFO)对荷瘤大鼠胶质瘤细胞增殖和凋亡影响。方法 所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区微量灌注1×106C6胶质瘤细胞,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种后的第8天开始分别在肿瘤部位注射TFO 1. 5mg/20μL和3.0mg/20μL的生理盐水,以后每隔72h原位注射相同剂量的TFO,共注射3次。对照组仅在相同时间原位注射20μL生理盐水。实验至3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,定性和定量观察肿瘤PDGF B的表达、PCNA表达及细胞凋亡。结果 实验Ⅰ组的成瘤抑制率为66.1%,实验Ⅱ组为91.8%。TFO对C6胶质瘤细胞PDGF B、PCNA表达有明显的抑制作用;TFO能使C6胶质瘤细胞凋亡增加,以上作用均存在浓度依赖性。结论 原位应用TFO能抑制PDGF B表达,使胶质瘤细胞增殖降低、细胞凋亡增加,TFO能取得很好的抗胶质瘤生长的治疗效果。

联合VEGF-AON和PDGF-TFO对大鼠脑胶质瘤增殖和细胞凋亡的作用效果

目的观察PDGFB链基因的TFO和VEGF的反义寡核苷酸AON对荷瘤大鼠脑胶质瘤增殖和细胞凋亡的影响。方法所有大鼠均在立体定向导引下行右尾状核区微量灌注20μL生理盐水中含1×106C6胶质瘤细胞。在细胞接种后第8天,实验Ⅰ组原位注射含TFO1·0mg的20μL生理盐水,实验Ⅱ和Ⅲ组则分别原位注射含TFO1·0mg+AON0·125mg和TFO1·0mg+AON0·250mg的20μL生理盐水。以后每隔72h原位注射相同剂量的药物,共注射3次。对照组仅在相同时间原位注射20μL生理盐水。实验3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,流式细胞仪观察PDGFB链基因(PDGF-B)、VEGF、PCNA及细胞凋亡的变化。结果实验Ⅰ组的成瘤抑制率为53·1%,实验Ⅱ组为81·4%,实验Ⅲ组为93·1%,三组肿瘤体积比较差异有统计学意义,P<0·01。TFO对胶质瘤细胞PDGF-B、VEGF和PCNA表达有明显的抑制作用;TFO能使胶质瘤细胞凋亡增加。联合应用TFO和AON能更好地抑制PDGF-B、VEGF和PC-NA的表达,使胶质瘤细胞增殖能力进一步降低,细胞凋亡进一步增加。结论联合应用TFO和AON能更有效地抑制肿瘤生长和细胞增殖,促进胶质瘤细胞凋亡。

C／EBPβ mRNA3′非翻译区肿瘤抑制功能的分子机制--同时缺失3段短序列降低其肿瘤抑制活性

CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)mRNA的3′非翻译区(3′UTR),是先前工作发现的一个具有肿瘤抑制功能的RNA调控元件.应用基因定点突变技术将该3′UTRcDNA上的三段核苷酸同时缺失掉,将缺失突变体稳定转染人肝癌细胞系SMMC-7721,并检测了该缺失突变体对SMMC-7721细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、软琼脂集落形成能力、细胞集落形成能力及裸小鼠成瘤性.研究发现,C/EBPβ3′UTR中这三段短序列的同时缺失明显降低了3′UTR的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性显著增强.人全基因组基因芯片分析和实时荧光RT-PCR分析结果表明,与回复对照细胞相比,缺失突变3′UTR稳定转染细胞中,一些癌基因的表达量有所增加,而一些抑癌基因的表达量有所下降,这提示上述三段短序列是C/EBPβ3′UTR的肿瘤抑制功能所同时需要的.

外源NF-IL6(C/EBPβ)对肝癌细胞系BEL-7404的肿瘤抑制效应

目的 :探讨核转录因子NF IL6对肝癌细胞系BEL 740 4恶性度的影响。方法 :用磷酸钙介导转染技术 ,将NF IL6表达载体 (pCN)和空载体质粒 (pCN 空 )分别导入肝癌细胞系BEL 740 4 ,并借助细胞生长曲线 ,软琼脂集落形成试验 ,裸鼠成瘤试验对转染细胞的恶性度进行了检测。结果 :与原细胞系BEL 740 4和空载体转染的该细胞系相比较 ,转染了NF IL6基因的BEL 740 4的各细胞克隆生长速度减慢 ,在软琼脂中集落形成率恶性度下降 ,裸鼠成瘤试验显示成瘤性明显降低。结论 :表明外源转染的NF IL6对肝癌细胞系BEL 740

PDGF-B链基因TFO抑制C6胶质瘤细胞PDGF-B链基因表达及细胞生长

目的 :观察PDGF B链基因三链形成寡核苷酸 (triplex formingoligonucleotide,TFO)对C6胶质瘤细胞PDGF B链基因表达和细胞生长的作用。探索PDGF B链基因TFO作为抗肿瘤治疗新药的可能性。方法 :应用MTT法观察PDGF B链基因TFO对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用 ;应用流式细胞技术观察PDGF B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF B链基因表达的影响。结果 :PDGF B链基因TFO对C6胶质瘤细胞PDGF B链基因的表达和细胞生长有明显抑制作用 ,而且抑制作用存在浓度依赖性。结论 :PDGF B链基因TFO能够抑制C6胶质瘤细胞PDGF B链基因的表达和细胞生长 ,有望成为抑制PDGF

miR-24对胃癌细胞株BGC-803及SGC-7901凋亡和增殖的影响

目的探讨在两株胃癌细胞株BGC-823及SGC-7901中抑制内源性miR-24的表达后对细胞凋亡和增殖的作用。方法使用INTERFERin转染试剂将锁核苷酸标记的反义核酸miR-24-ASO转染进入胃癌细胞株,使用倒置荧光显微镜观察细胞生长变化,流式细胞计检测细胞凋亡的比例,然后使用CCK-8试剂盒对细胞增殖情况进行检测。结果转染miR-24-ASO的BGC-803细胞和SGC-7901细胞相对于转染内参的凋亡水平分别增加了约2.5倍和2.1倍左右。转染了miR-24-ASO抑制内源性miR-24的表达之后细胞的增殖能力相对于转染阴性对照的细胞株的增殖能力均明显降低。结论抑制内源性miR-24的表达可以诱导胃癌细胞的凋亡并导致胃癌细胞增殖能力的降低。miR-24调控了胃癌细胞的增殖和凋亡过程。揭示了miRNA在胃癌发生过程中的调控机制,并为胃癌的治疗提供了良好的应用前景。

PDGF-B链基因的三链形成寡核苷酸对大鼠脑胶质瘤生长及细胞周期的影响

目的 :观察血小板衍生长因子 (platelet- derived growth factor,PDGF) B链基因的三链形成寡核苷酸 (triplex form ingoligonucleotide,TFO)对大鼠胶质瘤细胞生长及细胞周期的影响。方法 :所有 SD大鼠 (36只 ,体质量 2 2 0～ 2 5 0 g)均在右尾状核区微量灌注 1× 10 6个 C6 胶质瘤细胞 ,其中实验 组和 组 (n=12 )在细胞接种后的第 8天开始分别原位注射 TFO1.5mg/ 2 0 μl和 3.0 m g/ 2 0 μl的生理盐水 ,以后每隔 72 h注射相同剂量的 TFO,共注射 3次。对照组 (n=12 )在相同时间原位注射 2 0 μl生理盐水。实验 3周时处死所有的大鼠 ,观察肿瘤的生长情况 ,标本做常规 H- E染色。流式细胞仪检测肿瘤 PDGF- B、PCNA的表达及细胞周期。结果 :实验 组、 组的成瘤抑制率分别为 6 6 .1%、91.8% ,两者相比有显著差异 (P<0 .0 1)。TFO对胶质瘤细胞 PDGF- B、PCNA表达有明显的抑制作用 (P<0 .0 1) ;TFO能明显降低胶质瘤细胞 G2 - M期和 S期 (DNA合成期 )的百分率 ,阻止细胞由静止期 (G0 - G1 期 )进入 DNA合成期 (S期 ,P<0 .0 1)。以上作用均存在浓度依赖性。结论 :原位应用TFO能抑制 PDGF- B表达 ,阻碍细胞进入 S期 ,使胶质瘤细胞增殖降低 ,达到抗胶质瘤生长的作用。