真核生物中的微小RNA及其功能研究进展

真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non codingRNA) ,在真核生物中发挥重要作用。一类为微小RNA(microRNA ,miRNA) ,另一为小干扰RNA(siRNA)。miRNA大小为 19～ 2 5nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP) ,在真核基因的表达调控 ,生长发育中起重要作用。siRNA在RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。miRNA与siRNA有联系也有区别。

烟草花叶病毒运动蛋白cDNA的克隆及融合蛋白的表达

从烟草花叶病毒 (TMV)中提取总RNA ,通过反转录 PCR (RT PCR)扩增得到其运动蛋白 (MP)的基因 ,将扩增产物克隆到pMD 18T载体上。DNA序列分析表明 ,所得到的运动蛋白的基因全长为 80 7bp (GenBank接受号AY30 0 16 1) ,与已发表TMV序列 (GenBank登陆号为NC- 0 0 136 7)和同属的番茄花叶病毒 (ToMV ,GenBank登陆号为NC- 0 0 2 6 92相比核苷酸的同源性分别为 98 0 %和 80 9% ,氨基酸的同源性分别为 99 1%和 80 0 %。将目的片段亚克隆到表达载体pET 30a上 ,并在大肠杆菌JM10 9中诱导表达 ,诱导 9h后 ,融合蛋白表达量最大。诱导后的工程菌超声后经SDS PAGE检测 ,融合蛋白以可溶形式存在。

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至pGEM-Teasy载体上。序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达。以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1:3000.Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段。

人免疫缺陷病毒的受体与辅助受体

人免疫缺陷病毒（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ，ＨＩＶ）是引起艾滋病的病原。由于该病的病死率较高，目前尚没有被广泛接受的有效的医治方法，所以世界各国对艾滋病都十分重视。在感染ＨＩＶ时，ＨＩＶ首先与靶细胞上的受体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ...

逆转录病毒载体介导的RNA干扰稳定抑制肌肉生长抑制素GDF-8的表达

为将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8有效导入肌成纤维细胞C2C12中,以pAV-hU6+27载体为基础构建逆转录病毒载体pXSN-hU6-siGDF-8,并使之与pVSV-G质粒共转染GP-293细胞,用包装出的病毒粒子感染宿主细胞C2C12,G418筛选稳定整合逆转录病毒的抗性细胞库。2周后,Western Blotting和Real-Time PCR分析结果显示,细胞内源性的GDF-8基因的表达得到了有效的抑制;MTT法和细胞流式仪分析表明,G418抗性细胞得到了更有效的增殖,并且G_0/G_1期细胞数量减少了13.7%,S期细胞数量增加了14.9%。因此,逆转录病毒载体的RNA干扰系统可以稳定抑制GDF-8基因表达,它将成为治疗肌肉萎缩疾病的一个强有力的工具。

腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的表达、纯化及特性分析

副粘病毒F蛋白的两段七肽重复序列 (HR1和HR2 )在病毒侵染细胞的过程中相互作用形成热稳定的富含α螺旋的异源二聚体 ,此结构的形成引起病毒囊膜与细胞膜的并置而最终导致膜融合的发生。腮腺炎病毒(Mumpsvirus ,MuV)属于副粘病毒科 ,腮腺炎病毒属 ,可能利用与其他副粘病毒相似的侵染机制。本研究对MuV融合蛋白的HR区进行了计算机程序预测 ,并利用大肠杆菌GST融合表达系统对MuVF蛋白HR1和HR2两段多肽进行了表达和纯化 ,通过GSTpull_down实验证实HR1和HR2多肽在体外能够相互作用 ,凝胶过滤层析证明HR1、HR2多肽能够形成多聚体 ,说明MuVF蛋白的HR区的相互作用可能是其发挥融合功能的关键因素。

中国番茄黄化曲叶病毒小环状DNA分子的发现与证实

番茄黄化曲叶病毒为－Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ联体病毒．在中国番茄黄化曲叶病毒（ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ）中发现并证实了与ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ有关的一些小环状ＤＮＡ分子的存在．这些小环状ＤＮＡ分子的大小为 ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ ＤＮＡ Ａ全长基因组的一半， １．２－１．４ ｋｂ左右．序列分析表明，这些小分子序列中间均有一段未知来源的ＤＮＡ片段插入．分子杂交证实这些未知来源的ＤＮＡ片段既不与ＤＮＡ Ａ同源也不与 ＤＮＡ Ｂ同源，可能是病毒 ＤＮＡ与植物 ＤＮＡ重组后形成的．不同的小环状 ＤＮＡ分子有不同的未知序列插入，但它们均含有ＴＹＬＣＶ－ＣＨＩ ＤＮＡ Ａ的大基因间隔区及部分的ＡＣ１基因，然而它们并不含有完整的开放阅读框．

FIV gp40七肽重复区基因的克隆表达及其产物的纯化

本研究利用LearnCoil-VMF程序预测到FIVEnv蛋白gp40存在两个七肽重复区(Heptadrepeat,HR1和HR2),对包括HR1和HR2在内的部分gp40胞外区基因(称为HR1-HR2)进行了人工合成,以此基因为模板获得了HR1和HR2基因的扩增产物,同时构建了用氨基酸连接子SGGRGG将HR1和HR2连接起来的串联基因(即HR1linkerHR2,命名为2-Helix),采用大肠杆菌GST融合表达系统对HR1、HR2和2-Helix蛋白进行了表达,并对2-Helix进行了纯化。同时利用凝胶过滤层析证明2-Helix在PBS缓冲系统中以寡聚体的形式存在。

人肝脏特异性miR-122表达载体的构建及鉴定

人肝脏特异性miRNA-122是肝脏中表达丰度最高的miRNA。为研究该miR-122的生物学功能,从HepG2细胞基因组中用PCR的方法扩增了miR-122的前体,构建了miR-122的表达载体pLMP-miR-122。pLMP-miR-122质粒转染人正常肝细胞系L-O2和肝癌细胞系HepG2后,细胞内成熟miRNA-122的表达量显著增加。该质粒与HBV1.3共转染HepG2细胞72h后,HBV的HBs和HBe蛋白水平的表达量均下降,说明miRNA-122参与了HBV基因的复制和表达的调控,为进一步研究miRNA-122的功能和其他一些肝病如HCC的调控机制打下基础。