单克隆抗体在医学病毒学中的应用与某些研究进展

自1975年K(?)hler和Milstein建立杂交瘤技术以来,单克隆抗体(McAb)的研究和应用已遍及生物学、医学、兽医学、农学等学科的各个领域,并取得了巨大的经济效益和明显的社会效益。本文主要谈谈McAb在病毒学中的应用与某些研究进展。

1996年中国对虾暴发性流行病病毒病原研究

１９９６年６月至８月，青岛地区养殖的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）大面积暴发流行病，死亡率达９０％以上。发病对虾典型表征为甲壳白斑。病虾鳃组织匀浆滤液经微孔滤膜过滤除菌后，注射给健康对虾进行人工感染试验，９天内累计死亡率达１００％，发病症状及体征与自然发病对虾相似。电镜下自然发病对虾鳃、胃、头胸甲下表皮、淋巴样器官、触角腺等组织细胞核内发现大量杆状病毒，未见包涵体；人工感染对虾相同组织中可见大量同样病毒。切片中病毒粒子有包膜，完整毒粒大小为１２５±７６×３４５±１６ｎｍ，核衣壳为８５±６５×２９５ｎｍ。核质内可见不同成熟阶段的病毒形态，部分毒粒一端有突出的乳头状结构。经氯化铯密度梯度纯化后，包膜全部丢失。负染标本显示，核衣壳呈杆状，螺旋对称，大小为８０±１３×３８０±２４３ｎｍ，衣壳由１３～１６条螺旋带构成。研究结果表明，该病毒致病及形态特征与已报道的白斑征杆状病毒（Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，ＷＳＢＶ）相似，是１９９６年中国对虾暴发性流行病的主要病原。本文称之为“中国对虾非包涵体型杆状病毒（Ｐｅｎｅａｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｎｏｎ－ｏｃｌｕｄｅｄｂａｃｕｌｏ?

中国丁型肝炎病毒四川株的抗原表达及其某些特征的研究

利用人工合成的丁型肝炎病毒(HDV)特异引物和PCR法,从本实验室克隆的含我国四川株HDV-cDNA抗原编码区的重组质粒(PGEM/HDC707和PGEM/HDC274)中,获得2个长度分别为653bp(位于1610-957)和220bp(位于1610-1390)的片段,经Klenow DNA聚合酶补平后,平端插入表达载体pBV220的P_RP_L.串连启动子下游的SmaⅠ位点,转化大肠杆菌DH5α。通过原位杂交和快提抗原,分别筛选到表达不同长度抗原的阳性克隆。由核苷酸推导,它们分别由214和74个氨基酸组成。SDS-PAGE和Western blot表明,大抗原的主要分子量为为29kD,另有24kD和17kD的小肽;小抗原是分子量为10kD的单一条带。RNA结合能力试验证明,大抗原具有结合RNA的特性,而小抗原没有这种特性。此外,大抗原还有结合Neo-RNA的活性,其结合机理及其与病毒复制的关系有待进一步研究。本研究证明,保留HDV抗原编码区近N端的57个氨基酸就具有抗原性。这种基因工程表达的丁肝病毒抗原具有很好的免疫原性,用它免疫豚鼠可产生抗HD抗体。中国株丁肝抗原的表达成功和抗体的制备对于发展我国丁肝诊断试剂,研究我国丁肝病毒特征均具有重要意义。

中国细菌性与病毒性传染病的研究与防治

在中国的卫生工作中,与传染病的斗争始终居于优先地位。各级卫生机构均大力从事传染病的防治,其中包括群众广泛参予的爱国卫生运动。为了更好地了解传染病的病原学和流行病学,寻找有效的防治方法,在科学研究方面也做了大量工作。本文扼要地叙述在研究和防治方面已取得的成就,当前的状况和未来的趋势。

中国脊髓灰质炎Ⅰ型病毒VP1/2A区变异的分子流行病学研究

应用基因测序法对我国12个省24份脊髓灰质炎1型病毒标本散了VP1/2A片段的测序工作,并与疫苗株sabin 1型参考株的序列,我国台湾省和其他国家15株病毒的序列做了比较。由计算机PCGene程序分析处理,构建出两株关系树,初步揭示了我国大陆6个基因型病毒之间,以及它们与台湾省和其他国家病毒之间的分子流行病学关系。

人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮细胞恶性转化的研究

为了研究病毒和促癌物在食管癌形成中的作用，用带有人乳头状瘤病毒１８型Ｅ６Ｅ７片段的载体腺病毒（简称ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７ＡＡＶ）感染人胚食管上皮细胞，然后加ＴＰＡ协同作用，观察细胞转化。将人胚食管切碎，与ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７ＡＡＶ同孵育２小时，在加有１０％小牛血清的１９９培养液培养和传代，形成永生化细胞株，即人胚食管上皮细胞汕头株（ＳＨＥＥ）。实验分两组：一组ＳＨＥＥ细胞在传代至第５和１３代时，两次在培养基中加入ＴＰＡ（１２Ｏｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ１３ａｃｅｔａｔｅ）５ｎｇ／ｍｌ，每次诱导２周，所获得的细胞株称为人胚食管上皮癌细胞汕头株１号（ＳＨＥＥＣ１）；另一组ＳＨＥＥ细胞培养条件相同，未加ＴＰＡ，为对照组。细胞转化的形态表型由光学显微镜、电子显微镜和荧光显微镜检查；ＤＮＡ含量和细胞周期用流式细胞仪检测；用３５ｍｍ软琼脂培养皿接种１０３细胞（第２０代），每组５碟，计算集落形成率；裸鼠皮下接种１０６细胞检测致瘤性；用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）和ＰＣＲ检测ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７。结果表明：细胞ＤＮＡ合成和增殖指数（ＰＩｘ），ＳＨＥＥＣ１组（４５％）高于ＳＨＥＥ组（３４％）；高倍体细胞数，ＳＨＥ?

急性病毒性肝炎的发病率慢性肝炎患病率和肝病死亡率的研究

1984～1987年,在黑龙江、河北、河南、湖南、上海五个省市城乡10.08855人口中进行急性肝炎发病率、慢性肝炎患病率、与病毒性肝炎有关的肝病死亡率的研究。急性肝炎标化发病率为152.19/10万,主要发生在20～50岁组人群;因无甲肝暴发流行,除上海外各点季节发病率分布均衡。慢性肝炎标化患病率为158.25/10万(诊断标准为6个月前有明确急性肝炎病史,现有明显的临床症状或体征,肝功能异常,故实际慢肝患病率要高于此数字);与病毒性肝炎有关的肝病死亡(包括肝癌)标化率为22.65/10万,其中肝病为 13.14/10万。男性死亡率显著高于女性。

我国1998～1999年流行的婴幼儿腹泻轮状病毒的分型研究

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿腹泻的主要病原。根据病毒外壳蛋白VP4和VP7抗原性的不同可区分为不同型 :P(VP4,proteasesensitive)型和G(VP7,glycoprotein)型。 1998～ 1999年在中国 8个城市 (长春、秦皇岛、北京、杭州、福州、广州、成都、昆明 )采集了急性腹泻患儿的 10 93份非细菌性腹泻粪便标本 ,先进行A组轮状病毒(HRV)的筛选 ,其中阳性标本 433份 (39 6 % ) ,电泳型长型占优势 (96 % )。对HRV标本 ,再利用血清型特异的MAbELISA和 /或RT PCR进行G分型。结果表明 ,在 1998～ 1999年 ,在上述 8城市非细菌性腹泻流行季节 ,以HRVG1型为主要流行株 ,占阳性总数的 83 4% ,其次为G3(12 0 % )、G4(3 5 % )和G2 (3 2 % )。此外 ,有 3份(0 7% )HRV标本未能分型 ,12 (2 8% )份标本为混合感染。还结合 1982～ 1996年全国 12个地区 1382份HRV标本的分型资料 ,分析了我国HRVG血清型的流行规律。实验中又抽样选取了 12 4份G型HRV标本 ,用RT -PCR进行P分型 ,其中P[8]型 76份 (6 1 3% ) ,P[4 ]型 14份 (11 3% ) ,P[6 ]型 12份 (9 7% ) ,P[9]型 8份 (6 4% )。另外 15份 (12 1% )未能分出P型 ,有待进一步检定。实验中HRV分离株除了常见的P[8]G1(5 1 4% )、P[4 ]G2(4 6 % )毒株外 ,还检测到P[8]G3(11 0 % )、P[

中国疫苗株鸡痘病毒插入载体的构建与MDV糖蛋白B的表达

在对中国鸡痘病毒疫苗株２８２Ｅ４基因组ＤＮＡ进行克隆与亚克隆的基础上，进一步插入Ｐｌｌ一ＬａｃＺ标记基因，根据蓝斑选择原理筛选出３个为病毒在细胞培养物上生长所不必需的片段。为了便于外源基因的插入，特将Ｐ７．５一Ｐｌｌ一ＬａｃＺ基因框转移至ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫＭ１３一的ＢｄｍＨＩ位点，在Ｐ７．５下导人多克隆位点（ＭＣＳ），建立了载体插入标记ｐＳＧＭ１１７５。以ＳｓｔＩＩ和ＡｐａＩ将ＭＣＳ一Ｐ７．５一Ｐｌｌ一ＬａｃＺ框切下，置入一个亚充隆的非必需片段中，构建成中国鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５一１。以ＰｓｔＩ和ＳｍａＩ酶切ｐＶＬｇＢ分离ＭＤＶｇＢ基因的开放阅读框，并将其插入ｐＦＧ１１７５中Ｐ７．５的下游，得到携带ｇＢ基因的质粒ｐＦＧＢ１１７５一１。将此质粒以脂质体转染２８２Ｅ４株感染３一４小时的鸡胚成纤维细胞，同样采用蓝斑筛选技术得到重组的蓝斑病毒。以ＭＤＶｇＢ单克隆抗体进行间接免疫荧光，证实了感染细胞中ｇＢ抗原的存在，从而成功地建立了可表达ＭＤＶｇＢ糖蛋白的以中国疫苗株为基础的重组鸡痘病毒。

流行性出血热病毒单克隆抗体的特性鉴定及其对病毒结构蛋白作用的初步研究

本文运用放射免疫沉淀法(RIP)、Western-blot及ELSA夹心法,对一组针对流行性出血热病毒(EHFV)L99株、C4株的单克隆抗体(McAb)进行特性鉴定,其中4株McAb针对糖蛋白G2,29株针对核壳蛋白(NP),1株针对糖蛋白G1和NP。微量中和试验和血凝抑制(HI)试验分析表明,虽绝大多数抗NP McAb既无中和活性亦无HI活性,但有1株例外。具有明显的中和活性和HI活性,提示EHFV核壳蛋白上可能存在中和抗原和血凝抗原决定簇。2株抗G2 McAb具有较高的HI活性,1株抗G2 McAb有较低的中和活性和较高的HI活性,另一株抗G2 McAb仅具有中和活性,表明EHFV糖蛋白G2上存在独立的中和与血凝抗原决定簇,也可能存在具有中和、血凝双重功能的决定簇。竞争ELISA分析显示。G2蛋白上某些中和位点和血凝位点虽然独立分布,但在某一区域可能相当靠近或有部分重叠。

三种病毒启动子在中国地鼠卵巢(CHO)细胞中表达活性的比较

三种病毒启动子在中国地鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中表达活性的比较刘文军杨芙蓉阮力任贵方朱既明（中国预防医学科学院病毒学研究所北京１０００５２）关键词ＣＨＯｄｈｆｒ－细胞，启动子，瞬时表达，ＨＢｓＡｇ基因，ＣＡＴ基因目前大多数哺乳动物细胞表达载体中的启动子－...

戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白在巴氏毕赤酵母中的胞内表达与纯化的初步研究

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗 ,利用甲醇营养型酵母 pichiapastoris表达系统表达戊型肝炎病毒 (HEV)结构区ORF2蛋白。采用PCR方法从HEVcDNA中扩增得到的ORF2基因克隆到酵母表达载体pPIC3.5K上 ,构建成重组质粒 pPIC3.5KORF2。该质粒转化酵母菌GS115 ,经G418筛选得到高拷贝转化子。转化菌株经Mut表型鉴定后 ,用含甲醇的培养基诱导表达 ,SDS PAGE及ELISA筛选高表达活性菌株 ,放大培养后进行亲合层析纯化。在该系统中成功地表达了高生物活性的HEVORF2蛋白 ,经亲和层析纯化后扫描分析重组蛋白分子量约为 5 9kD ,纯度可达 96 %。Westernblotting证实 ,它与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。HEV结构区ORF2蛋白在甲醇营养型酵母中的成功表达 ,以及初步纯化得到的具有强免疫学活性的重组蛋白 。

中国脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗相关分离株病毒性状的观察

对１９９４年中国分离的１３株脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗相关株进行了ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，发现７株为重组病毒，毒力较疫苗株有回复。在Ⅱ型脊髓灰质炎病毒基因序列上，对于神经毒力有重要影响的第４８１位核苷酸发生了突变（Ｃ→Ｇ），另一个被视为重要位点的第２９０８位核苷酸无一发生变化，反而在第２９０９位核苷发生了高频率的点突变，意味着２９０９位点在中国Ⅱ型疫苗相关株的自然变异中可能起着重要作用。根据转基因小鼠实验和温度敏感实验（Ｒｃｔ－ｍａｒｋｅｒ），脊髓灰质炎病毒的神经毒力大小并不与温度敏感实验所显示的毒力特征呈正相关性。

中国肾综合征出血热疫苗免疫效果评价和免疫策略研究

１９９３～１９９４年对中国试生产的肾综合征出血热沙鼠肾细胞Ⅰ型灭活疫苗（上海生研所和天元公司），乳鼠脑纯化Ⅰ型灭活疫苗（兰州生研所）和地鼠肾细胞Ⅱ型灭活疫苗（长春生研所），在疫区现场进行了人群接种、安全性观察和血清学、流行病学近期效果考核。结果：３种疫苗安全性皆较好，上海沙鼠苗、天元沙鼠苗、鼠脑苗和地鼠苗中强反应率分别为０．５６％、０．０３％、３．２６％、１．５７％。３种疫苗３针全程免疫后１４天，中和抗体阳转率地鼠苗为７８．７８％，上海沙鼠苗为５８．６４％，天元沙鼠苗为７０．００％，鼠脑苗为５１．０９％；荧光抗体阳转率地鼠苗为８２．６４％，上海沙鼠苗为９３．６９％，天元沙鼠苗为８３．３３％，鼠脑苗为８４．２７％。３种疫苗近期流行病学防病效果均较好，保护率地鼠苗为９７．６３％，上海沙鼠苗为９４．０７％，天元沙鼠苗为１００．００％，鼠脑苗为９６．００％。

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

使用本研究室以前构造的双拷贝乙肝病毒重组DNA质粒pSV_2DHBR2-32经改造构成pSV_2DHBR1-32。用此质粒转化CHO-dhfr^-细胞,经克隆、选择、加压增殖建立7个高产HBs-Ag的细胞系,其中首选B43对其生物学性状研究的结果说明,未发现微生物污染,无致瘤性,遗传稳定,纯度满意,核酸杂交试验说明该细胞是整合型,每个细胞约有200个左右的S基因拷贝,转瓶培养研究B43细胞分泌HBsAg的最佳条件为转瓶容积4升,表面积1300cm^2,细胞长成单层后换维持液150ml,其后每48小时收、换液1次,在36℃每小时8转,连续收液60天左右, 每升收液最高产HBsAg为7.5mg。此细胞可用作乙肝基因工程疫苗生产的候选细胞系。

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析

从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒，在ＷＰ１编码区，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定，并经核酸测序进一步证实为疫苗株。其中５株为Ⅰ型疫苗株，１６株Ⅱ型疫苗株，１１株Ⅲ型疫苗株。以同样的分析方法检测这些毒株基因组的３Ｄ聚合酶编码区，发现２株Ⅰ型疫苗株在３Ｄ区的４３１个核苷酸序列为野毒序列，即这２株为Ｓａｂｕｎｌ因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）重组株；其余３株Ⅰ型疫苗株未发现基因重组，１６株Ⅱ型疫苗株中１１株为Ｓａｂｉｎ２基因型（ＶＰ１）与Ｓａｂｉｎ３基因型（３Ｄ）重组株，３株为Ｓａｉｂｎ２基因型（ＶＰ１）与（Ｓａｂｉｎ１＋Ｓａｂｉｎ２）基因型（３Ｄ）重组株，其余２株未发现基因重组。１１株Ⅲ型疫苗株中只有１株发生重组，为Ｓａｂｉｎ３基因型（ＶＰ１）与Ｎｏｎ－Ｓａｂｉｎ基因型（３Ｄ）重组株。另外，对５＇末端非编码区与神经毒力相关的关键位点（Ⅰ型的４８０－Ｇ和５２５－Ｕ，Ⅱ型的４８１－Ａ及Ⅲ型的４２２－Ｕ）基因的检测发现，５株Ⅰ型疫苗株中，１株在位点５２５－Ｕ突变，碱基Ｃ置换Ｕ；３株在位点４８０－Ｇ突变，碱基Ａ置换Ｇ；另１株未发现突变。１６株Ⅱ型疫苗株均在位点４８１－Ａ突变，碱基Ｇ置换Ａ。

中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异

自河北省固安县和上海市的两份急性丙型肝炎病人血清分离丙型肝炎病毒RNA,纯化后经反转录和聚合酶链反应(PCR)获得覆盖病毒基因组全长的cDNA片段。通过对河北株丙型肝炎病毒基因全部cDNA序列的分析,以及对上海株丙型肝炎病毒部分重要区域cDNA序列的分析,确定了中国人丙型肝炎病毒基因cDNA的一级结构和变异趋势。实验结果表明,中国人丙型肝炎病毒的基因结构同日本与美国研究人员最初分离的丙型肝炎病毒基因结构相似。以中国河北株与日本HCV-J株比较,病毒基因有771个核苷酸不同,两者同源性为91.8％;氨基酸残基有174个不同,其同源性为94.3％。与美国HCV-1株相比,中国河北株有2011个棱苷酸发生变化,同源性为78.6％;氨基酸残基有458个发生变化,同源性为84.9％。河北与上海两株比较的结果发现,各区域变异程度大小不同,以E2基因区最高,NS3—NS4,NS5高度保守。总体水平上分析,我国的两株丙型肝炎病毒基因虽有变异,但总变异率很低,并且变异主要发生在结构基因区域。而与国外丙型肝炎病毒相比,变异则贯穿于全基因。表明中国丙型肝炎病毒基因组在核苷酸水平上有一定的共同特征。

PCR方法检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型野毒株的研究

用聚合酶链反应试验（ＰＣＲ）检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（ＰＶＩ）野毒株，仅需５μｌＰＶＩ细胞培养液，方法简便、快速、敏感、特异，用本法对我国１４个省市７９份ＰＶＩ分离株的检测结果，能与检定ｓａｂｉｎⅠ相关株的ＳＩ／ＰＣＲ法的检测结果相印证，与其中３１份核苷酸测序判断为野毒株的结果相一致。其检测阳性率为８４．４％，基本能检测我国流行过的５个ＰＶＩ基因型野毒株。另外，从检测结果看，除北京市未发现野毒株外，其它１３个省区都有野毒株流行，表明当前我国消灭脊灰的任务还很重。

乙型肝炎病毒感染血清流行病学规律的研究

1984～1987年,在湖南、河南、河北、黑龙江4个试点区,整群抽样采血10 484人,采血率达80％以上。HBsAg、抗-HBs和抗-HBc均用RIA法检测。结果4个点乙型肝炎病毒(HBV)标化感染率为58.2％。HBV感染率随年龄增长而升高,7岁时为51.6％,25岁时达63.7％,接近高峰值。HBsAg标化阳性率为10.1％。HBsAg阳性率显示两个高峰,一个在2～8岁时,即儿童峰。从零岁的3.8％至2周岁时的12.5％,已达高峰。湖南的儿童峰值较其它3个试点区高。故HBsAg阳性率南高北低的现象仍然存在(P<0.01)。另一个峰在20～45岁,即成人峰。 抗-HBs标化阳性率为32.2％。HBsAg:抗-HBs之比值,5岁以内为1:1,10岁以后上升为l:3.3～5.9。抗-HBc标化阳性率为45.5％。此结果表明,调查地区均为HBV高感染区,感染主要发生在儿童期。故新生儿是预防乙型肝炎的重点人群。