实时定量PCR在乙型肝炎(HBV)诊断中的应用

随着对乙型肝炎治疗的深入研究 ,对乙型肝炎病毒 (HBV DNA)数量的确诊显得尤其重要。本文采用RealTimeQuantitativePCR(简称RQ PCR)方法 ,对 2 84例经ELISA检定的乙型肝炎患者血清标本进行HBV DNA定量检测。结果有 96例HBsAg(+ ) HBeAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 10 0 % ,病毒平均量 5 0 2× 10 5拷贝 μl;87例HBsAg(+ ) HBeAb(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 4 4% (38例 ) ,病毒平均量 1 0 2× 10 3 拷贝 μl,5 3例HBsAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 5 8% (31例 ) ,病毒平均量 6 6 9× 10 4拷贝 μl;而 4 6例正常对照组经检测全为阴性。可见RQ PCR的检测结果反映了不同患者的病情 ,对乙型肝炎的诊断、治疗具有临床指导价值。

荧光定量RT-PCR检测mdr-1基因表达

目的 :建立荧光定量RT PCR检测肿瘤细胞mdr 1基因表达的方法 ,了解肺癌组织中mdr 1的表达水平。方法 :建立荧光定量RT PCR方法 ,在PE770 0型检测仪上定量检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达水平 ,同时检测 45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果 :荧光定量RT PCR检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达 ,重复 10次实验所得结果平均分别为 (6 86± 0 6 5 )× 10 7拷贝 /μgRNA和 (8 49± 0 6 7)× 10 5拷贝 /μgRNA ,两者相差 80 8倍 ,变异系数分别为 9 5 %和 7 9%。 45例肺部肿瘤中 ,有 12例检出有mdr 1基因不同程度的表达。结论 :荧光定量RT PCR检测mdr 1基因表达方法 ,检测结果用绝对拷贝数来表示 ,定量准确可靠 ,并有利于标准的统一。有 1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr

基因重组构建AFP mRNA的real time RT-PCR标准定量模板

目的 :构建AFPmRNA的realtimeRT PCR标准定量模板。方法 :提取肝瘤细胞株BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,与PMD 1 8T载体连接构建重组质粒。结果 :重组质粒的阳性克隆效率为81 .8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 1 8T载体内。结论 :成功构建了AFPmRNA的标准定量模板 ,可应用于该基因的realtimeRT

以cDNA为内参标RT-PCR定量检测心肌细胞内p53和Bcl-2基因mRNA表达量的方法研究

目的 :探讨 p5 3和 Bcl 2基因在急性心肌梗死时心肌细胞中 m RNA表达量的检测方法。方法 :用以c DNA为内参标的逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测 p5 3和 Bcl 2基因的 m RNA表达量。结果 :p5 3基因 m RNA表达量〔m RNA/总 RNA(ng/ g)〕依次为 :冠脉结扎后 4小时组 (5 76 4 8.78± 19776 .96 ) ng/ g>结扎后 6小时组 (339.0 6± 10 4 .11) ng/ g>结扎后 3小时组 (16 5 .4 4± 33.36 ) ng/ g>结扎后 2小时组 (88.2 5±16 .6 5 ) ng/ g>未结扎 (0 )组 (3.16± 0 .6 9) ng/ g和结扎后 1小时组 (16 .37± 2 .73) ng/ g、8小时组 (2 3.13±7.0 3) ng/ g、 12小时组 (6 .75± 2 .86 ) ng/ g,P均 <0 .0 5 ;Bcl 2基因 m RNA表达量〔m RNA/ g总 RNA(ng/ g)〕:冠脉结扎后 3小时组 (4.5 3± 1.5 9) ng/ g、 4小时组 (0 .0 2± 0 .0 1) ng/ g和 6小时组 (3.4 6±0 .39) ng/ g<结扎后 2小时组 (5 2 .4 8± 14 .18) ng/ g、8小时组 (5 9.2 4± 2 .91) ng/ g<结扎后 1小时组 (77.2 0±12 .4 8) ng/ g和未结扎 (0小时 )组 (81.77± 9.6 2 ) ng/ g<结扎后 12小时组 (99.6 0± 4 .71) ng/ g,P均 <0 .0 5。该种方法能对不同的样本检出不同量的 m RNA含量 ,其特异性强 ,且能检出 0 .0 2 ng/ g的 m RNA含量 ,敏感性高。

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。

乙肝病毒前S1抗原在乙型肝炎临床诊断中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒前S1抗原在乙型肝炎临床诊断中的作用。方法 用ELISA双抗体夹心法检测 3 16例不同模式的HBV血清标志物 (HBVM)血清前S1抗原 ,同时对 14 8例各种类型乙型肝炎的血清标本进行了HBV -DNA定量和前S1抗原的检测。结果 前S1抗原检出率以慢性活动性乙型肝炎最高 ,与HBV -DNA检出率相符 ;急性乙型肝炎时 ,前S1抗原与HBeAg平行存在 ,前S1阴转率高于HBsAg。结论 在乙型肝炎临床诊断中 ,乙肝病毒前S1抗原可作为一个反映HBV复制和传染性的指标。

实时荧光定量PCR检测常见性传播疾病病原体基因

目的 ;用实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)技术准确定量检测常见性病病原体基因 ,为临床治疗提供依据。方法 :采用实时FQ -PCR技术 ,检测了临床送检标本 36 41份。结果 :淋球菌 (NGH) 1416份、沙眼衣原体 (CT) 116 5份、解脲支原体 (UU) 76 5份 ,人乳头瘤病毒 (HPV6 .11) 2 14份、梅毒螺旋体 (TP) 81份 ,阳性率分别为 :2 6 % (36 8/ 1416 )、2 7% (315 /116 5 )、36 .5 % (2 79/ 76 5 )、77% (16 5 / 2 14)、2 1% (17/ 81)。阳性率差异有高度显著性 (P <0 .0 0 1)。NGH、CT、UU、HPV6 .11、TP阳性标本DNA平均拷贝数 :2 .3× 10 6、8.5× 10 5、2 .4× 10 4 、5 .6× 10 7、3 .8× 10 5。 146例治疗后复查 ,其转阴率为NGH6 3 .9% (39)、CT70 % (33)、UU44 .7% (17)。治疗后复查转阴率差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,其DNA拷贝平均数有明显下降。结论 :实时FQ -PCR技术检测常见性病病原体基因 ,具有简便、快捷、特异性高、定量准确等优点 ,对其诊断和治疗有指导意义。

荧光定量RT-PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因的表达

目的 了解急性白血病患者外周血WT1基因的表达水平。方法 建立荧光定量RT -PCR方法 ,用PEABI 770 0PCR仪检测 114例急性白血病患者、2 6例非白血病患者和3 6例正常人外周血中WT1基因的表达水平。结果 2 2例急性髓系白血病 (AML)和 15例急性淋巴细胞白血病 (ALL)初发患者WT1基因的表达量为 10 5～ 10 6拷贝 / μgRNA ,取得部分缓解的 2 6例AML和 19例ALL患者的表达水平为 10 2～ 10 4拷贝 / μgRNA ,而取得完全缓解的 17例AML和 13例ALL患者的表达水平为 0～ 10 2拷贝 / μgRNA。 结论 WT1基因在白血病外周血中有高水平的表达 ,可作为急性白血病疗效考核及监测微残留病的指标。

IL-1基因多态性对类风湿关节炎病情及IL-1蛋白表达影响

目的 :探讨白细胞介素 - 1α(IL - 1α)和白细胞介素 - 1β(IL - 1β)基因多态性对类风湿关节炎 (RA)病情及对IL - 1β产生的影响。方法 :检测 13 6例RA病人及 10 2例正常人的IL - 1等位基因分布 ,其中 72例病人系已明确患病 2年内出现关节破坏者 ,IL - 1基因多态性检测采用PCR -RFLP法 ,同时分析不同类型基因型病人外周血单个核细胞受刺激后分泌IL - 1β水平的不同。结果 :IL - 1α等位基因 1、2的频率和携带率在RA组及正常人组无显著差异。IL - 1β纯合子等位基因 2频率在 2年内出现骨侵蚀组明显高于 2年内未出现骨侵蚀组 ,IL - 1β纯合子等位基因 2携带病人组具有较高的血沉及关节肿胀、压痛指数 ,从携带IL - 1β纯合子等位基因 2病人中分离出的外周血单个核细胞经脂多糖刺激后分泌的IL - 1β量明显高于其它组病人。结论 :RA与IL - 1β基因多态显著相关 ,IL - 1β等位基因 2促进IL - 1β分泌 ,IL - 1β等位基因 2的检测可作为预测RA严重性的一个有用指标。

荧光定量聚合酶链反应诊断弓形虫感染的实验研究

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对孕妇与新生儿弓形虫（TOX）感染的诊断价值。方法以完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法,检测了产妇的血清标本和新生儿脐血标本,同时与常规 PCR法和酶联免疫吸附法（ELISA）比较。结果 225例产妇中,FQ-PCR阳性28例,平均拷贝数值（ml-1）为 1.68×105,阳性率为12.44％,常规PCR阳性率为12.89％,TOX-IgG阳性29例,阳性率为 12.89％,IgM阳性33例,阳性率为14.67％。179例新生儿中,FQ-PCR阳性7例,平均拷贝数值（ml-1）为2.29×105,阳性率为3.91％,常规PCR阳性率为5.03％,TOX-IgG阳性11例,阳性率为6.15％,IgM阳性3例,阳性率为1.68％。结论FQ-PCR特异性比ELISA法高,可以检测TOX的真实感染和复制情况,对TOX的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有较大的应用价值。

肺癌基因治疗研究进展

The high morbidity and mortality of pulmonary carcinoma,especially in male patient,are still the unsolved problems. Recently,more and more reports showed that gene therapy could have potential application in the treatment of the disease. In this article,some progresses in the gene therapy of pulmonary carcinoma, such as tumor suppressor gene,drug sensitive gene,antisense gene,multi-drug resistance gene,immune gene as well as anti-angiogenesis gene, were discussed.

凋亡基因ras突变和rasP21蛋白表达与尿路上皮肿瘤预后关系

目的 研究凋亡基因ras突变和rasP2 1蛋白表达及DNA倍体异常与尿路上皮肿瘤预后关系。方法 应用聚合酶链式反应加单链多态性分析 (PCR SSCP)及流式细胞术和细胞免疫荧光技术检测 52例尿路上皮肿瘤K ras基因突变及rasP2 1蛋白表达和DNA含量变化。K ras基因突变5例 (9 6 % ) ,rasP2 1蛋白阳性表达 36例 (6 9 2 % ) ;异倍体 2 2例 (4 2 3% ) ,二倍体 30例 (57 7% ) ;DNA倍体异常和rasP2 1蛋白表达随肿瘤病理分级和分期的上升而增加 ,与肿瘤预后呈正相关 (P <0 0 1) ;异倍体肿瘤其rasP2 1蛋白表达率明显高于二倍体肿瘤 (P <0 0 1)。结论 DNA倍体异常和rasP2

Bcl-xl和Bcl-2基因在人和兔心肌细胞中的同源性研究

目的 探讨兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl- 2基因的同源性。方法 用人的Bcl-xl和Bcl- 2基因序列来扩增兔心肌细胞的DNA ,纯化其扩增产物 ,然后进行测序 ,再测定人与兔心肌细胞内Bcl-xl和Bcl- 2基因的同源性。结果 兔心肌细胞内Bcl-xl基因的扩增产物长度为 16 2个碱基 ,与人类Bcl-xl基因的碱基序列进行比较 ,在扩增的 15 9个碱基片段中有 15 1个碱基相同 ,其同源性为 95 0 % ;而兔心肌细胞内Bcl- 2基因的扩增产物长度为 2 88个碱基 ,与人类Bcl- 2基因mR NA的碱基序列进行比较 ,在扩增的 199个碱基片段中有 176个碱基相同 ,其同源性为 88 4%。结论 兔和人的有核细胞中Bcl-xl和Bcl- 2基因有很好的同源性 ,在研究兔心肌细胞这两种基因的改变时 ,完全可以用人的Bcl-xl和Bcl- 2基因序列(引物 )来扩增 。

淋病奈瑟菌基因的定量测定分析

淋病(gonorrhea)，人类在古时候就已发现了这种性传播性疾病，gonorrhea是Galen于公元二世纪首次给这个疾病引用的术语，按希腊字义是“从生殖器流出物”的意思．淋病由淋病奈瑟菌(NG)引起，人是其唯一的天然宿主，因而已感染了NG的患者即是传染源，不但有症状者通过性接触可感染对方，无症状者也同样可以传染他人．此外。

用PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的 了解本地区结核分枝杆菌对利福平 (RFP)耐药基因的突变情况 ,探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法。方法 针对rpoB基因设计一对引物 (扩增产物为 189bp) ,采用聚合链酶反应 单链构象多态性银染 (PCR SSCP)方法 ,以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照 ,检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析。结果 以药敏试验结果为对照 ,35株临床分离株中有 9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株 (H37Rv)相同 ,2 6株RFP耐药株中有 2 4检测到突变图谱 ,与药敏试验结果对照阳性率为 92 .3% ,特异性为 10 0 %。结论 RpoB基因是一种高度保守序列 ,结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致。本研究针对其高突变区域设计一对引物 ,运用PCR SSCP法具有简便、快速、准确的特点 ,可以对临床标本中结核分枝杆菌进行检测 。

粤北地区地中海贫血检出率及基因分型的调查分析

目的 了解粤北地区地中海贫血的发病情况及基因分型。方法 红细胞休克 -管定量法对所有受检人进行地贫筛查 ,对地贫筛查阳性的标本进一步采用PCR法进行α地贫 1基因检测 ,用PCR结合反向点杂交法 (RDB) ,进行 β地贫的基因检测。结果 在 10 10例受检者中 ,地贫筛查阳性的有 118例 ,占受检总人数的 11.6 %。地贫筛查阳性的所有标本均进行了α地贫 1基因检测 ,诊断为α地贫 1杂合子的有 6 9例 ,占受检总数的 6 .83% ,32例进行了 β地贫基因检测 ,其中 2 1例为 β地贫杂合子 ,占受检总数的 2 .1% ,其基因突变类型分别是 :CD4 1- 4 2 (-TTCT)突变 12例 ,IVS - 2 - 6 5 4 (C→T)突变 2例 ,- 2 8(A→G)突变 2例 ,CD17(A→T)突变 2例 ,71- 72 (+A)突变 2例 ,2 7- 2 8(+C)突变 1例。结论 粤北地区地中海贫血发生率较高 ,做好婚前及产前地贫筛查及产前基因诊断等工作 ,对避免重型地贫患儿的出生 ,具有重要意义。