步长脑心通含药血清抗缺氧诱导的皮质神经元凋亡的实验研究

目的运用中药血清药理学方法研究步长脑心通抗缺氧诱导的原代皮质神经元凋亡的作用。方法培养出生24h内SD乳鼠大脑皮质神经元,第7天以不同浓度步长脑心通含药血清处理后制造缺氧模型,定性定量检测细胞凋亡:MTT法观察神经元活力;Hoechst33258染色分析细胞核形态的变化;琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂,进一步验证和检测细胞凋亡。结果步长脑心通含药血清处理后缺氧神经元活力增加,缺氧所致神经元凋亡明显减少。结论步长脑心通对缺氧引起的皮质神经元凋亡有抑制作用。

灯盏花素对糖尿病大鼠视网膜血流动力学变化的影响

【目的】探讨糖尿病大鼠视网膜中央动脉(CRA)的血流动力学变化及灯盏花素的防治作用。【方法】用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型后,在第12-13周采用彩色多谱勒对各组视网膜中央动脉(CRA)进行血流参数的测量,包括峰值血流速度(PSV)、舒张期最低流速(EDV)、平均血流速度(MV)、阻力指数(RI)和搏动指数(PI)。【结果】糖尿病组大鼠CRA的血流速度较对照组显著降低(P<0.01),而阻力指数和搏动指数则显著增高(P<0.05)。在灯盏花素治疗组,糖尿病大鼠视网膜血流动力学得到显著改善,与糖尿病组相比CRA的血流速度显著增加(P<0.01),阻力指数和搏动指数显著降低(P<0.05)。【结论】12周的糖尿病大鼠视网膜已开始出现血流灌注不良和血流减少,但灯盏花素能明显改善糖尿病大鼠的视网膜的血流动力学,增加血流量和灌流量。

荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

【目的】研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因。【方法】应用荧光差异显示PCR(FDDPCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northernblot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆。【结果】利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northernblot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13)。【结论】应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。

咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及机制

目的 观察咖啡因 (caffeine)对苯妥英 (diphenylhy dantoin ,DPH) 10 0 μmol·L-1处理的大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranularneurons ,CGNs)存活率的影响 ,并探讨其作用机制。方法 体外培养 8d的CGNs,同时给予 10 0μmol·L-1苯妥英和 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因 ,4 8h后行凋亡分析 ;采用dantrolene(2 0 μmol·L-1)、2APB (5 0 μmol·L-1)、nifedipine(10 0 μmol·L-1)和nimodipine(10 0 μmol·L-1)、MK80 1(4μmol·L-1)、KN93(1μmol·L-1)以及MEK1抑制剂PD980 5 9(5 0 μmol·L-1)分别预先孵育 30min ,再与10mmol·L-1咖啡因和 10 0 μmol·L-1苯妥英共孵育 4 8h ,测定CGNs存活率 ,观察咖啡因的作用与 [Ca2 + ]i 的关系 ;Westernblot法检测咖啡因对磷酸化c Jun和磷酸化ERK水平的影响。结果 ① 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因可浓度依赖性抑制 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡 ,显著提高CGNs存活率 ;②dantrolene、2APB、nifedipine和nimodipine、KN93、MK80 1和PD980 5 9均不能取消 10mmol·L-1咖啡因对 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡的保护作用。③咖啡因可明显抑制苯妥英诱导CGNs中c Jun磷酸化水平的升高 ,但不影响被苯妥英抑制的ERK的活性。结论 一定浓度的咖啡因可保护苯?

一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立

目的:在不改变细胞生长环境条件下,建立一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导细胞凋亡模型。方法:取新生鼠培养第8d的皮层神经元,采用不改变原培养基成分,将细胞置于缺氧环境(密闭容器内,抽取成真空并维持30min,然后充95%N2、5%CO2)中分别培养0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和24h后,于不同时间取出,Hochest33258神经元核染色观察凋亡小体及凋亡细胞核,抽提DNA琼脂糖电泳检测DNA梯形条带,以明确导致皮层神经元凋亡的缺氧时间。结果和结论:缺氧0.5h后即可见DNA梯形条带形成,缺氧1h后即可见神经元细胞核固缩、细胞核凋亡小体形成。在不改变细胞培养基及其它成分的条件下,平均缺氧1h即可诱导体外培养的神经元细胞凋亡,成功地建立起一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导神经元凋亡模型,而且重复性好,可以作为体外缺氧/缺血诱导神经元凋亡的良好平台。

高糖诱导人内皮细胞凋亡及其JNK、AKT信号途径的作用机制

目的探讨高糖诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)凋亡的JNK及AKT信号途径作用机制。方法HUVECs细胞分别在生理浓度葡萄糖(5mmol/L) (NG)、高葡萄糖(30mmol/L) (HG)、高糖加JNK特异性阻断剂SP6 00 12 5 (10 μmol/L) (HG +I)条件下培养72h。Hoechst332 5 8染色,荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变;annexinV FITC试剂盒染色,流式细胞仪进行细胞凋亡定量;Westernblot方法测定细胞p JNK、p- c- JUN、p AKT水平。结果高葡萄糖培养72h ,内皮细胞凋亡率为13 .31% ,显著高于对照组5 . 6 9% (P <0 . 0 1)。高糖条件下内皮细胞p JNK、p c JUN水平较对照组显著增加(P <0 . 0 5 ) ,而p AKT显著降低(P <0 . 0 1)。SP6 0 0 12 5应用后,与高糖组比较p JNK无显著变化、p c JUN含量降低(P <0 .0 5 ) ,而p AKT升高(P <0 . 0 1) ,高糖诱导的内皮细胞凋亡被抑制(8. 38% ,P <0 . 0 1)。结论高糖可诱导内皮细胞凋亡,其机制可能是激活JNK及其下游c- JUN ,而抑制AKT的活化,而JNK活化程度对AKT信号通路可能存在调节作用。

LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

【目的】观察磷酸肌醇3位羟基激酶(PI3-K)的特异性阻断剂LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元(CGN)凋亡的影响。探讨磷酸肌醇3位羟基激酶/AKT(PI3-K/AKT)信号转导通路是否参与了热预处理的保护作用及其机制。【方法】以低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡为模型。用相差显微镜观察形态学,DNA琼脂糖凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,二乙酸荧光素(FDA)染色法检测细胞的存活率。蛋白质印迹(Westernblot)法检测蛋白的表达。【结果】热预处理(44℃,1h)可以保护低钾诱导的CGN的凋亡,使神经元存活率由(33.2±4.1)%上升至(76.1±5.6)%(P <0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体减少,DNA凝胶电泳DNA梯状条带明显减弱。LY294002(20μmol/L)可以明显抑制热预处理的保护作用,使神经元的存活率降至(37.4±3.5)%(P<0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体,DNA凝胶电泳出现梯状条带。热预处理可使HSP70、磷酸化AKT增高。LY294002可以抑制磷酸化AKT(p-AKT)的增加,而对HSP70则无明显影响。【结论】在低钾诱导CGN凋亡的模型中,LY294002可以抑制热预处理的抗凋亡作用,并可抑制p鄄AKT的增加,显示PI3鄄K/AKT信号转导通路参与了热预处理的保护作用,但该抑制作用可能不是通过抑制热休克蛋白(HSP)

“低钾”诱导神经元凋亡过程中ARNT2上调表达的分析

目的 :观察“低钾”诱导大鼠神经元凋亡过程中ARNT2的表达变化 ,探讨ARNT2与神经元凋亡的关系。方法 :建立“低钾”诱导神经元凋亡模型 ,应用RT -PCR分析ARNT2在凋亡过程中mRNA的表达变化 ,Westernblotting分析蛋白质的表达变化 ,间接免疫荧光与激光共聚焦确定亚细胞定位。结果 :“低钾”诱导 30min后大鼠小脑颗粒神经元ARNT2mRNA表达水平即明显上调 ,1h后上调表达最明显 ,并持续至“低钾”诱导后 12h左右 ,ARNT2蛋白质水平的表达变化与mRNA水平的表达变化相似 ,免疫荧光结合激光共聚焦分析显示ARNT2蛋白定位于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内。结论 :ARNT2分布于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内 ,在“低钾”诱导的凋亡过程中ARNT2mRNA与蛋白均上调表达。

烟碱拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用

【目的】研究烟碱对皮质神经元的保护作用。【方法】在培养至第6天的皮质神经元中以不同浓度(1 μmol/L,10μmol/L,100μmol/L)烟碱预孵2 h,再加入0.1μmol/L秋水仙碱作用24 h。通过相差显微镜形态学观察,Hoechst33258核荧光染色进行凋亡率计数和测定乳酸脱氢酶相对释放量(LDH)的实验,再测试10μmol/L 预孵不同时间(0.5,2,8)h的烟碱对秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。【结果】秋水仙碱可诱导皮质神经元调亡,烟碱可拮抗秋水仙碱的此种作用。其中10μmol/L烟碱预孵2 h保护作用最强。【结论】烟碱可拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。

诱导型HSP70过表达对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

目的观察腺病毒介导的人诱导型HSP70过表达对低钾诱导的原代培养的大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranuleneurons,CGN)凋亡的影响。方法原代培养5d的CGN共感染含人诱导型HSP70和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒(AdTR5/HSP70-GFP)和四环素调控的启动子(AdCMV/tTA),或共感染含GFP的腺病毒(AdTR5/GFP)和AdCMV/tTA(对照组)。48h后,采用细胞荧光免疫组织化学法、Westernblot法检测HSP70的表达,或者换成无血清含5mmol·L-1KCl的培养基以诱导神经元凋亡。24h后,采用相差显微镜观察细胞形态学变化,MTT法检测神经元存活率,Hoechst33258核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析神经元凋亡,以观察HSP70过表达对低钾诱导的CGN凋亡的影响。结果共感染了AdCMV/tTA和AdTR5/HSP70-GFP的CGN过表达了HSP70,抑制了低钾诱导的CGN的凋亡:使神经元存活率由45·5%±5·2%提高至82·3%±5·2%(P<0·01),核固缩减少,DNA的片段化减轻。结论腺病毒介导的人诱导型HSP70的过表达抑制了低钾诱导的CGN凋亡。

鹅不食草对实验性变应性鼻炎血清组胺影响的观察

组胺在变应性鼻炎（Allegic Rhinitis，AR）发病的多个环节起重要作用，又称β-咪唑乙胺，由肥大细胞、嗜碱性粒细胞受刺激后脱颗粒释放组氨酸，组氨酸再经组氨酸脱羧酶脱羧后产生，作用于其受体引起效应。鹅不食草又称地胡菽、窝更比，是菊科石胡荽植物的干燥有花全草、传统的解表中药。味辛、性温，入肺、肝、脾经，有祛风、散寒、去翳、利湿、散瘀、消肿、通窍、止咳、通痹、解毒等功能，Naito报告可以减轻鼻阻塞，Wu等报告可抗过敏。本文研究鹅不食草对豚鼠AR模型的干预作用。

限制性差异显示RT-PCR技术对大鼠脑缺血相关基因表达的研究

目的研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血与非缺血组织中基因表达的差异,以及差异表达基因随时间变化的规律,为临床寻找新的防治脑缺血的靶点奠定基础。方法采用线栓法制备大鼠不同时间脑缺血动物模型,采用限制性差异显示RTPCR技术(restrictiondisplayRTPCR,RDRTPCR),研究在大鼠局灶性脑缺血过程中差异基因的表达。结果在缺血后各时间点分别出现上调的EST片段有32条、下调的有13条。其中7条在缺血0.5、1.0、4.0小时均出现变化,分别系同一对引物所扩增且分子量相同,其在脑缺血中的表达具有一定的规律性。结论利用RDRTPCR技术成功获取了大鼠脑缺血过程中差异表达的基因,并揭示了部分基因在脑缺血过程中呈现的规律性变化,为进一步筛选、鉴定与克隆表达这些与脑缺血密切相关的基因,阐明脑缺血发病机制奠定基础。

KIAA0280的亚细胞定位及在缺血脑组织中的表达

目的观察大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中KIAA0280蛋白的表达及亚细胞定位。方法应用免疫组织化学法测定KIAA0280在大鼠急性脑缺血后在缺血与非缺血区表达的差异,利用激光共聚焦扫描显微镜检测KIAA0280的亚细胞定位。结果免疫组织化学结果证实了KIAA0280在大鼠急性局灶性脑缺血后表达的差异,激光共聚焦扫描显微镜证实KIAA0280在大鼠皮层细胞。胶质细胞胞浆和细胞膜上均出现表达。KIAA0280在脑缺血后明显上调表达。结论KIAA0280与蛋白质合成和信号传递有密切关系,为新的脑缺血相关蛋白质,对其功能深入研究将对诊断和治疗脑缺血缺氧疾病奠定基础。

西地那非对狗股骨头血流量的影响

目的 探索西地那非选择性增加股骨头血流量的可能性。方法 a)狗 16只 ,随机分为 A、B两组 ,A组 10只用于经静脉用西地那非实验 ;B组 6只用于经髋关节外周动脉用西地那非实验。b)氢廓清技术用于定量测定股骨头血流量。结果 a) A组 :高剂量组血流量从 (0 .16 89± 0 .0 2 80 ) m L· min- 1 · m L- 1 增加到 (0 .2 0 39± 0 .0 90 7) m L·min- 1 · m L- 1 ,差异不显著 ;中剂量组血流量从 (0 .15 4 1± 0 .0 4 2 1) m L· min- 1 · m L- 1 增加到 (0 .1783± 0 .0 84 7)m L·min- 1 ·m L- 1 ,无显著差异。b) B组 :低、中、高剂量用药后股骨头血流量增加 ,但仅高剂量用药后血流量 (0 .2 2 92± 0 .0 84 7) m L· min- 1· m L- 1与用药前的 (0 .1330± 0 .0 6 6 1) m L· min- 1· m L- 1比较有显著差异 ;血流量与药物剂量间存在回归关系 ,其回归方程为 :Y=4 .184 X+12 .933。结论 西地那非能增加狗股骨头血流量 ,为其治疗股骨头缺血性坏死疾病临床前评估提供了理论依据。

大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析

目的克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA。方法以大鼠大脑MarathonReadycDNA为模板,采用SMARTRACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA,产物亚克隆到pGEM-Teasy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析。结果经过3次5′RACE扩增,得到的5号ESTcDNA长度为5663bp,其中包含1个2136bp的完整的开放读码框序列,与已知大鼠基因芳香烃受体核转位因子(2Arylhydrocarbonreceptornucleartranslocator2,Arnt2)完全同源;该cDNA3′端非编码区长达3323bp,包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列。结论5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2,该基因3′端完整的非编码区cDNA序列为首次报道。神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础。

大鼠神经元Arnt2亚细胞定位的预测与分析

目的:分析大鼠小脑颗粒神经元Arnt2的亚细胞定位情况。方法:利用CBS生物信息资源,根据Arnt2氨基酸序列(LOCUS:NP_036913)进行真核生物亚细胞定位预测,并寻找Arnt2核输出信号(NES);最后利用激光扫描共聚焦显微术(LSM)确定Arnt2在正常大鼠小脑颗粒神经元中的亚细胞定位情况。结果:预测Arnt2在真核生物细胞中主要为细胞核定位,并具有线粒体定位的可能性;预测结果还显示Arnt2氨基酸序列上存在着核输出信号,具体位置为氨基端第143位亮氨酸;LSM分析结果证实Arnt2定位于大鼠小脑颗粒神经元细胞核内。结论:Arnt2定位于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内;Arnt2具有线粒体定位的可能性,并存在核输出信号,提示在某些诱导因素作用下,Arnt2存在线粒体定向转位的趋势。

血管内皮细胞上钙通道与氯通道功能研究进展

血管内皮细胞属于非兴奋性细胞,覆于血管腔内表面,其胞浆膜富含离子通道,构成其独特的信号传导功能的物质基础,本文综述了近年来有关内皮细胞上钙离子和氯离子通道在内皮细胞功能中的角色的研究,以期能够进一步探讨心血管疾病与离子通道功能异常之间的关系。

灯盏花素对糖尿病大鼠视网膜血流动力学变化的影响

探讨糖尿病大鼠视网膜中央动脉(CRA)的血流动力学变化及灯盏花素的防治作用。用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型后,在第12-13周采用彩色多谱勒对各组视网膜中央动脉(CRA)进行血流参数的测量,包括峰值血流速度(PSV)、舒张期最低流速(EDV)、平均血流速度(MV)、阻力指数(RI)和搏动指数(PI)。糖尿病组大鼠CRA的血流速度较对照组显著降低 (P<0.01),而阻力指数和搏动指数则显著增高(P<0.05)。在灯盏花素治疗组,糖尿病大鼠视网膜血流动力学得到显著改善,与糖尿病纽相比CRA的血流速度显著增加(P<0.01),阻力指数和搏动指数显著降低(P<0.05) 12 周的糖尿病大鼠视网膜已开始出现血流灌注不良和血流减少,但灯盏花素能明显改善糖尿病大鼠的视网膜的血流动力学,增加血流量和灌流量。

ABO血型与药疹相关性探讨

调查193例药疹患者的血型分布频率,与40980例自然人群的血型分布频率作比较,以探讨遗传因素ABO血型与药疹发生的相关性。药疹患者中O型血的比例高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。ABO血型可能与药疹的发生存在相关性,O型血者可能更易发生药疹。

小脑颗粒神经元低钾性凋亡过程中Arnt2核浆转位的分析

目的:分析大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)“低钾”性凋亡过程中Arnt2亚细胞定位的变化。方法:W estern b lotting法分析“低钾”性凋亡过程中CGNs核抽提物中Arnt2蛋白质的表达变化,间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微术(LSM)分析Arnt2蛋白质亚细胞定位的变化。结果:在CGNs细胞核抽提物中,“低钾”诱导30 m in后Arnt2蛋白质已明显表达上调,1 h后达至峰值水平,“低钾”诱导6 h后上调表达的Arnt2回落至正常对照水平;LSM分析显示位于正常CGNs细胞核内的Arnt2在“低钾”作用下逐步向胞浆转移,并在CGNs凋亡末期与胞浆线粒体定位的HSP60完全重叠。结论:Arnt2在小脑颗粒神经元“低钾”性凋亡过程中发生了核浆转位;结果提示,Arnt2很可能是通过传递“低钾”诱发的细胞凋亡或存活信号而直接参与小脑颗粒神经元“低钾”性凋亡的调控。