系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-丙氨酸

L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等领域。目前,L-丙氨酸主要通过大肠杆菌来生产,开发安全、工业稳定的谷氨酸棒杆菌生产菌株具有重要的意义。该研究筛选了外源丙氨酸脱氢酶,在不以其他氨基酸为氨基供体的条件下高效率合成L-丙氨酸。强化非磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖摄取途径,极大地促进了细胞的生长和L-丙氨酸的合成。引入异源Entner-Dondoroff途径,通过4步反应即可实现糖酵解途径10步反应供应前体物丙酮酸,进一步提高了L-丙氨酸的产量。此外,为了避免抗生素的使用和保证菌株的遗传稳定性,将关键基因整合到基因组上。最终工程菌株在5 L发酵罐发酵48 h产生104 g/L L-丙氨酸。该研究为利用谷氨酸棒杆菌工业化生产L-丙氨酸奠定了基础,同时为其他丙酮酸族产品的代谢工程研究提供了参考。

底物及底物处理方法对胞磷胆碱发酵的影响

以氯化胆碱、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠为底物发酵法生产胞磷胆碱的过程中,后期高浓度盐离子导致菌体活力下降甚至衰亡,是限制胞磷胆碱产业化的主要问题。该研究为解决这一问题,首先确定了不同底物对胞磷胆碱发酵的影响。其次为了消除Cl^(-)、K^(+)、Na^(+)对发酵的影响,分别使用电渗析法和离子交换树脂对底物进行预处理,探究二者的分离效率,结果得知离子交换树脂在效率以及成本上均优于电渗析法。因此为了实现胞磷胆碱大规模生产,在此基础上探究不同强度的离子交换树脂,实验确定了最适树脂型号、上样体积、上样浓度、洗脱液浓度、再生溶液类型以及树脂的稳定性,解决了后期高盐离子导致的高渗透压问题,使得以廉价原料高效生产胞磷胆碱成为可能。最后通过5 L发酵罐放大验证,以胞磷胆碱产量、生物量、糖酸转化率为指标,最终胞磷胆碱产量达到了32.1 g/L,糖酸转化率为25.4%,为目前国内发酵法生产胞磷胆碱的最高水平。与直接使用磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱相比成本降低了85%,也证明了该次实验的可行性,对胞磷胆碱大规模工业化生产有一定的指导意义。

Fe^(2+)螯合剂对羟脯氨酸发酵的影响

为解决反式-4-羟基脯氨酸发酵过程中Fe^(2+)供应不足、产酸效率低等问题。该研究以大肠杆菌HYP-08为供试菌株,首先通过单因素实验探究Fe^(2+)螯合剂种类及添加量对羟脯氨酸发酵生产的影响,并通过5 L发酵放大验证,以羟脯氨酸产量、生物量,糖酸转化率为指标,进一步探究其在放大过程中的影响,结果表明葡萄糖酸亚铁对羟脯氨酸发酵效果最好,流加发酵生产中,最终确定了10 h开始持连续流加的补料方式,反式-4-羟基脯氨酸生物量及产量达到最高,分别为146.2、118.6 g/L,较优化前提高了12.1%和4.2%,副产物乙酸减少到1.05 g/L,葡萄糖酸亚铁的添加有效增强了菌体活力,提高了羟脯氨酸的产量和糖酸转化率,为微生物发酵生产羟脯氨酸提供了依据。

L-酪氨酸连续发酵工艺研究

当前工业上用微生物发酵法生产L-酪氨酸的工艺中,基本都是前期向发酵罐内加入基础培养基,中后期再流加各类营养物质,虽然整个发酵过程中减少了取料和放料的操作,保证发酵中物料不被浪费,但是,随着流加物质的不断增加,发酵液体系不断扩大,该过程在发酵后期需要不断地人为调控发酵参数,而人为调控中,难以避免调控参数波动,并最终影响发酵结果。因此,实验采用高效连续发酵,该工艺可以大大提高菌体活力,并且有效延长产酸高峰期,为了优化L-酪氨酸的高密度连续发酵生产工艺,通过对大肠杆菌TYR-05发酵培养,考察了L-酪氨酸发酵过程并且分析了菌体量、产酸量、产酸效率、糖酸转化率的情况,确定L-酪氨酸高密度连续发酵过程中接种量、糖速率、糖耗量、底糖浓度等关键条件,以达到高密度连续发酵工艺控制条件优化。实验结果表明在5 L发酵罐中,选择30%的种子接种量,发酵起始时,底物氯化胆碱浓度为1 g/L并每4 h向罐内流加0.2 g/L的氯化胆碱,发酵至12 h时,底糖耗尽,开始以12 g/(L·h)的补糖速率向罐内提供葡萄糖,并在此时开始放液,放液速率为0.13 L/h,使得装液量恒定在20%左右,发酵25 h时开始流加复合营养液,发酵35 h时最高菌体OD_(600)达到65,产酸量为55.8 g/L,糖酸转化率为25.4%,为L-酪氨酸连续发酵工业化生产提供了重要参考。

微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述

现阶段,随着资源枯竭和环境污染问题的日益突出,利用农业废弃物等木质纤维素原料发酵生产生物产品、生物能源和生物材料已经成为学术界和社会的共识.微生物同步利用葡萄糖和木糖是木质纤维素生物炼制的重要内容,同时也有利于提高芳香族氨基酸等产品的发酵性能.然而,由于碳分解代谢物阻遏(葡萄糖效应)的存在,大多数微生物并不具备这种特性,迫切需要采用代谢工程手段构建高效同步利用葡萄糖和木糖的菌株.首先对微生物同步利用葡萄糖和木糖的意义进行了说明,然后阐述了氨基酸和核苷生产菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌葡萄糖效应的分子机制和破除策略,同时介绍了一些能够同步代谢葡萄糖和木糖的工程菌株的实际应用.

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilv LXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,以期获得L-异亮氨酸生产菌。将ilv LXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilv LXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv IH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19 g/L。针对ILE03α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilv A和ilv IH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L。利用ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6%。

溶氧对L-羟脯氨酸发酵的影响及其控制

为了研究溶氧对L-羟脯氨酸发酵的影响,分别在不同的溶氧水平下进行发酵实验,通过对菌体生长情况、L-羟脯氨酸产量、糖酸转化率和副产物乙酸积累量的分析,确定L-羟脯氨酸发酵的最佳溶氧控制条件.结果表明:采用分阶段溶氧控制策略,在发酵前期(0~8h)维持溶氧在20%~30%,发酵中期(8~24h)维持溶氧在30%~40%,发酵后期(24~32h)溶氧维持在20%~30%.在此条件下进行L-羟脯氨酸发酵时,L-羟脯氨酸产量和糖酸转化率最高,分别达到45.3g/L和20.7%,并且乙酸积累量较低,仅为1.7g/L.结果表明,分阶段溶氧控制策略既有利于菌体生长,促进产物高效合成,同时又能有效降低副产物乙酸的形成,使整个L-羟脯氨酸发酵过程维持良好的状态.

改变中心碳代谢途径对发酵生产L-亮氨酸的影响

以一株L-亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CP为研究对象,研究高活性磷酸转酮酶(PKT,fxpk编码)的表达对其产酸的影响.首先研究过表达PKT对C.glutamicum CP产酸的影响,副产物L-丙氨酸的积累减少.通过删除ltbR(leucine and tryptophan biosynthesis regulator),插入P_(tuf)-fxpk表达盒,弱化gltA(编码柠檬酸合酶)的表达,获得菌株C.glutamicum CPΔltbR∷P_(tuf)-fxpkΔP_(gltA)∷P_(dapA),其生长速率下降,L-亮氨酸的产量(53.0 g/L)提高10.0%,同时副产物L-丙氨酸减少33.3%,转化率提高23.5%.本研究获得L-亮氨酸的工程菌,较出发菌具有一定优势.

大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp),是生物体内非常重要的必需氨基酸,具有重要的生物学功能,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。本文中,笔者介绍了芳香族氨基酸的生物合成途径以及代谢调控,综述了构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的代谢工程策略。针对现阶段工业化生产芳香族氨基酸存在的问题,笔者对进一步应用代谢工程策略改造芳香族氨基酸菌株进行了展望。

基于近红外光谱结合代谢流分析的L-缬氨酸发酵过程监控

L-缬氨酸作为必需氨基酸之一,在许多发酵类食品配料方面有重要应用。及时监控其发酵过程,有利于L-缬氨酸产品品质的提升。本文建立了一种发酵类的食品配料生产过程监控新方法。该方法通过对发酵原料和产物进行分析,建立主要原料及产物的近红外模型,结合代谢流模型,能够快速分析不同发酵条件下细胞内部代谢流分布及变化,实时监测发酵过程各项参数。该方法能够实现同时对多组分快速、准确的检测,从而弥补了传统检测方法的缺点和不足;能够快速分析获得发酵过程细胞内部代谢流分布,从而帮助控制发酵过程条件,实时监测发酵过程参数,为发酵过程自动化控制提供理论基础,为发酵类食品配料生产过程监控提供方法。

基于近红外技术谷氨酸发酵过程中乳酸浓度预测模型的建立

乳酸是谷氨酸发酵过程中的主要副产物,及时准确地检测其浓度变化对谷氨酸发酵过程控制和优化具有重要意义。该文采用近红外光谱技术结合偏最小二乘的方法建立并优化谷氨酸温度敏感突变株发酵过程中乳酸浓度预测模型。在光谱预处理为一阶导数＋矢量归一化（1st＋SNV）、波数为5 500-7 500 cm-1＋4 200-4 900 cm-1条件下获得最优乳酸浓度预测模型。该模型交叉验证误差均方根（RMSECV）、决定系数（R2）以及剩余预测偏差（RPD）分别为0.482 g/L、0.912和5.98。分别以谷氨酸正常发酵和低溶氧发酵条件下获得的发酵液验证该模型的准确性和可靠性,与实际浓度相比,该模型R2分别为0.914和0.923,平均相对误差分别为7.86%和6.58%。上述结果证明,该预测模型能够很好地检测发酵过程中乳酸浓度,可为谷氨酸温度敏感突变株强制发酵过程中乳酸浓度实时监控及发酵过程优化提供理论和实践依据。

基于近红外检测技术建立发酵过程中L-色氨酸浓度预测模型

目的：我国发酵法生产L-色氨酸存在着产酸率、糖酸转化率和提取率较低以及检测速度较慢等不足之处,为了提升发酵控制水平及产物浓度的快速检测,采用近红外检测技术建立发酵过程中L-色氨酸浓度预测模型.方法：利用近红外光谱技术,结合偏最小二乘法,建立发酵液中L-色氨酸浓度预测模型.结果：在光谱预处理为二阶导数、波数范围为6101.8～5450 cm-1条件下获得最优L-色氨酸浓度预测模型.经验证,该模型具有一定的准确性和可靠性,其预测值与测量值仅有5.16％的偏差.结论：该模型具有较好的预测能力,可为大肠杆菌L-色氨酸发酵过程中浓度快速检测提供可靠数据,并为L-色氨酸发酵过程控制提供理论和实践依据.

当量生物素控制对谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的影响

以谷氨酸棒杆菌YILM 1504为出发菌,研究了生物素对L-异亮氨酸产量的影响。基于多梯度生物素对比实验及中后期生物素外源添加实验,确定了发酵液中最佳生物素浓度及补料工艺。结果显示:在低浓度生物素发酵液中,最适生物素浓度为45μg/L,此时产酸达到42.5g/L,糖酸转化率达到最高,为13.4%;在大于60μg/L高浓度生物素发酵液中,产酸最高为22g/L,表明高浓度生物素不利于产酸发酵。在5L发酵罐中,初始生物素浓度为30μg/L,18,32,42h分别添加10g/L玉米浆(15μg/L生物素),54h产酸量达到了44.5g/L,比初始生物素浓度为30μg/L,后期不补料产酸量提高了49.8%。

NH_(4)^(+)双阶段发酵控制谷氨酸工艺研究

为了缓解L-谷氨酸发酵过程中由于流加氨水调节pH所带来的高浓度NH_(4)^(+)抑制作用的问题,提出了NH_(4)^(+)双阶段发酵控制工艺。NH_(4)^(+)双阶段发酵控制工艺是指在L-谷氨酸发酵过程中采用NaOH和氨水的混合液代替氨水进行pH的调节,同时根据不同阶段NH_(4)^(+)浓度的需求调整NaOH与氨水的混合比例,使其最适于L-谷氨酸发酵。通过实验发现,发酵开始时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶7的调节液,发酵19 h后采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶3的调节液代替氨水进行pH的调节,对于L-谷氨酸发酵提升效果最好,在此条件下最大OD_(600)达到了63,较基础发酵提高了23.5%,最终的菌体量为58,提高了52.6%,下降幅度为5,降低了61.5%,L-谷氨酸最终产量为171 g/L,提高了11.8%,糖酸转化率也由60.2%提高到了61.6%,同时对其代谢流进行分析后发现,L-谷氨酸代谢流提高了3.9%,L-丙氨酸、L-赖氨酸和乳酸代谢流分别降低了21.7%、21.5%和24.7%。NH_(4)^(+)双阶段发酵控制有利于提高菌体的活力和产酸性能,对于谷氨酸行业的精细化控制具有借鉴意义。

代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸

L-丝氨酸是一种具有重要生理学功能的中性氨基酸,广泛应用在食品、化妆品和医药等领域。为构建L-丝氨酸的生产菌株,对Escherichia coli MG1655进行了系统的代谢工程改造。采用的方法策略包括减弱L-丝氨酸的降解,增强L-丝氨酸合成酶类的表达以及转运系统的改造。特别是利用启动子P trp调控丝氨酸羟甲基转移酶的表达,减弱了L-丝氨酸向甘氨酸的降解途径,显著增强了L-丝氨酸的合成。最终所得菌株SER09摇瓶发酵24 h,L-丝氨酸产量可达13.53 g/L;在5 L发酵罐上发酵28 h,L-丝氨酸产量达到22.31 g/L。该研究从头构建了1株产L-丝氨酸的平台菌株,具有较好的应用前景。

利用膜透析技术提高腺苷发酵产量

为提高发酵法生产腺苷的产量,解决现有发酵产腺苷周期短,葡萄糖转化成腺苷的效率较低等问题,以Bacillus subtilis XGL(8-AG^(r)+His^(-)+xan^(-)+SG^(r))为供试菌株,进行膜透析发酵生产腺苷的研究。在5 L发酵罐中发酵生产腺苷,分别在36、60 h对发酵液进行2次膜偶联透析,使发酵周期延长至96 h,菌体OD_(600 nm)提高到94.6,单批次产苷448.3 g,平均产苷44.2 g/L,糖苷转化率提高到25.1%。相比传统发酵工艺,膜偶联间歇透析发酵使得产苷周期延长36~40 h,菌体量增加29.6%,单罐产量增加298.4 g,糖苷转化率提高8.8%。通过膜透析使副产物乙偶姻的产量降低,更多的碳源流向腺苷合成途径。在发酵52 h时检测透析发酵中磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)转酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶酶活力,相比于正常发酵工艺均有所提高。得出通过膜偶联间歇透析发酵法生产腺苷能有效解除发酵液内产物的反馈抑制作用,降低副产物的质量浓度,延长发酵周期,有效提高发酵液的菌体量、腺苷产量和糖苷转化率。

金属离子及生长因子对核黄素发酵影响的研究

为提高发酵法生产核黄素的产量,解决发酵培养基中原料消耗高,发酵时间长等问题,该研究对枯草芽孢杆菌生产核黄素的培养基进行了优化。通过单因素试验、正交试验、5 L发酵罐过程控制,以菌体生物量、核黄素产量、糖酸转化率及副产物有机酸含量为指标,确定了发酵生产核黄素金属离子及生长因子的添加量,即:CuSO_(4)·5H_(2)O_(4)g/L,FeSO_(4)·7H_(2)O 10.2 g/L,ZnSO_(4)6.2 g/L,磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)4.2 g/L和维生素H 6.2 g/L,同时确定使用持续流加生长因子的策略。最终实验组菌体生物量(OD_(600)值)达到了256.1,较未优化前提高了29.1%,核黄素最终产量为23.1 g/L,较未优化前提高了53.0%,糖酸转化率达到12%,同时减少了有机酸的生成量。研究结果显示,优化后的培养基显著提高了核黄素的产量以及糖酸转换率,实现了降本增效的目的。

代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸

为获得1株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入已解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确定了莽草酸途径各步反应酶的最适表达强度,最后通过增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸供应,获得了1株性能最佳的L-苯丙氨酸工程菌株PHE12。利用该菌株进行摇瓶发酵24 h,L-苯丙氨酸产量达20.5 g/L。利用发酵罐分批补料发酵48 h后,L-苯丙氨酸产量达81.8 g/L,与目前文献报道的最高产量相比产量提高了12.2%,生产强度和糖酸转化率(葡萄糖计)分别为1.7 g/(L·h)和0.24 g/g,工业前景良好。

代谢工程改造大肠杆菌合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

通过比对筛选,从Micromonospora sp.CNB394中获得高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,随后利用规律成簇的间隔短回文重复-associated protein 9基因编辑方法,通过强化L-脯氨酸合成途径和引入高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,构建1株以葡萄糖为碳源合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌基因工程菌HYP15。摇瓶发酵30 h,工程菌的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到13.6 g/L。5 L发酵罐分批补料发酵40 h,反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到48.6 g/L,糖酸转化率和平均生产强度分别达到21.6%和1.22 g/(L h),具有良好的工业应用前景。

玉米小分子肽在赖氨酸发酵中应用探究及工艺优化

为了降低赖氨酸发酵生产过程中“三废”的排放,减少成分复杂的玉米浆对发酵液的影响,提高分离提取良品率,该研究优化了L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌LS260的发酵条件,通过氮源分析,采用近似等效替代法,使用玉米小分子肽替代玉米浆,通过5 L生物反应器发酵试验探究清洁发酵工艺的可行性,通过单因素试验、响应面优化试验进一步优化了培养基营养成分,结合营养适量流加发酵控制工艺,确定了最适合LS260的发酵条件。结果显示,通过氮源等效替代试验,赖氨酸产量为124 g/L,转化率提高至71.5%;通过营养适量流加工艺将产量提高至136 g/L,发酵上清液透光率提高至84.4%;由单因素试验、响应面法优化试验可知,生物素、KH_(2)PO_(4)的最适添加量分别为3.2 mg/L、4.11 g/L,最适接种量为25.49%。在试验所得的最适条件下,赖氨酸产量达到160.3 g/L,转化率达到71.5%。结果显示,最终产量和转化率与模型数值基本相符,发酵液上清液透明度大幅降低,为提取工艺进一步优化创造了条件,试验结果具有较好的工业应用前景。