鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H_(2)S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H_(2)S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强。小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD_(50)(2.479×10^(4)cfu)相比,A29Δcrp的LD_(50)(5.379×10^(5) cfu)和A29Δhfq的LD_(50)(5.012×106 cfu)均明显上升。各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小。本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据。

不同禽源副鸡禽杆菌的人工交叉致病试验

为探讨鸡源和鹅源副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)对鸡、鹅的跨禽种感染致病力情况,试验将3株鹅源Apg和4株鸡源Apg培养物经鼻窦腔接种60日龄鸡和鹅,观察接种禽的临床症状并进行表征评分。通过组织病理学检查、细菌分离培养和Apg种特异性PCR鉴定,研究鸡源和鹅源Apg对不同宿主的致病性情况。结果显示:鸡源和鹅源Apg均可导致鸡、鹅出现典型症状与病变,且对原宿主禽种致病性高于非原宿主禽种;发病鸡、鹅的病理变化相似,以面部皮下和鼻窦黏膜水肿、充血出血、纤维素性渗出,鼻甲骨变形为特征;发病鹅和鸡组织病理变化相似,鼻窦黏膜与鼻甲黏膜出现大量炎性细胞浸润,黏膜上皮水肿、坏死、崩解脱落,固有层结构疏松,局部可见纤维结缔组织增生;3株鸡源Apg接种鸡试验组能从鼻窦部、肝脏和脾脏中重新分离到接种菌,而接种鹅试验组仅从鼻窦部分离接种菌,未能从其他组织中分离到。研究表明,鸡源和鹅源Apg均可感染鸡或鹅并引起发病,但在致病程度上以本禽源菌株强于非本禽源菌株。

广东鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、耐药表型和耐药基因的检测及相关性分析

为了解广东地区鹅源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行情况、药物敏感性、耐药基因的携带情况以及耐药表型与耐药基因的相关性,本实验对2019年~2022年从广东地区采集的193份疑似感染Pm病鹅的心脏血液和肝脏组织划线接种于不同的培养基分离细菌,对分离菌纯化后采用PCR扩增分离菌的KMT1基因并测序,采用多重PCR扩增分离菌的5个荚膜基因及8个脂多糖基因,分析分离菌的荚膜分型与脂多糖(LPS)分型。结果显示分离到83株鹅源Pm,其中82株为荚膜A型,1株无法通过荚膜定型;LPS分型为L1型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌的药物敏感性;通过PCR检测分离菌7类药物的15种耐药基因,包括β-内酰胺类(bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、bla_(OXA))、氨基糖苷类(aadA1、aph(3’)Ila)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、酰胺醇类(floR)、四环素类(tetM、tetX)、大环内酯类(ermF、ereD)、磺胺类(sul1、sul3)耐药基因。采用统计学软件SPSS22中的完全随机设计两样本率的卡方检验分析分离菌的耐药表型和相应耐药基因的相关性。药敏试验结果显示,83株鹅源Pm对多种药物敏感性较高,其中对喹诺酮类的环丙沙星和氧氟沙星、氨基糖苷类的丁胺卡那和大观霉素、β-内酰胺类的头孢曲松、磺胺类的复方新诺明、大环内酯类的阿奇霉素敏感的菌株占比均在63%以上;对氨基糖苷类的链霉素和卡那霉素耐药的菌株占比高于50%,对氨基糖苷类的新霉素和四环素类的四环素耐药的菌株分别占49.40%(41/83)和46.99%(39/83)。耐药基因的检测结果显示,分离菌检出耐药基因qnrB、sul3、blaTEM、aadA1、aph(3’)Ila、ereD、ermF、tetM、floR,检出率分别为9.63%(8/94)、27.71%(23/83)、28.92%(24/83)、48.19%(40/83)、14.46%(12/83)、49.40%(41/83)、3.61%(3/83)、1.20%(1/83)、32.53%(27/83),未检出耐药基因qnrA、qnrS、sul1、tetX、bla_(CTX-M)、bla_(OXA)。相关性分析结果显示,aadA1基因与Pm对新霉素、链霉素、卡那霉素、大观霉素的耐药性具有极显著的相关性(P<0.001);bla_(CTX-M)基因、floR基因分别与Pm对头孢拉定、氟苯尼考的耐药性具有显著相关性(P<0.05)。上述结果表明,广东地区鹅源Pm主要为A∶L1基因型,对多种药物敏感,耐药基因携带率不高,部分药物的耐药表型与耐药基因具有相关性。本研究为广东地区鹅源Pm病的监测和防治提供参考依据,为Pm耐药机制的研究奠定基础。

鹅源副鸡禽杆菌全基因组重测序及比较基因组学分析

为了分析鹅源副鸡禽杆菌(Apg)与鸡源菌株的基因组差异,对3株鹅源Apg和4株鸡源Apg进行全基因重测序及基因组分析。全基因重测序结果显示7株菌株基因组片段大小为2.567 832~2.607 127 Mb, GC含量介于40.80%~40.93%之间。SNPs同源性分析结果显示,3株鹅源菌株和鸡源C-AP3株聚集在p4chr1株的小分支上,另外3株鸡源菌株分布在其它国内菌株分支上。基因同源性分析结果显示鹅源菌株特有基因76个,鸡源菌株特有基因37个。对鹅适应性基因的筛查共聚类出79个基因,其中编码已知蛋白的基因有22个,其余编码假定蛋白;对鸡适应性基因的筛查聚类出39个基因,其中10个编码已知蛋白,29个编码假定基因。通过比较基因组学发现与Apg宿主适应性有关的基因为118个,为进一步阐释Apg跨物种感染的分子生物学机制奠定了基础。

18型鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定广东梅州市某养殖场病死鹅的发病原因及病原特征,本研究采集其肝脏、心脏等组织样品,经TSA血清平板培养后观察菌落形态、生化试验、PCR鉴定、血清型鉴定,确定该分离菌为血清18型鸭疫里默氏杆菌(RA-18);对分离菌进行药敏试验、毒力基因检测及马岗鹅的致病性试验;结果显示,分离菌对阿莫西林、头孢拉定、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢曲松、大观霉素、氟苯尼考、多西环素、氧氟沙星敏感;对青霉素、新霉素、丁胺卡那、卡那霉素、庆大霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、复方新诺明、多粘菌素B耐药;共检出6种毒力基因(Fur、lux E、tct R、luxr1、cwa H、lipid A);以实际接种量5×10^(5)cfu/m L的分离菌经肌肉注射感染马岗鹅,结果显示未引起马岗鹅的死亡;以实际接种量5×10^(8)cfu/m L的分离菌分别经肌肉、脚蹼注射和滴鼻感染白鸭和白鹅,在感染后7 d的观察期内观察动物的临床症状及剖检,无菌采集各组动物的脑组织、心脏、肝脏、脾脏,经相应处理后涂板,采用平板计数法测定各脏器的载菌量。结果显示,白鹅肌肉、白鹅脚蹼、白鸭肌肉接种感染可导致鹅、鸭的发病及死亡,滴鼻接种未能引起鹅、鸭死亡;对各组白鹅、白鸭的各脏器进行平板计数,结果显示各组的各种动物的心脏、肝脏、脑组织、脾脏均可测得一定的菌量。肌肉注射组动物的组织病理学观察结果显示,分离菌感染白鸭及白鹅的病理变化涉及脑组织、心脏、肝脏、脾脏等。结果表明,本研究首次在国内分离到RA-18菌株,该菌株对白鸭和白鹅具有一定的致病性,对广东地区鹅源鸭疫里默氏杆菌病(RAI)的诊断和防治有一定的参考意义。

鹅源副鸡禽杆菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】了解广东地区鹅源副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)的生物学特性及其与国内外Apg菌株的差异。【方法】于2019年12月―2022年1月从广东地区采集疑似鹅传染性鼻炎病例,通过特异性PCR扩增、细菌分离纯化及16S rRNA基因测序鉴定后进行比对并构建系统进化树,确定分离菌株种类并对其进行药敏试验和动物回归试验。【结果】本试验共分离鉴定获得3株鹅源Apg,分别命名为G-AP1、G-AP2、G-AP3,均属于NAD依赖型菌株。分离菌株发酵葡萄糖、蔗糖产酸不产气,氧化酶试验阳性。系统进化树结果显示,3株分离菌株血清型均为A型且亲缘关系较近,与国内大部分分离株亲缘关系较近,与国外分离株亲缘关系较远。分离菌株接种试验鹅,24 h后鹅出现面部肿胀与流鼻液,48 h后挤压肿胀部位可见乳白色絮状的黏稠鼻液流出,剖检病鹅可见肿胀部皮下和鼻窦、鼻甲黏膜水肿、出血、纤维性渗出,鼻窦腔蓄积干酪样渗出物。药敏试验结果表明,头孢噻呋、头孢噻诺、阿米卡星、喹诺酮类药物、氟苯尼考和克林霉素对3株分离菌株具有较强的体外生长抑制作用。【结论】本试验成功分离3株鹅源Apg菌株,可引起鹅群感染发病且具有传染性,研究结果为广东地区防治鹅传染性鼻炎提供了参考依据。

三株鹅源坦布苏病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东地区鹅源坦布苏病毒流行情况,研究对自2020年6月至2021年6月从广东地区疑似坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)感染鹅的组织病料进行TMUV分离鉴定。结果显示:共分离出3株鹅源TMUV,可感染BHK-21细胞并导致细胞病变;3株分离株核苷酸相似性为99.2%~99.7%,与Cluster2.1参考株基因同源性最高,为95.9%~99.3%,与Cluster2.2参考毒株同源性相对较低,为95.0%~96.4%;全基因组遗传进化分析和E蛋白氨基酸序列分析结果表明,3株鹅源分离株均位于Cluster2.1,其中Goose/GD/939/2021和Goose/GD/1025/2021 E蛋白氨基酸序列与其他毒株E蛋白相比多个位点存在差异。研究表明,从广东地区分离的3株鹅源TMUV均位于Cluster2.1,为进一步研究广东地区鹅源TMUV流行、进化及相关疾病的防控奠定基础。

鹅源经典番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)近年来在维鹅中的分离率增加,造成了一定的经济损失。本研究从临床上表现出跛行、肝脏和脾脏出现白色点状坏死的雏鹅中采集肝脏和脾脏,采用PCR方法进行MDRV鉴定,对阳性病料经番鸭胚和鹅胚进行病毒分离,并对分离株进行鉴定和σC蛋白基因测序,将分离株对维鹅和雏番鸭进行致病性试验。流行病学调查结果显示:疑似感染MDRV维鹅的病毒阳性率为18.7%,病毒分离率为33%;禽胚分离结果显示,成功分离获得1株鹅源MDRV,命名为846-Goose-CHN-2020株,接种禽胚后,禽胚死亡时间在2~10d;846-Goose-CHN-2020株经禽胚传至第5代时死胚率下降;遗传进化结果显示:846-Goose-CHN-2020株与鸭源MDRV相似为91%~97.2%,与鹅源MDRV(GRV-GD2020)相似为99.8%;致病性结果显示,846-Goose-CHN-2020株对维鹅和维番鸭具有致病性,主要表现为脾脏出现白色坏死点。本研究完善了广东地区鹅源MDRV的流行病学和致病性信息,为鹅源MDRV的研究提供了一定的科学基础。