猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物信息学分析及原核表达

[目的]预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能,并构建AMA1基因的原核表达载体,表达、纯化AMA1蛋白。[方法]本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列,使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1,并将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中,对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化,确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。[结果]生物信息学预测显示,AMA1蛋白由317个氨基酸组成,蛋白分子式为C1 512H2 310N394O490S14,是不稳定的亲水性蛋白;其二级结构α螺旋占17.74%,β折叠占30.65%,转角占30.65%,无规则卷曲占20.96%;属于无信号肽的跨膜蛋白,具有5个B细胞抗原表位。成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒,经诱导表达条件优化后,确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下于28℃诱导12 h,主要以可溶性蛋白形式存在,蛋白相对分子质量约为25 800,纯化蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。[结论]阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征,通过原核诱导表达获得了重组蛋白,为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础,并为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及黄羽肉鸡发病模型的建立

为筛选鸡源G型产气荚膜梭菌(Cp)强毒菌株并建立黄羽肉鸡坏死性肠炎(NE)的发病模型,本研究从国内不同地区采集292份鸡肠道及粪便样品,其中健康鸡样品154份,疑似患NE鸡样品138份,经TSC-卵黄平板分离及16S rRNA基因的PCR扩增及测序鉴定,采用多重PCR扩增分离Cp的毒素基因(α、β、ε、ι毒素、肠毒素和坏死性肠炎毒素B(NetB),以确定分离株的毒素分型。结果显示,共获得86株Cp,其中3株从健康鸡样品中获得,83株从患病鸡样品中获得。毒素分型的PCR结果显示,分别出现约900 bp(α毒素)、550 bp(β毒素)、738 bp(NetB毒素)的目的条带;未扩增到ε毒素、ι毒素及肠毒素(506 bp);经统计后结果显示,18株Cp为A型(20.39%),12株为C型(13.95%),56株为G型(65.12%)。选择其中10株生长较好的G型Cp,通过腹腔注射0.2 mL(1×10^(9)cfu/mL)感染小鼠以评估其致病性,结果显示G型Cp分离株CpZZ2、CpDYC1和CpZD1的致病性均较强。将一日龄黄羽肉鸡分成8组,1组~6组为实验组,7组为球虫对照,8组为阴性对照,相应组别黄羽肉鸡于10日龄时经口灌服感染巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊,13日龄更换为高蛋白饲料,14日龄分别经口灌服感染G型Cp CpZZ2和CpDYC1株,其中两组鸡连续3 d感染上述两株G型Cp,以构建鸡NE发病模型。在17 d的观察期内统计各组肉鸡的存活率、相对增重率。同时剖杀所有鸡,根据肠道病变评分标准评价各组鸡的肠道病变,筛选致鸡NE的最佳组合。结果显示,通过上述标准判定使用巨型艾美耳球虫(1×10^(9)个孢子化卵囊)+高蛋白饲料(蛋白含量35%)+梭菌(CpZZ2)组的鸡急性NE发病模型成功构建,该组鸡因NE引起的死亡率可达50%,剖检后该组鸡肠道出现充气增粗、肠道内容物为红褐色豆腐渣样物等NE典型病变,而高蛋白饲料+Cp(CpZZ2)组及连续感染Cp组鸡虽不致死鸡,但该两组鸡小肠肠道也出现NE相关病变,可能为亚临床感染,其余各组鸡均无死亡和明显临床症状。本研究从临床分离并筛选的G型Cp强毒菌株,联合球虫感染和高蛋白饲料,诱发了黄羽肉鸡的NE,建立了黄羽肉鸡NE的发病模型,为进一步研究我国黄羽肉鸡NE的发病机制及疫苗研发奠定了基础。

我国部分地区黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染情况调查

为了解我国黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染情况,研究从16个省份的规模化黄羽肉鸡场收集不同日龄鸡粪便样品共696份,使用基于鸡球虫序列特征扩增区(SCAR)标记筛选基因的布氏艾美耳球虫特异性引物及探针,采用荧光定量PCR进行检测和鉴定。结果显示,布氏艾美耳球虫的总感染率为34.20%,16个省(市、区)养鸡场均存在布氏艾美耳球虫感染,且不同地区感染率差异显著(P<0.05)。不同日龄鸡群布氏艾美耳球虫的感染率差异不显著(P>0.05),40日龄以上鸡群感染率相对较高;双层平养模式鸡群感染率明显高于单层平养的鸡群。研究结果提示,目前我国各地区黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染率较高,不同地区间总体感染率差异显著,不同日龄黄羽肉鸡群的感染率差异不显著,应在养殖过程中全程防控,且对双层平养鸡群进一步加强防控措施。

1日龄雏鸡喷淋免疫球虫病疫苗与未免疫鸡群混养后的群体免疫效果研究

为研究球虫病疫苗喷淋免疫接种1日龄雏鸡的免疫效果以及混入少量未免疫鸡后的群体免疫效果,试验采用喷淋免疫方式对1日龄麻黄鸡进行鸡球虫病四价活疫苗免疫接种(喷淋免疫组),混入10%的未免疫鸡(混养免疫组)标记后与喷淋免疫组进行地面平养混养,并设不免疫不攻虫的空白对照组和不免疫仅攻虫的阳性对照组。喷淋免疫组、混养免疫组经垫料中球虫生活史循环的自然首免、二免、三免后和阳性对照组于32日龄时分别进行混合强毒虫株53万/只(含堆型13万、柔嫩17万、巨型23万)和毒害强毒虫株12万/只攻虫。检测各组免疫后的卵囊产量、卵囊检出率和疫苗反应以及攻虫后的增重和肠道病变计分情况。结果显示,喷淋免疫组免疫后第6~8天的卵囊检出率为80%~95%;经自然二免循环后,喷淋免疫组和混养免疫组的卵囊检出率均达到100%,排卵高峰期和卵囊产量趋于同步,喷淋免疫组平均肠道病变记分在0~0.1。攻虫后,喷淋免疫组(攻混合强毒虫株的为85.8%、攻毒害强毒虫株的为99.5%)和混养免疫组(99.9%、101.7%)的相对增重率远高于阳性对照组(9.6%、32.2%)。喷淋免疫组混合强毒株攻虫后十二指肠、盲肠及毒害强毒株攻虫后的小肠中段肠道病变记分显著低于阳性对照组(P<0.05)。以上结果表明,1日龄雏鸡喷淋接种球虫疫苗可建立良好的免疫保护,掺入10%未免疫的鸡也能通过自然循环建立足够的免疫保护力。

环丙氨嗪和甲基吡啶磷在猪场联合灭蝇的效果评估

为了探索猪场灭蝇的有效手段,完善猪场生物安全体系,本试验选取某规模化猪场8栋猪舍,饲喂环丙氨嗪以控制粪便中家蝇幼虫孳生,在猪舍内喷雾和撒布甲基吡啶磷以杀灭成蝇。分析和比较用药前、后家蝇幼虫的发育情况和死亡率,以及家蝇成虫的密度,以评估2种药物在猪场联合使用的灭蝇效果。结果显示,给猪饲喂环丙氨嗪前(第1、4天)所采集粪便中的家蝇幼虫发育过程完整,死亡率较低,分别为32.7%和12.3%,用药后(第7、10、13、16、19、21天),所采集粪便中的幼虫发育停滞,死亡率均达100%;甲基吡啶磷喷雾用药5 d后,家蝇平均密度为1.88只/(张·时),与不用药对照[平均密度2.72只/(张·时)]相比下降了30.98%;改用撒药5 d后,家蝇平均密度为0.11只/(张·时),与喷雾用药相比下降了94.12%。结果表明,环丙氨嗪和甲基吡啶磷联合使用的灭蝇方案起到良好的效果。

3种兔艾美耳球虫rDNA ITS序列测定与系统进化分析

为研究内转间隔区(ITS)序列能否作为鉴别不同种兔球虫的分子标记,本试验以兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫为研究对象,对其核糖体DNA(rDNA)ITS全序列进行PCR扩增,扩增产物纯化后连接至pGEM-T Easy载体上,重组质粒通过菌液PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中公布的兔球虫ITS序列进行同源性比对,用Mega 5.0绘制系统进化树。结果显示,兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫ITS序列长度分别为1065、1009和1047bp,与GenBank公布的同种球虫相应序列同源性分别为99.2%、99.0%和94.5%,与其他种球虫序列的同源性为55.3%~82.1%。系统进化树显示兔球虫ITS序列形成单系群,该单系群又根据卵囊外残体的有无分为2个亚群。研究结果表明ITS序列种内同源性高于种间同源性,可作为3种兔球虫种间鉴定的分子标记。

鸡球虫病弱毒疫苗的免疫机理及研究进展

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种危害性极其严重的寄生原虫病,呈世界性分布,是最主要的鸡病之一。目前主要用抗球虫药物对其进行防制,但随着耐药虫株的产生和药物残留对肉禽品质及人体健康的影响等问题的出现,对鸡球虫活疫苗的研究成为研究热点。作者对鸡球虫弱毒疫苗的免疫机理及其鸡胚传代致弱方法、理化致弱方法和早熟选育致弱法的研究进展作一概述,并对鸡球虫弱毒疫苗的应用前景进行了展望。

检测鸡球虫四价弱毒疫苗抗体应答的ELISA方法的建立及初步应用

本研究旨在建立检测鸡球虫四价弱毒疫苗(柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫)抗体应答的酶联免疫吸附试验(ELISA),并初步阐明鸡免疫四价弱毒疫苗及攻虫后的抗体应答。将300羽岭南黄鸡分为A(免疫攻虫组)、B(不免疫不攻虫组)、C(不免疫攻虫组)共3个组。A组雏鸡在4日龄时进行首免,11日龄时鸡开始二免,二免完成后(17日龄时)对A组及C组的鸡进行攻虫(28万个4种球虫的混合卵囊/羽),7d后检查A、C两组鸡的存活率。在鸡二免和三免完成后,分别对A、B组进行采血,通过优化最佳抗原包被浓度、酶结合物工作浓度及最佳血清稀释度,建立了ELISA方法来检测鸡体对球虫四价弱毒疫苗的抗体应答情况。A组鸡血清抗体的平均D值为0.870和0.904,明显高于B组鸡的平均D值0.261和0.270,证明了鸡体免疫疫苗后可以刺激产生相应抗体。免疫鸡攻虫后的存活率和抗体应答的检测结果,都充分说明了此鸡球虫弱毒四价疫苗具有良好的免疫原性,所建立的ELISA方法为今后评价鸡球虫弱毒四价疫苗的免疫效力提供了有效手段。

5株堆型艾美耳球虫顶质体rpoB基因的扩增及序列分析

以5株堆型艾美耳球虫为研究对象,对其顶质体rpoB基因的部分序列进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上发表的柔嫩艾美耳球虫及其他顶复门寄生虫相关序列进行比较,研究顶质体的遗传变异情况。结果表明,从堆型艾美耳球虫不同来源虫株均获得了469bp的目的片段,应用DNAStar软件进行序列对比发现,5株堆型艾美耳球虫的顶质体rpoB序列完全一致,与柔嫩艾美耳球虫相应序列的相似性为92.75%,而与刚地弓形虫和疟原虫的相似性分别为67.23%和64.62%。首次报道了堆型艾美耳球虫rpoB序列,显示rpoB基因序列保守,不同来源堆型艾美耳球虫虫株的序列没有差异,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P<0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。

钝缘蜱在非洲猪瘟传播中的作用及其防控

2018年8月1日,我国首次在沈阳发现非洲猪瘟(ASF)疫情,继而该病来势汹汹,截至2018年9月24日,我国辽宁、河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林先后发生疫情,因此研究其主要传播方式及传播媒介对于目前防控非洲猪瘟疫情刻不容缓。文章主要通过探讨我国非洲猪瘟病毒(ASFV)的自然宿主和储存宿主钝缘蜱的生物学特性、流行病学特点、在国内的区域分布及对蜱的防控等,从生物媒介角度对非洲猪瘟的防控提供参考依据。

猪等孢球虫病的研究进展

猪等孢球虫病是由等孢球虫寄生于猪小肠上皮细胞而引起的一种原虫病，呈世界性分布，在集约化猪场的仔猪群中广泛流行。本病在预防和治疗用药方面的成本较高，每年可高达1亿美元以上，给养猪业造成严重的经济损失。据调查，德国、奥地利、瑞士等国大部分猪场都流行过本病，其场阳性率93．5例，翁亚彪等在2000-2002年对广东猪场寄生虫感染情况的调查结果显示，猪球虫感染率高达24．9％；杨光友等对四川猪球虫病的调查结果表明，猪等孢球虫阳性场占87．50％，总感染率为18．72％。本文综述了猪等孢球虫病的病原生物学特性、形态特征和生活史、流行病学特点、临床症状和病理变化、诊断与防治等方面的研究进展，为有效防治本病提供依椐．

猪场虫害在非洲猪瘟传播中的风险和防控

自2018年8月中国辽宁首次暴发了非洲猪瘟(ASF),疫病的蔓延给我国养猪企业带来了巨大的经济损失。媒介生物传播是非洲猪瘟的传播途径之一,其中钝缘蜱作为生物性传播媒介研究较多,是ASF病毒在疫源地传播、长期保存甚至发生变异的关键因素,也是ASF在很多地区和国家久控不绝的原因之一。然而,仍有潜在的ASF机械性传播媒介生物需深入研究,例如吸血蝇可通过叮咬或猪误食来传播ASF等。文章分析了猪场主要虫害在非洲猪瘟传播中的风险,以便为优化现有预防措施、全面防控疫病提供科学依据,降低ASF传播对家猪的风险。

疫苗与药物预防肉鸡球虫病对比试验

肉鸡球虫病分布极广，发生普遍。其中，15～50日龄的雏鸡发病率最高，危害最为严重，除引起死亡外，耐过鸡生长缓慢，发育不良，多为带虫者，对养鸡生产危害极大。该病药物防治费用占肉鸡总药费开支的20％～25％，是单一病种中防治费最多的疾病。因此，受到畜牧兽医工作者的高度重视。目前，鸡球虫病的防治措施有两种，即药物防治和免疫预防。药物防治是采取在肉鸡饲养的饲料中全程添加抗球虫药作预防，但由于抗球虫药的长期连续使用，球虫容易对药物产生耐药性，导致药效下降甚至完全失效，肉鸡发生球虫病后需要马上投药治疗，以减少发病和死亡损失。免疫预防则是在雏鸡4～6天龄时接种球虫活疫苗，疫苗虫株在鸡肠黏膜上进行为期4～6天的内生性发育，刺激机体形成基础抗球虫免疫力，并随粪便排出后代卵囊。这些卵囊在垫料中孢子化后，部分卵囊被鸡啄食，起到加强免疫的作用，如此重复感染2～3次后，机体形成坚强的抗球虫免疫力。免疫预防与药物防治相比，由于不存在耐药性问题，效果更有保证；不产生药物残留，可保障食品安全，因此，肉鸡球虫病的免疫预防控制方案越来越受人们青睐。但是，在抗球虫免疫力建立期间，疫苗虫株需要在肠黏膜上生长发育，人们担心其影响肉鸡生产性能，为了解肉鸡生产上应用球虫疫苗的效果及其对生产性能的影响，特此进行对比试验，以便为球虫疫苗在肉鸡生产上的广泛应用提供依据。

集约化猪场成蚊种群构成调查初报

蚊虫不仅叮刺、吸血，骚扰畜禽休息，引起皮炎、斑疹等，还能传播流行性乙型脑炎、疟疾、黄热病等多种疾病，被称为猪场“三害”之一。蚊虫密度监测是集约化猪场蚊媒传染病防制和流行病学监测的重要内容，一直以来未见有关养殖场蚊虫密度监测及其种群构成的研究报道。为了解集约化猪场蚊虫密度及种群构成，笔者于2006年9月至2007年1月对广东省东莞市某集约化猪场蚊虫密度及种群构成进行了初步调查。

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究Et-MIC3基因遗传变异情况。结果获得2976bp的目的片段,各株与FJ374765.1CDs的序列相似性在99.8%～99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%～100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%～99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。

3株柔嫩艾美耳球虫28S rRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28SrRNA基因部分序列,并与GenBankTM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172bp的28SrRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBankTM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28SrRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。

鸡球虫病活疫苗不同卵囊计数方法的比较

为了解鸡球虫活疫苗不同卵囊计数方法对检测结果的影响,分别采用血细胞计数板4角方格法和9方格法以及麦氏计数板法对3种鸡球虫活疫苗各进行了6次卵囊计数,然后采用t检验和Z比分值方法比较筛选出最适宜的计数方法,并对检测方法进行了验证和变异系数统计。结果显示:采用每批检品抽检1瓶,通过血细胞计数板4角方格法重复计数6次,去除最大值和最小值后取平均值作为该瓶检品卵囊计数结果,如果首次检验结果不符合规定可重检一次的方法,人员误差最小。该方法提高了鸡球虫活疫苗卵囊计数结果的可重复性和准确性,增强了疫苗质量控制的可靠性。

兽药GMP信息管理系统的开发与应用

介绍了基于兽药GMP以生产质量管理为核心的兽药GMP信息管理系统的研发背景、系统特点以及其在兽药生产企业的应用情况,并对其在兽药生产企业信息化过程中的意义和前景进行了阐述,以期为兽药生产管理的信息化建设提供参考。

枸橼酸碘溶液对4种病原菌的载体消毒效果研究

通过载体定量试验考察枸橼酸碘溶液的消毒效果,同时选择百胜-30溶液作对照。结果表明,在橡胶片载体、室温条件下(20℃左右),枸橼酸碘溶液按1∶500稀释、作用5 min对大肠杆菌杀灭率达99.90%以上;按1∶1000稀释、作用5 min对金黄色葡萄球菌即可起到杀菌作用;按1∶1200稀释,最低作用10 min,杀菌率才能达标;当稀释倍数为1∶1200、作用30 min对马腺疫链球菌才能达到杀菌效果,当药物浓度提高至1∶800以上时,作用10 min杀菌率即可达到99.90%以上;按1∶10稀释、作用1.5 h对蜡样芽孢杆菌杀灭率才达99.90%以上,当药物浓度提高到1∶8及以上时,作用30 min杀灭率才能达标。与受试消毒剂药物相比,百胜-30溶液对大肠杆菌和马腺疫链球菌的杀灭效果好,对金黄色葡萄球菌起作用时间略晚,对蜡样芽孢杆菌的杀灭效果不如枸橼酸碘溶液。两种消毒剂对不同病原菌的载体消毒效果不同。