锦鸡儿属植物根瘤菌生物地理分布研究进展

锦鸡儿属植物生长于干旱、半干旱的荒漠地区,具有防风固沙、水土保持、防止生态系统功能退化等重要作用.根瘤菌的共生固氮作用可为锦鸡儿植物提供充足的氮素营养来促进生长.本文简要叙述了锦鸡儿属植物根瘤菌的发现、地理分布、遗传多样性的研究进展,可为贫瘠的荒漠地区根瘤菌菌剂的应用实践提供重要参考价值.

蓖麻耐盐基因RcKUP 7克隆及分子特征分析

本试验以蓖麻叶片为材料,克隆K+吸收蛋白基因Rc KUP 7,并对其进行生物信息学分析.结果显示,Rc KUP 7基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为2583 bp,编码860个氨基酸,蛋白分子量为95.149k D,p I值5.15.通过氨基酸组分分析得到含量最高的是亮氨酸(Leu),占该蛋白总摩尔质量的11.74%和分子质量的11.96%;含量最低的氨基酸为色氨酸(Trp),其摩尔质量与分子质量分别占总蛋白的1.16%和1.84%.进行多重序列比对和系统发育树分析可得出与麻枫树、木薯、橡胶树亲缘性较近.通过保守区蛋白分析可以得出该蛋白为钾离子转运蛋白家族的一员.通过亲水疏水性分析,可知该蛋白为疏水性蛋白.跨膜结构分析显示该蛋白具有10个蛋白跨膜结构,是典型的跨膜蛋白,并预测了该蛋白的三级结构.

蓖麻环核苷酸门控离子通道RcCNGC2克隆与盐胁迫下表达分析

为探讨RcCNGC2在蓖麻耐盐中的作用,以通蓖5号叶片为材料,克隆获得环核苷酸门控离子通道RcCNGC2完整编码区序列(CDS),并对该序列进行序列比对、蛋白结构分析,构建多元表达载体,分析了在盐胁迫下蓖麻RcCNGC2基因根、茎、叶组织中6个时间点的表达量变化。结果显示,RcCNGC2 CDS长度为2148 bp,编码715个氨基酸,蛋白分子量为34.15 ku,等电点为9.96,存在5个跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCNGC2与橡胶树一致性最高,达89.15%。qRT-PCR分析结果显示,NaCl处理后RcCNGC2表达量在根中上调且差异显著,在茎、叶中随NaCl处理时间延长而显著减少。综上,RcCNGC2在蓖麻受到盐胁迫时起重要信号传导作用。

蓖麻液泡膜质子泵RcVP1基因克隆与表达分析

为挖掘耐盐基因,培育耐盐蓖麻新种质,本研究设计特异性引物克隆蓖麻液泡膜H+-PPase基因,将其命名为Rc VP1,该基因开放阅读框为2 304 bp,编码767个氨基酸,其编码蛋白质的分子量和等电点分别为8.04×104和4.94。Rc VP1含有保守的H+-PPase结构域,包括CS1、CS2、CS3高度保守区,有13个跨膜结构域。多重序列比对结果表明Rc VP1氨基酸序列与毛白杨的相似性最高,达95.00%,与Ⅰ型H+-PPase拟南芥AVP1的相似性高达88.53%,与Ⅱ型H+-PPase拟南芥AVP2的相似性只有36.41%,属于Ⅰ型液泡膜H+-PPase跨膜蛋白质。半定量PCR分析结果表明,该基因在蓖麻叶片、茎中受盐胁迫诱导上调表达,在种子中抑制表达。

蓖麻RcHSF基因家族鉴定与冷胁迫下的表达模式分析

为明确蓖麻HSF基因家族的结构特征与冷胁迫下的表达模式,利用序列比对法实现蓖麻HSF基因家族成员的全基因组鉴定,通过生物信息学手段对基因家族成员的序列结构、理化性质、染色体定位、启动子顺式作用元件、蛋白保守结构域、系统进化关系以及聚类方式进行分析,并结合RNA-Seq与qRT-PCR对RcHSFs的表达水平进行验证。结果表明,蓖麻基因组中含有19个RcHSF基因家族成员;基因分析发现RcHSFs分别含有1~3个外显子,定位在17个染色体片段上且呈不均匀分布,其中大多数RcHSFs均含有AAGAA-motif、MYB与MYC元件,暗示其响应植物激素与逆境胁迫;蛋白分析表明,RcHSFs按照基序类型与排布方式被聚为A、B、C 3类,推测不同类型HSF的蛋白功能存在差异,尽管所有成员均存在不同程度的motif缺失,但结构域高度保守;RNA-Seq分析发现仅RcHSF4与RcHSF10受冷胁迫诱导表达,与qRT-PCR验证结果一致。结果为RcHSFs基因的克隆与功能研究提供重要的理论基础,为蓖麻抗冷新种质资源的建立提供候选基因。

蓖麻RcPIPs基因家族的鉴定与生物信息学分析

PIP基因家族是AQP基因家族中的一个亚家族,家族基因广泛参与运输水分及其他小分子、响应各种非生物胁迫、参与植物的开花与生长、气孔活动、种子萌发。本研究主要以蓖麻(大戟科)为材料,基于蓖麻基因组数据库,进行蓖麻PIP基因家族筛选及生物信息学分析。结果表明,共筛选出10个PIP基因成员,且不同蛋白质序列和特性都存在较大差异;基因结构分析结果表明,除了RcPIP10具有3个外显子,其余的都具有4个外显子,motif 1、motif 2、motif 5、motif 8是蓖麻PIP基因的特征基序;系统进化树结果表明,RcPIPs基因分成2个亚族且每个亚族均有5个基因,其中有2对基因在进化关系上成对出现,表现出较高的同源性;跨膜结构预测结果表明,蛋白RcPIP1~RcPIP9均有6个跨膜结构域,而RcPIP10仅有4个跨膜结构域,证实蓖麻家族PIPs大部分具有MIP超家族典型的跨膜螺旋特征;基因定位显示,10个基因不均匀的分布到9条染色体上,有8条染色体各分布1个RcPIP基因,仅有1条染色体分布2个RcPIPs基因。本研究结果不仅为大戟科植物和其他植物的PIP基因的功能分析和利用提供了有价值的信息,而且为基因家族扩展和进化研究提供了有益的参考。

蓖麻质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(RcSOS1)克隆及表达载体构建

根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到RcSOS1(NCBI注册号:KX943304.1)基因序列,开放阅读框包含3 432个核苷酸,推导编码的蛋白质有1 143个氨基酸残基组成,与麻疯树SOS1基因的同源性最高,达到了80.4%,编码一种Na^+/H^+逆向转运蛋白。疏水性分析显示RcSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。RcSOS1蛋白二级结构以α-螺旋,无规则卷曲为主,其次为延伸链和β-转角,所占比例最少。三级结构分析表明,RcSOS1蛋白是位于质膜上的Na^+/H^+逆向转运蛋白。根据RcSOS1全长序列设计带有Bam HⅠ和SalⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切后与表达载体p CG-1301连接,成功构建了RcSOS1基因的正义表达载体,为深入研究RcSOS1基因的功能及耐盐的调控作用提供了帮助。

两个蓖麻品种萌发期的耐盐性与相关基因响应的差异比较

为比较盐胁迫下两个蓖麻品种通蓖5号和哲蓖3号萌发期耐盐性与盐响应相关基因表达的差异,本试验设置0、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L四个浓度NaCl处理,测定种子吸水变化、萌发各项指标和三个盐响应相关基因的表达量,分析其差异。结果表明:(1)两个品种蓖麻种子正常吸水分为三个阶段,在0～15 h快速增加,15～30 h内缓慢增加,30 h后快速增加。盐处理的通蓖5号在第三阶段吸水骤减,高浓度(100 mmol/L,150 mmol/L) NaCl处理下吸水基本停滞;哲蓖3号在低浓度(50 mmol/L NaCl)处理中仍表现出吸水三阶段特性,随着盐浓度升高才对第三阶段的吸水产生较大的影响。(2)盐胁迫下两个品种种子的发芽率、发芽势、发芽指数等指标均随盐浓度增加呈现逐渐下降的趋势。相同盐浓度处理下哲蓖3号各项指标显著优于通蓖5号,表明哲蓖3号萌发期耐盐性强于通蓖5号。(3)两个蓖麻品种种子中的三个盐响应基因RcSOS3、RcVP1、RcNHX1对盐处理有不同的响应,相同盐浓度处理下在耐盐性强的品种中表达量高。这一结果为蓖麻育种及蓖麻种子萌发期耐盐机制的深入研究提供了参考。

蓖麻耐盐基因HKT的克隆及表达载体构建

为挖掘蓖麻耐盐相关基因,以盐生植物蓖麻(Ricinus communis L.)叶片为材料。设计特异性引物,克隆高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)耐盐基因,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,推测分子量为59.74 kD,等电点(pI)为9.32。多重序列比对和系统发育树分析表明该蛋白与木薯和橡胶树的同源性最高,分别为69.13%和67.03%,且与HKT1蛋白家族成员同源性较高,为S-G-G-G类型蛋白,推测该蛋白为HKT1类蛋白。二级结构预测蓖麻HKT蛋白有9个跨膜结构域,主要定位于内质网上,是典型的跨膜蛋白。根据蓖麻HKT基因序列设计带有Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增出全长基因,用限制性内切酶Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切后与表达载体pCHF-3300连接。本研究成功构建了蓖麻HKT基因的表达载体,为进一步研究该基因的转化及功能验证提供参考。

蓖麻Na^+/H^+逆向转运蛋白基因NhaD克隆与表达载体构建

为发掘耐盐相关基因,以蓖麻叶片为材料,设计特异性引物,克隆蓖麻Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(NhaD),并对该序列进行生物信息学分析。结果表明,NhaD全长1 743 bp,可编码580个氨基酸。将其命名为Rc NhaD。其编码蛋白的分子量为61.821 kD,等电点(pI)值6.74。利用DNAMAN软件对该序列与其它植物氨基酸序列进行同源性比对,结果显示与木薯等植物的同源性在85%以上,该蛋白含有ArsB蛋白的功能域,属于ArsB/NhaD转运蛋白家族成员。对其二级结构分析显示该蛋白为疏水性蛋白,该蛋白具有11个跨膜区域,是典型的跨膜蛋白。根据Rc NhaD全长设计带有KpnⅠ与XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长,用KpnⅠ与XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-1301连接,成功构建了Rc NhaD的表达载体。本研究为进一步研究该基因功能提供指导。

蓖麻CNGC基因家族鉴定与冷胁迫下的表达模式分析

环核苷酸门控通道蛋白(cyclic nucleotide-gated channel proteins,CNGCs)是介导低价阳离子转运的重要蛋白,在植物信号传递、生长发育与非生物胁迫响应等方面发挥重要作用。本研究利用序列比对法在蓖麻基因组水平进行CNGC家族成员鉴定;利用生物信息学手段对蓖麻CNGC家族成员的基因结构、保守基序、特征结构域、聚类方式、顺式作用元件及染色体定位信息进行分析。研究成功鉴定到17个蓖麻CNGC基因家族成员,定位于16个未完整拼接的染色体片段上;除RcCNGC13外,其他蛋白序列均包含高度保守的环核苷酸结合结构域CNBD,但RcCNGC4RcCNGC6RcCNGC13RcCNGC14均存在明显的基序缺失;部分RcCNGCs启动子区均含有MYB、MYC与ABRE、ARE元件,推测其响应逆境胁迫。聚类分析将蓖麻CNGC成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,推测不同类型CNGC蛋白存在功能差异。转录组数据分析发现仅有RcCNGC14受冷胁迫显著上调表达,暗示该基因参与调控蓖麻的冷适应性。本研究首次在蓖麻全基因组水平对CNGC基因家族进行鉴定,并分析其冷胁迫下的表达模式,为进一步创制蓖麻抗冷新种质提供重要的候选基因。

蓖麻RcSEC14p基因的克隆及低温胁迫下的表达分析

Sec14-like蛋白参与细胞的基本生物学过程,如磷脂代谢、膜运输、信号转导及逆境响应。本研究采用RT-PCR的方法在蓖麻叶片中成功克隆了一个磷脂酰肌醇转运蛋白基因RcSEC14p (Accession No.MK205181)。RcSEC14p基因全长包含一个1 752 bp的完整开放阅读框,推测编码583个氨基酸。生物信息分析发现RcSEC14p为不稳定的亲水性蛋白;蛋白质二级结构元件多为α螺旋和无规卷曲。三级结构分析表明RcSEC14p结构内部含有一个潜在的磷脂结合口袋,可能在脂质代谢和磷酸肌醇信号转导等方面发挥重要的作用。多重序列比对表明蓖麻RcSEC14p与麻风树同源蛋白的相似性高达77.03%。系统进化树分析表明RcSEC14p属于Sec-like蛋白家族的SFH亚家族成员,N端包含一个SEC结构域,C端包含一个Nodulin结构域。q RT-PCR分析发现RcSEC14p受冷胁迫下调表达。该基因的下调表达可能会降低蓖麻的抗冷性。该研究为进一步探讨RcSEC14p是否通过调节磷脂信号转导途径参与冷胁迫响应提供依据。

蓖麻RcTIP1;2与RcTIP1;3基因的克隆及低温胁迫下的表达分析

植物水孔蛋白作为水分快速跨膜运输的通道蛋白,在保持细胞内外渗透平衡、调节气孔运动以及参与渗透胁迫应答等方面发挥着重要的作用。本研究以'通蓖5号'叶片为材料,利用RT-PCR的方法成功克隆了两个液泡膜内源水孔蛋白基因的ORFs,将其命名为RcTIP1;2和RcTIP1;3。基因结构分析显示RcTIP1;2和RcTIP1;3均含有3个外显子和2个内含子。生物信息学分析表明2个基因编码的蛋白均含有6个跨膜螺旋以及MIP超家族典型的2个“NPA”保守结构域。多重序列比对发现RcTIP1;2与PtTIP1;2同源性高达84.92%,RcTIP1;3与AtTIP1;3同源性高达79.76%。进化树分析表明2个基因均属于TIP1类亚家族蛋白成员o qRT-PCR分析表明RcTIP1;2与RcTIP1;3基因受冷胁迫均下调表达,该基因的下调表达可能有助于抵抗和延缓冷冻诱导的细胞脱水。进一步对RcTIP1;2与RcTIP1;3调控冷响应的分子机理进行研究,从而为蓖麻分子辅助育种提供重要的理论依据。

山葡萄‘北冰红’VvCOR413-I3基因克隆及表达载体构建

冷响应蛋白(cold regulated proteins, COROs)在植物耐寒方面具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法克隆了山葡萄‘北冰红’VvCOR413-I3基因全长序列(GenBank登录号MG722854),对其进行序列分析,构建其表达载体。结果表明,山葡萄‘北冰红’VvCOR413-I3基因的cDNA完整的开放阅读框序列为573 bp,推测其可编码190个氨基酸;含有冷响应蛋白COR413保守区;存在6个跨膜结构域,属于跨膜蛋白;预测其定位于细胞质膜和液泡膜及高尔基体膜;成功构建了山葡萄‘北冰红’VvCOR413-I3基因的表达载体pCHF-3300-Vv COR413-I3。