加拿大披碱草新品系大小孢子发育与开花习性研究

为揭示加拿大披碱草(Elymus canadensis L.)新品系大、小孢子的发育特点及开花习性,采用石蜡切片法对大、小孢子发育做了解剖研究;在开花期观测开花动态,并采用回归法分析了开花与温湿度的关系。结果表明:加拿大披碱草新品系花粉母细胞减数分裂属于连续型胞质分裂,胚囊发育类型属于单孢子胚囊。在呼和浩特地区加拿大披碱草新品系于每年7月中、下旬开花,开花持续期约为2周,开花第6天达到高峰,盛花期约7 d,开花时间集中于每日下午13:00-18:00时。开花适宜温度为28℃左右,相对湿度为43%左右。

蒙古冰草Lhcb1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

利用同源序列从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)克隆得到1个光合作用叶绿体结合a/b基因,命名为MwLhcb1。MwLhcb1基因cDNA全长1 138bp,包含801bp开放阅读框,编码267个氨基酸,蛋白分子量为28.21kD,等电点4.92。该蛋白二级结构中具有Lhcb基因家族的保守结构域。MwLhcb1蛋白氨基酸序列与其他物种同类蛋白相似性均在87%以上,其中与小麦同类蛋白相似性程度最高达99%。实时荧光定量PCR结果显示,MwLhcb1基因主要在茎叶中表达,在根中表达量极少,干旱胁迫影响MwLhcb1基因表达。该研究结果为进一步研究MwLHcb1在蒙古冰草光合作用与抗旱性中的功能奠定了基础,并从基因遗传进化角度证实了蒙古冰草是小麦野生近缘种的观点,从而提出蒙古冰草是小麦抗性改良的理想基因供体。

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据。结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域。系统进化树分析表明MwDREB3编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近。该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调。

蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。

蒙古冰草基因组类反转录转座子基因同源序列的克隆与序列分析

以蒙古冰草DNA为模板,采用PCR扩增的方法从蒙古冰草（Agropyron mongolicumKeng）中分离得到了一个类反转录转座子基因序列,命名为MwRRT（GenBank：GQ855806.1）。序列分析结果表明：该序列长为1 005 bp,包含780 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸。经GenBank中BLAST程序分析表明,该片段98~255处氨基酸与水稻（Oryza sativa）预测逆转录转座子蛋白Ty3-gypsy亚类、预测种属特异抗原—聚合酶（Gag-Pol）前体和预测聚合酶氨基酸同源性为47%;与高粱（Sorghum bicolor）的预测GAG-POL前体氨基酸同源性为52%。

蒙古冰草茎尖愈伤组织及其再生植株诱导

试验通过对蒙古冰草不同部位的离体培养,筛选出了茎尖为诱导愈伤的适宜外植体,并通过MS基本培养基添加不同激素配比试验,建立了一套以蒙古冰草茎尖为外植体的再生体系,其中最适愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA,诱导率达到84.9%;最适分化培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,分化率为53.2%;生根培养基MS+0.5 mg/L NAA,生根率为100%。这是首次建立以蒙古冰草营养体为外植体的再生体系,为蒙古冰草的遗传转化奠定了基础。

不同贮藏时间加拿大披碱草种子活力研究初报

采用室内常规发芽法,对常温贮藏5个不同年份的加拿大披碱草种子的萌发特性和活力变化进行了测试,以检验其种子的劣变过程及种用价值。结果表明：随贮藏时间延长,不同贮藏时间的加拿大披碱草种子有不同程度的休眠和生活力下降的现象。其种子生活力、发芽率、发芽势、发芽指数均呈＂抛物线＂形状变化;其生活力、发芽率、发芽势、发芽指数、电导率与贮藏时间呈显著相关关系。当年收获的种子存在休眠现象,贮藏1~2年的种子利用价值较佳,常温贮藏4年的种子活力较低,种用价值较差。

蒙古冰草SRAP反应体系建立

研究以蒙古冰草为材料,通过单因子Mg2+、dNTP、Taq酶、引物、DNA试验;2×Taq PCR Master Mix、引物、DNA正交试验建立了蒙古冰草SRAP反应的优化体系。结果表明:最佳反应体系为10uL:2uL 2×Taq PCR Master Mix、0.4umol/L引物、60ng模板DNA。该体系对蒙古冰草扩增效果好,电泳结果显示扩增条带清晰,多态性高,而且操作简单,为SRAP标记技术在蒙古冰草相关研究中的应用提供条件。

蒙古冰草MwLEA3基因ihpRNA表达载体的构建

采用RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出MwLEA3基因的特异性cDNA序列,并连入克隆载体pGM-T中。根据植物中ihpRNA原理,成功构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX),并通过冻融法转化将MwLEA3基因的ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌LBA4404中。

野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究

以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿(Medicago falcata L.)无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对其组织培养及再生体系进行系统的研究,以期为其下一步转基因试验提供良好的受体。结果表明:最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5mg.L-1 2,4-D+0.4mg.L-1 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,下胚轴和子叶的最佳愈伤诱导率均可达到100%。最佳胚性愈伤形成培养基为MS+0.5mg.L-1 KT+0.1mg.L-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,胚性愈伤形成率为81.5%;最佳分化芽形成培养基为MS+0.25mg.L-1 KT+0.05mg.L-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,分化芽形成率为36.5%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5mg.L-1 NAA+1.5%蔗糖+0.7%琼脂,生根率为93.3%。愈伤诱导结果显示,供试黄花苜蓿材料个体间组织培养再生性存在较大差异,在同一激素水平上有大约1/3植株的愈伤状态优于其他植株。

老化处理对2种披碱草属牧草种子生理生化的影响

采用高温高湿(42℃,RH 100%)人工老化法处理加拿大披碱草和老芒麦种子,并对不同老化时间种子进行发芽指标、电导率、脱氢酶活性、酸性磷酸酯酶活性和丙二醛含量的测定。结果表明:在老化处理过程中,加拿大披碱草种子发芽指标在老化初期先呈缓慢上升趋势,随老化时间延长,呈现出下降趋势,老芒麦呈现下降趋势;在两种牧草种子老化过程中,电导率升高;脱氢酶和酸性磷酸酯酶活性下降。脱氢酶和酸性磷酸酯酶都可以用来衡量加拿大披碱草种子活力;而丙二醛含量不适合用于评价本材料种子活力。

加拿大披碱草生长锥分化的观察

为阐明加拿大披碱草(Elymus canadensis L.)生殖生长过程,采用显微镜常规解剖法对加拿大披碱草生长锥分化过程和发育规律进行研究。结果表明:加拿大披碱草生长锥的分化和发育是一个连续过程,可分为8个时期:初生期、伸长期、结节期、小穗突起期、颖片突起期、小花突起期、雌雄蕊形成期和抽穗始期;生长锥分化很不一致,拔节和分蘖几乎同时进行,形成生长锥分化在一定时期相互交错的结果,最后导致抽穗不整齐,致使抽穗时间过长;小穗发育规律性很强,主穗中上部小穗发育最快,然后向上、向下依次进行,基部小穗发育最慢。

红三叶新品系无菌苗培养体系优化

以红三叶(Trifolium pratense L.)新品系为材料,对无菌苗培养的种子消毒方法和培养基组成进行研究,以期为红三叶新品系组培再生体系、分于育种及抗病性研究提供基础依据。结果表明:0.1%HgCl2,3%NaClO和15%H2O2消毒不超过15 min,对红三叶新品系种子发芽率没有显著影响,但消毒效果存在较大差异。红三叶种子消毒的最佳方法为75%酒精预处理,0.1%HgCl2消毒10 min,发芽率可达89.44%,并彻底无污染。最适培养基为1/4MS+1.5%蔗糖,不添加激素,pH6.0,发芽率可达85.78%,无菌苗生长良好。培养基中无机盐的含量是影响红三叶种子发芽率和无菌苗生长的关键因素。琼脂培养基培养比滤纸培养的无菌苗子叶和下胚轴出愈率显著提高,但不同组分琼脂培养基的无菌苗出愈率无显著差异。

黄花苜蓿LEA3基因片段克隆与生物信息学分析

根据紫花苜蓿LEA3-1 mRNA(EU665182)的cDNA序列,设计1对特异引物,以经过ABA干旱胁迫处理的黄花苜蓿为材料,提取总RNA。采用RT-PCR方法克隆获得了747 bp的cDNA片段,命名为MfLEA3-1(GenBank登录号:HQ327439)。推测该序列编码了248个氨基酸,这些氨基酸主要由10.1%苏氨酸(Thr)、24.6%丙氨酸(Ala)、17.7%赖氨酸(Lys)和12.9%天冬氨酸(Asp)组成,不含有半胱氨酸和色氨酸,这与其他物种LEA蛋白成分非常接近。该氨基酸序列中存在13个11-mer重复序列,根据第3组蛋白分类标准,MfLEA3-1蛋白比较接近于type I,但是11-mer重复中残基分布与type I有所不同,推测MfLEA3-1蛋白属于新的第3组LEA蛋白类型。黄花苜蓿中成功获得了LEA3基因片段,为最终克隆黄花苜蓿LEA3基因序列全长奠定基础。

红三叶新品系组织培养和植株再生

利用红三叶(Trifolium pratense L.)新品系无菌苗不同部位,通过愈伤组织诱导及分化途径获得再生植株。结果表明:子叶、下胚轴、叶柄、叶片及根段在MS+0.5mg.L-1 6-BA+1～2mg.L-1 2,4-D培养基上都极易诱导出愈伤组织。最佳继代培养基为MS+0.5mg.L-1 6-BA+1.0mg.L-1 2,4-D,添加2,4-D比NAA更利于愈伤的增长和保存;最佳分化培养基为MS+0.75mg.L-1 6-BA+0.5mg.L-1 NAA,最高分化率为16.67%,且分裂素6-BA优于KT,6-BA与NAA组合比与IBA组合更有利于红三叶愈伤组织的分化;茎芽增殖最佳培养基为MS+0.5mg.L-1 6-BA+1.0mg.L-1 IBA,再生苗的增殖效果IBA>NAA,2,4-D不利于茎芽生长;最佳生根条件为50mg.L-1浓度的IBA中浸泡1h后植入含0.5mg.L-1 IBA的MS中,生根率达80%,红三叶新品系IBA生根最大极限浓度为0.75mg.L-1,浓度过高表现出对根系生长的毒害。

苜蓿叶部形态特征测定与分析

以国内外不同苜蓿材料为研究对象,于2018年度对其分枝期成株叶部形态特征进行了观测。结果表明:供试苜蓿成株单个材料叶长度平均值为2.46cm,宽度为1.44cm,株高为31.31cm,冠幅为51.41cm,其中礼县紫花苜蓿整体表现出较好的优势,适宜作为育种优质种质资源。