冠状病毒组装及释放机制的研究进展

冠状病毒在近几十年中引起了多次大规模的传染病造成了严重的人员伤亡,严重威胁着人类的生命健康。病毒的组装与释放是冠状病毒生命周期的关键阶段,因此对冠状病毒组装和释放机制进行研究是至关重要的。该文对冠状病毒组装包装机制、冠状病毒多种释放途径以及相应的靶向抗病毒药物进行阐述,为其应对冠状病毒的预防与治疗提供参考。

AGK基因启动子重组质粒构建及其在T淋巴细胞白血病中转录活性的研究

目的研究T淋巴细胞白血病中酰基甘油激酶(acylglycerol kinase,AGK)上游转录机制,构建AGK基因启动子不同截短片段的重组质粒并检测其转录活性。方法利用TIMER2.0、The Human Protein Atlas、Gene Expression Profiling Interactive Analysis等公共数据库探索AGK在白血病中的作用,以pGL4.20-pAGK promoter-luciferase全长质粒为模板,利用PCR法分别扩增AGK启动子不同长度的截短片段;将扩增片段分别插入pGL4.20-basic载体,构建AGK启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒电击转染至人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat中,采用双荧光素酶报告基因实验测定AGK启动子不同截短片段的双荧光素酶活性。结果AGK在多种类型肿瘤中表达上调(P<0.05),且在白血病细胞中处于较高水平。Log-rank检验结果显示AGK高表达患者的总生存期短于低表达患者(P=0.028)。JASPAR网站预测出3个评分高的转录因子TEAD与AGK的结合区域,并成功构建含AGK基因启动子不同截短片段重组质粒。双荧光素酶报告基因实验发现T淋巴细胞白血病细胞中AGK启动子转录活性在-540bp至-80 bp区域较高。结论人T淋巴细胞白血病细胞中AGK基因启动子在-540 bp至-80 bp区域的转录活性较高,可为进一步研究T淋巴细胞白血病中AGK的转录及其上游调控机制奠定基础。

基因编辑技术在军事医学领域的潜在应用

基因编辑技术是一种对生物体目标基因进行定点“编辑”的工程技术,近年来发展非常迅速,已冲击到生命科学的各个领域,是世界范围内竞争最为激烈的下一代核心颠覆性生物技术。基因编辑技术已应用于农作物改良、畜牧业育种、遗传与代谢性疾病的治疗、抗细菌和病毒感染、药物筛选、制备新型生物燃料等领域。其在军事医学领域也有重要用途:通过基因编辑技术,使病原体危害性增大、毒性增强;靶向病原体的保守序列设计药物、疫苗等,可以防御多个毒株和变异体的感染;靶向宿主,CRISPR/dCas9系统介导的表观遗传基因编辑,不改变DNA遗传性状,也能可逆性增强人体效能,抵抗生物、化学、放射损伤;靶向基因编辑器自身的核酸酶和引导RNA,能精准调控基因编辑技术,防御基因编辑技术谬用和新型基因类生物战剂造成的危害。基因编辑技术在传染病诊治领域也具有显著优势,能彻底治愈某些类型的传染病。

CDK4基因在骨肉瘤细胞中的表达及功能研究

背景细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,是许多癌症的潜在治疗靶点,但其在骨肉瘤中的表达水平及功能尚不清楚,有待深入研究。目的本研究旨在探索CDK4基因在骨肉瘤细胞中的表达水平,并验证该基因与骨肉瘤细胞增殖和迁移的关系。方法选择GEO数据库中与骨肉瘤相关的基因表达谱芯片数据,对比数据集内两组样品骨肉瘤MG63细胞系及正常成骨细胞HOB细胞系的数据,分析CDK4基因在两组间的表达差异。使用人乳腺文库作模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)将人CDK4基因的CDS区编码序列进行扩增得到扩增产物。将扩增产物插入pEGFP-C1载体中,得到重组质粒,再将此重组质粒转染至MG63细胞内,利用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测质粒的表达情况,并用荧光显微镜观察带有荧光标记的CDK4蛋白在细胞中的定位。通过CCK-8、克隆形成及划痕实验研究转染CDK4重组质粒的人骨肉瘤MG63细胞的增殖和迁移情况。结果基因表达谱芯片数据集分析显示,CDK4在MG63细胞系中的表达水平显著高于HOB细胞系。将获得的质粒进行双酶切和测序,成功构建pEGFP-CDK4真核表达载体;Western blot证明目的蛋白成功表达;荧光显微镜观察发现CDK4定位在细胞核中;CCK-8、克隆形成和划痕实验的结果显示,过表达pEGFP-CDK4能促进MG63细胞的增殖和迁移。结论CDK4在人骨肉瘤MG63细胞系中的表达水平高于正常成骨细胞HOB细胞系。CDK4蛋白定位于MG63细胞核中,可能有助于促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。

不同品系小鼠对炭疽芽胞杆菌弱毒株芽胞的敏感性研究

通过比较四种品系小鼠对炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)(简称炭疽杆菌)弱毒株芽胞的敏感性,确定炭疽杆菌弱毒株芽胞攻毒合适的动物模型。采用炭疽杆菌弱毒株A16Q1(pXO1-、pXO2+)和A16PI2(pXO1+、pXO2-)的芽胞对四种品系小鼠(DBA/2、KM、ICR和BALB/c)进行腹腔攻毒,记录小鼠死亡时间,计算LD50、绘制存活曲线并统计分析。运用较敏感的KM小鼠研究不同canSNP基因型毒素缺陷株(含pXO2拷贝数不同)芽胞的毒力差异。利用更为敏感的DBA/2小鼠评价S-层蛋白BA3338对荚膜缺陷株芽胞毒力的影响。结果表明,在四种品系小鼠中,毒素缺陷株芽胞的毒力均高于荚膜缺陷株芽胞的毒力。DBA/2小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞的剂量依赖关系最好,最为敏感,其次是KM小鼠,而ICR小鼠和BALB/c小鼠对炭疽杆菌弱毒株芽胞不敏感。确定了DBA/2小鼠和KM小鼠在炭疽杆菌弱毒株芽胞研究中的适用性。使用KM小鼠评价了不同canSNP基因型炭疽杆菌芽胞的毒力差异,结果表明,不同canSNP基因型炭疽杆菌由于所含pXO2质粒拷贝数的差异导致芽胞的毒力不同。使用DBA/2小鼠评价了S-层蛋白BA3338缺失对炭疽杆菌芽胞毒力的影响,表明BA3338基因的缺失导致炭疽杆菌芽胞毒力降低。

单细胞转录组测序技术在胃癌研究中的应用

胃癌(gastric cancer,GC)发病率居全球常见癌症第五位,死亡率居第三位.随着单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing,scRNA-seq)技术的发展,人们对GC的研究已经开始逐渐从组织病理学水平发展到单细胞转录水平.本文对scRNA-seq技术原理及其在GC研究中的应用,包括其在揭示GC癌前病变的转录特征与起源、原发性肿瘤的瘤内异质性、肿瘤微环境和转移性播散等方面的应用进行了综述.

中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。

幽门螺杆菌感染引起的免疫应答与免疫逃逸机制研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种专性寄生于胃黏膜表面的革兰氏阴性菌,与慢性胃炎、胃和十二指肠消化性溃疡、胃腺癌,以及胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关. H. pylori感染机体后,首先被体内免疫细胞的模式识别受体家族识别,进而引起机体的固有免疫和适应性免疫应答,但这些应答通常不足以清除细菌感染, H. pylori可以通过改装并减弱其病原体广泛共存的相关分子模式的免疫原性,调控固有免疫细胞和T细胞的免疫应答来逃避免疫系统的识别和清除,导致持续感染.深入了解H. pylori感染引起的免疫应答与免疫逃逸机制,对于消除H. pylori感染,控制H. pylori感染相关性疾病的发生具有极其重要的意义.

西黄丸抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的分子机制研究

目的探讨西黄丸水提液抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的分子机制。方法通过细胞划痕实验分析不同浓度(5、7.5、15 g/L)西黄丸水提液对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。利用表皮生长因子(EGF)单独或联合加入西黄丸水提液,作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过蛋白质印迹法检测纤维连接蛋白(FN)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、波形蛋白等蛋白的表达水平,分析西黄丸对于上皮细胞间质转化(EMT)的作用。结果划痕实验显示,与对照组(西黄丸水提液浓度为0)相比,加入西黄丸水提液(5、7.5、15 g/L),36 h后肿瘤细胞的运动迁移能力受到抑制。与对照组(EGF浓度为0)相比,EGF浓度为40、60、80、100μg/L时,FN相对表达量明显较高[(1.15±0.31)、(1.21±0.13)、(0.74±0.02)、(1.10±0.23)比(0.57±0.06)],EGF浓度为100μg/L时,p-STAT3/STAT3明显较高[(1.60±0.08)比(0.96±0.15)](均P<0.05)。使用60μg/L EGF刺激乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后,加入不同浓度(0、5、7.5、15 g/L)西黄丸水提液作用24 h,结果显示,15 g/L的西黄丸水提液可降低FN与波形蛋白的表达水平。使用100μg/L EGF刺激乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后,加入不同浓度(0、5、7.5、15 g/L)西黄丸水提液作用24 h,结果显示,15 g/L的西黄丸水提液可降低p-STAT3的表达水平。结论西黄丸水提液可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力,同时可以在MDA-MB-231细胞中抑制因EGF刺激而增强的EMT过程。

类器官研究进展及应用

类器官是一种新型体外研究模型,由干细胞或肿瘤细胞在三维培养条件下自我组装而成。它能够高度模拟原位组织的生理结构和功能,经长期传代保持遗传信息的稳定,因此类器官在构建疾病模型、药物筛选及个体化医疗等方面具有广阔前景。目前,食道、胃、肠、肝、胰、前列腺和乳腺等结构的类器官和相应的肿瘤类器官均已面世,开拓了体外培养的新平台。本文将对类器官的类型及其在生物医学领域的应用做一综述。

CCR5-△32突变基因地域和人群分布的研究进展

艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(AIDS)对人类健康造成极大威胁。引起该病的病原体是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)。HIV-1通过与CD4^+受体以及CC趋化因子受体5(CCR5)或CXC趋化因子受体4(CXCR4)辅受体结合而感染细胞,当CCR5发生32个碱基缺失突变时,其在细胞膜的表达量减少,导致HIV-1无法有效地入侵细胞。我们把这种突变的CCR5称为第一外显子缺失32个碱基的CC趋化因子受体5(CCR5-△32)。近年来,通过对CCR5-△32的深入研究, AIDS的治疗获得很大进展。我们主要总结了该基因的结构功能并且详细统计了不同地区不同人群该基因的分布情况,以期对AIDS的治疗提供帮助。

蜡样芽胞杆菌族毒素研究进展

蜡样芽胞杆菌族(Bacillus cereus sensu lato)包括几个具有密切系统发育关系的芽胞杆菌物种,产生的毒素种类繁多,备受人们关注。质粒在菌株中的水平转移,会改变其表型、致病性和毒力,同时也带来分类的问题。通过综述几种蜡样芽胞杆菌毒素的结构特性、作用机制及其危害或生物应用,从质粒水平转移的角度介绍蜡样芽胞杆菌族成员错综复杂的关系。

2例太岁样品分离菌的初步研究

目的:太岁是自然界中一种未知生命体,本实验对2例来源地不同的太岁样品进行菌株分离培养与鉴定。方法:太岁经表面消毒后无菌研磨,采用多种培养基涂板以分离可培养菌株,并进行16S rDNA、18S rDNA序列PCR扩增、测序及Blast比对。结果:从2例太岁样本中分别获得4株相似菌株,经鉴定,分离菌株TS-1为荧光假单胞菌(Pseudomonas flulorescens),TS-2为地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea),TS-3为红串红球菌(Rhodococcus erythropolis),TS-4为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)。结论:2例来源不同的太岁中均含有上述4种菌株,在生物学组成中具有一定的共性,为研究太岁的形成提供了新的思路。

Toll样受体2激动剂在疫苗研发中的研究进展

Toll样受体2(TLR2)是Toll样家族中识别配体范围最大的一类Toll样受体(TLR),能够识别包括脂蛋白、脂肽等成分在内的多种配体。通过这些配体激活后的TLR2可以在免疫系统中发挥重要作用,引发特异性免疫反应。通过简要综述近年来对TLR2配体激动剂作为潜在的疫苗佐剂及免疫类药物方面的研究,发现其在免疫反应过程中的优势将为解决疫苗研发中的多种挑战发挥至关重要的作用。

幽门螺杆菌疫苗诱导的免疫保护反应及临床试验研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微需氧、寄生于胃黏膜表面的革兰阴性致病菌,可导致各种不同的疾病,如慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡,甚至包括胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤和胃腺癌等恶性疾病。目前根除Hp主要依靠包括2种抗生素、铋剂和质子泵抑制剂(proton pumpinhibitors,PPI)在内的四联疗法。随着Hp耐药性的增强,研发Hp疫苗成为防治Hp感染的新途径。Hp疫苗能够诱导机体产生抗原特异性血清IgG和黏膜sIgA体液免疫反应以及抗原特异性CD4+T细胞免疫反应等的有效免疫保护反应。

GP73中和抗体抑制MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝机制研究

目的研究高尔基体蛋白73(GP73)中和抗体在由蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪肝(NAFLD)发生过程中的功能机制。方法小鼠经MCD饮食和GP73中和抗体干预后,检测血清总胆固醇(TC)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)总含量;肝组织脂质蓄积程度由ORO染色和HE染色进行观察;qRT-PCR检测肝组织ACC1、HMGR、TIMP1、TGF-β的基因表达情况;Western blot检测肝组织α-SMA和SREBP1蛋白表达水平。结果GP73中和抗体会降低由MCD饮食诱导的血清ALT、AST积累(P<0.001),提高血清TG、TC的水平(P<0.001);肝组织HGMR(P<0.001)、TGF-β(P<0.05)、ACC1(P<0.01)的基因表达水平和α-SMA(P<0.05)、SREBP1(P<0.05)蛋白表达水平出现下降,改善脂肪堆积。结论GP73中和抗体通过减缓肝脏纤维化进程,减轻肝脏脂质蓄积,抑制MCD诱导的NAFLD的形成。

细胞短期冻存液的优化研究

目的:探索不同配方的冻存液对细胞短期冻存复苏后存活率及增殖活性的影响,进而对细胞短期冻存液配比进行优化。方法:将多种贴壁细胞及悬浮细胞分别用4种不同配比冻存液冻存[(A)10%二甲基亚砜(DMSO)+10%胎牛血清(FBS)+80%DMEM/1640培养基;(B)10%DMSO+20%FBS+70%DMEM/1640培养基;(C)10%DMSO+50%FBS+40%DMEM/1640培养基;(D)10%DMSO+90%FBS],程序性降温(平均降温速率-1℃/min)至-80℃,冻存4 d后以相同方法复苏细胞并观察细胞生长形态学变化,分别拍摄细胞在复苏后24、30、48、72、96 h时的生长状态,并根据台盼蓝染色进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。结果:冻存液中的不同血清浓度配比对贴壁细胞短期冻存复苏后的生长形态及增殖无明显影响;而对于悬浮细胞,高血清配比的冻存液(C、D组)短暂冻存后复苏细胞的存活率明显高于低血清配比组(A、B组),并且其生长增殖能力也明显减弱。结论:对于贴壁细胞的短期冻存与复苏,冻存液中DMEM∶FBS∶DMSO比例为8∶1∶1;而对于悬浮细胞的短期冻存与培养,FBS∶DMSO为9∶1的冻存效果最好。

环状RNA在胃癌中的研究进展

胃癌作为一种发病率高、进展速度快、预后结局差的恶性肿瘤,给患者、家庭和社会带来极大的负担。现有临床诊疗手段十分有限,亟待探索新型的早期诊断标志物、预后判断参考值及个体化治疗靶点。环状RNA(circRNA)是非编码RNA家族成员,与多种疾病的发生发展密切相关。大量研究证明,circRNA与肿瘤的恶性转归存在机制关联,并因其独有的生物学特性,在胃癌的早期诊断、预后判断、治疗靶点筛选方面崭露头角,具有高度的临床转化价值。本文对circRNA在胃癌中的进展进行总结,为后续深入研究提供参考。

小鼠原代肝细胞糖异生研究模型的建立

目的:分离小鼠原代肝细胞并建立体外糖异生研究模型。方法:利用胶原酶两步灌注法分离并提纯小鼠原代肝细胞,彻底清除细胞内糖原,以丙酮酸和乳酸作为糖异生原料,观察胰高血糖素作用下,小鼠原代肝细胞的葡萄糖产出水平、糖代谢关键酶基因表达水平,以及cAMP-PKA信号通路的激活情况,建立小鼠原代肝细胞糖异生研究模型。结果:分离的小鼠原代肝细胞具有典型的肝细胞形态,可见双核,细胞相互接触,排列成肝索样结构。在胰高血糖素作用下,小鼠原代肝细胞糖异生葡萄糖产出量显著增加,小鼠原代肝细胞糖异生关键酶基因表达明显上调,且胰高血糖素能够促进细胞cAMP积累进而诱导PKA激活。结论:小鼠原代肝细胞分离后状态良好,能够在葡萄糖产出水平及细胞内信号通路激活上高效模拟哺乳动物机体糖异生代谢,是一项体外研究糖异生代谢的有效模型。

α芋螺毒素MI分支肽的合成及免疫原性研究

目的:为探索α芋螺毒素MI的解毒方法,研究MI分支肽抗原的合成方法、免疫原性及抗血清对MI的解毒活性。方法:采用固相多肽合成法合成含炔基MI线性肽及含叠氮赖氨酸分支肽,空气氧化得含炔基MI,通过铜[Cu(I)]催化叠氮-炔杂环加成反应合成多分支肽。多分支肽4次免疫BALB/c小鼠制备抗血清,ELISA法测定血清抗体滴度,然后MI与抗血清混合注射KM小鼠,测定抗血清的保护效果。结果:合成了MI八分支肽,N端连接的MI八分支肽的免疫原性差,10、20μg/只剂量组第4次免疫后的血清抗体滴度分别为1∶400及1∶6400;C端连接的MI八分支肽的免疫原性较高,10、20μg/只剂量组第4次免疫后的血清抗体滴度分别为1∶3200及1∶25600。各组200μL抗血清与20μg/kg MI混合后注射小鼠,小鼠均死亡,且死亡时间与对照组相比无显著差异。结论:C端连接的MI八分支肽比N端连接的八分肽免疫抗原性高,但两者的抗血清对MI无显著解毒活性。