利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

目的:通过构建Lon基因下调的哺乳动物细胞模型表达,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以探讨Lon蛋白的功能。方法:设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA),构建pSi-lencer U6 2.1-Lon真核表达载体,用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法)。结果:RT-PCR显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染MCF7细胞,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的带,细胞培养结果显示,细胞增殖能力明显减弱。紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞,增殖能力明显下降,与空载体转染组(pSi-lencer U6 2.1)和未转染组相比有显著性差异(P<0.05)。加热应激试验显示,37,41,43℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组、未转染组相比有显著性差异(P<0.05)。而在45℃时,RNA干扰转染组、空载体转染组与未转染组之间均无显著性差异(P>0.05)。结论:RNAi能有效下调Lon蛋白的表达。Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力,诱导细胞凋亡,以及可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性。

晚期NSCLC患者EGFR-TKI治疗过程中血清多肽变化及其临床意义的探索性研究

背景与目的本研究旨在应用基质辅助激光解析离子化-时间飞行质谱仪(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)检测晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者在接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)治疗过程中血清多肽的变化并探索其临床意义。方法收集34例接受EGFR-TKI治疗的晚期NSCLC患者TKI治疗前、最佳疗效时及疾病进展后的自身配对血清样本102份。处理血清样本并应用MALDI-TOF-MS检测,得到质谱图后使用CPT统计软件进行分析,鉴定出差异多肽,并对其临床意义进行分析。结果 34例接受EGFR-TKI治疗的患者无完全缓解(complete response,CR)患者,部分缓解(partial response,PR)11例,疾病稳定(stable disease,SD)23例,中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)为8.0个月(95%CI:6.6-11.2);中位总生存期(overall survival,OS)为11.4个月(95%CI:10.6-16.5)。对TKI治疗的三个不同时间点的血清进行质谱检测,结果显示三个时间点多肽指纹图谱均不相同;配对分析最佳疗效时与基线时质谱数据经CPT软件共鉴定出差异多肽峰87个,筛选出两组间有统计学差异[P<0.001、曲线下面积(area under curve,AUC)≥0.9]的多肽峰1个;疾病进展时与基线时共鉴定出差异多肽峰96个,筛选出两组间有统计学差异(P<0.001,AUC≥0.9)的多肽峰3个;最佳疗效时与疾病进展时共鉴定出差异多肽峰115个,筛选出两组间有统计学差异(P<0.001,AUC≥0.9)的多肽峰4个。结论 NSCLC患者TKI治疗过程中血清多肽存在动态变化,差异多肽可能与治疗效果、疾病进展相关,差异多肽的特性、临床意义需进一步鉴定和验证。

人脐带间充质干细胞体内移植的安全性研究

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的成瘤性及其对荷瘤鼠肿瘤生长的影响。方法:分离培养hUCMSC,取第6代细胞裸鼠皮下移植,观察其成瘤性;对荷瘤鼠尾静脉注射移植hUCMSC,观察其对肿瘤生长的影响;体外共培养hUCMSC和MCF-7肿瘤细胞,观察hUCMSC对MCF-7细胞克隆形成率的影响。结果:hUCMSC裸鼠皮下移植30 d,未观察到有肿瘤形成;尾静脉注射移植hUCMSC对荷瘤鼠肿瘤的生长无明显影响;体外共培养结果表明,hUCMSC对MCF-7肿瘤细胞的克隆形成无明显影响。结论:hUCMSC体内移植无成瘤性;静脉移植后对肿瘤生长无显著影响。

组织培养用于小鼠胚胎AGM区造血发育的研究

本研究通过建立组织培养方法探讨小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾区(AGM)区造血发育规律。选取小鼠胚胎AGM区作为实验对象,体外组织培养2天后,应用集落形成实验观察髓系祖细胞的数量,应用体内移植考察CFU-S11和造血干细胞的发育。结果表明:组织培养后的AGM区细胞仍然具有形成髓系集落的能力;每个胚胎期10.5天(E10.5)AGM区在致死剂量照射的成年小鼠脾脏中可形成10.8±3.5个CFU-S11。更重要的是,经组织培养的E10.5-E11.5 AGM区能高比例(85.7%)、高嵌合〔(51.12±21.17)%〕、长期(>4个月)重建受致死剂量照射的成年小鼠的造血系统,在受鼠的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中均能检测到供体来源的淋系或髓系祖细胞嵌合。结论:应用本研究建立的组织培养体系可对正常或基因突变胚胎AGM区中的多种造血起始细胞(尤其是造血干/祖细胞)进行发育动力学研究。

单克隆来源的小鼠胎肝HPP-CFC肝上皮分化潜能的研究

为研究胎肝中造血和肝上皮发育的关系,建立了小鼠胎肝高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)培养体系,并进行了单克隆培养以及诱导分化实验.在造血和肝诱导因子的共同作用下,对单克隆来源的HPP集落细胞向造血和肝上皮细胞进行诱导分化,采用透射电镜(TEM)、巢式RT-PCR、细胞免疫荧光检测,从细胞形态、超微结构、上皮细胞分化标志等方面对分化后的细胞进行检测.检测结果显示,诱导后的部分细胞具有肝细胞特异性的超微结构,并不同程度地表达白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白(CK8,CK18)等肝上皮分化标志,同时还表达间质标志α-SMA和血管内皮细胞标志Flk-1.免疫磁珠分选表明:胎肝来源的HPP-CFC主要来自于CD45+细胞,CD45-细胞不具有形成造血细胞克隆的能力.在肝上皮细胞分化潜能上,流式分选获得的CD49f+/Sca-1+细胞与未分选细胞无明显差异.该模型的克隆源性通过细胞混合实验进行证明.研究结果表明,改进的胎肝来源的HPP-CFC可能代表了一个新的造血细胞向肝上皮细胞分化的单克隆模型,为研究胎肝中造血和非造血细胞的发育关系提供了一个新的切入点.

MALDI-TOF质谱筛查NSCLC患者血清特异性多肽的探索性研究

背景与目的早期诊断是提高肺癌生存率的关键,传统的肺癌诊断技术仍存在一定局限性。鉴于近年来以质谱为核心技术的肿瘤蛋白组学在癌症诊断方面的初步研究,本研究探索性应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of ight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者和健康人群的血清差异多肽,以建立NSCLC的血清分类模型。方法将年龄和性别匹配的133例NSCLC患者和132例健康者血清标本按照3:1的比例随机分为两组:训练组由100例NSCLC患者和100例健康者血清标本组成,用以建立分类模型;测试组由33例NSCLC患者和32例健康者血清标本组成,用以验证模型。采用铜离子鳌合纳米磁珠提取血清多肽、MALDI-TOF-MS技术检测得到质谱图。ClinProToolsTM统计软件分析训练组NSCLC患者与健康者之间的多肽图谱,从中筛选出一组差异多肽并建立分类模型,最后用测试组对模型进行盲样验证。结果在训练组中观察到血清质荷比(m/z)在1,000Da-10,000Da范围内有131个差异多肽信号峰,在此范围内共得到14个有统计学意义的差异多肽峰(P<0.000,001;AUC0.9),其中NSCLC患者与健康者相比,表达上调的多肽有2个,表达下调的有12个,由统计软件筛选出3个多肽峰(7,478.59Da、2,271.44Da、4,468.38Da)建立分类模型,然后对测试组进行验证,其盲样验证敏感性100%,特异性96.9%,准确率98.5%。结论本组研究显示NSCLC患者与健康人群的血清多肽存在差异,应用MALDI-TOF-MS技术可建立NSCLC的血清多肽分类模型且小规模验证具有较好的敏感性和特异性,希望大规模验证模型,并与传统诊断方法对照或结合,进而尝试建立一种新的NSCLC早期诊断模式。

腹腔注射百草枯构建小鼠肺纤维化模型

目的:探讨百草枯一次性腹腔注射致小鼠肺纤维化的病理改变及半数致死剂量(LD50),进而制备肺纤维化病理改变稳定的百草枯中毒小鼠肺纤维化模型。方法:60只正常雌性C57BL/6J小鼠被随机分为6组,10只/组,分别为正常对照组及百草枯给药30、40、50、60和80 mg/kg组,所有小鼠于造模后28 d处死,取其左肺用于病理观察(HE染色),并计算LD50及各组肺纤维化Ashcroft评级。结果:至观察期28 d,小鼠一次性腹腔注射百草枯溶液的LD50为55.1923 mg/kg;各染毒组均出现不同程度的肺纤维化改变,且注射剂量越高,肺纤维化病变越严重,但早期死亡率亦越高。结论:一次性腹腔注射百草枯可制备小鼠肺纤维化模型,40和50 mg/kg为较合适的造模剂量。

人脐带间充质干细胞对百草枯中毒肺损伤小鼠模型的治疗作用

目的:探讨脐带间充质干细胞(UCMSC)治疗百草枯中毒引起的小鼠肺损伤的可行性。方法:小鼠腹腔一次性注射百草枯制备百草枯中毒小鼠模型,24 h后尾静脉注射UCMSC,分别于治疗后7和21 d取材,观察UCMSC对急性肺损伤和慢性肺纤维化的治疗作用。结果:UCMSC移植对40和50 mg/kg百草枯染毒组急性肺损伤有效,动物死亡率显著降低,但对60 mg/kg百草枯染毒组动物无效。UCMSC治疗对慢性肺纤维化有显著治疗作用,治疗组动物体重恢复早,死亡率降低,肺纤维化评分降低。RT-PCR结果显示,UCMSC移植3 h有人特异性线粒体基因的表达,但24 h后未检测到。结论:UCMSC对百草枯中毒性急慢性肺损伤有一定的治疗作用,这种作用可能是通过旁分泌机制实现的。

钙离子结合蛋白及其在神经系统疾病中的作用

钙离子作为第二信使参与多种途径的调控,钙离子结合蛋白在此过程中起着重要的作用.通过对钙离子结合蛋白的分布特征、结构分析,新的成员以及新的功能不断地被发现.在疾病发生过程中,钙离子结合蛋白动态平衡的破坏与线粒体的异常、自由基的损害有密切的关系,并已在多种疾病特别是神经系统的疾病中得到了证实.本文就钙离子结合蛋白的特征以及在主要神经系统疾病中作用的研究进展进行简要综述.

LAMP~技术在乳腺癌前哨淋巴结转移快速检测中的应用

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,前哨淋巴结(sentinellymph node,SLN)是肿瘤转移的第一站,通过前哨淋巴结的转移状态可以判断患者是否需要进行腋窝淋巴结清扫(axilary lymph nodesdissection,ALND)。本研究采用环介导等温扩增(LAMP?)技术在术中对前哨淋巴结进行快速检测,通过分析细胞角蛋白(CK19)基因、泌乳素诱导蛋白(PIP)基因和胆色素原脱氨酶(PBGD)基因的存在与否,来判断前哨淋巴结是否发生转移,与GeneSearch法判断的结果一致,LAMP?方法具有快速、简便、准确等优点,具有巨大的发展潜力。

可溶性PD-L1在接受放射治疗的非小细胞肺癌患者外周血中的表达和其临床意义

目的:采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测放射治疗后非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中可溶性程序性死亡配体-1(s PD-L1)的表达,动态检测其在治疗前后的变化,并分析其与诊断、疗效以及生存相关性。方法:选取136例NSCLC患者,将29例Ⅰ~Ⅱ期NSCLC患者纳入体部立体定向放射治疗(SBRT)组,采用射波刀治疗,计划靶区(PTV)处方剂量为每日每次DT 48~60 Gy,8~15 Gy,1次/d,共3~6次。将107例Ⅲ期NSCLC患者纳入适形调强放射治疗(IMRT)组,采用适形调强放射治疗并联合同步加序贯化疗,PTV处方剂量DT60 Gy,每日每次2 Gy,每周5次;将SBRT组和IMRT组内患者分为s PD-L1表达值高变化率组和s PD-L1表达值低变化率组。同时选取61名健康体检志愿者纳入健康组。提取全部受试者初始状态下和两组NSCLC患者放射治疗中、治疗后不同时间节点血清,行ELISA法检测其s PD-L1表达的浓度水平。结果:初始状态下血清中s PD-L1的表达在健康组、SBRT组和IMRT组分别为176.97 pg/ml、188.44 pg/ml和208.44 pg/ml,非参数检验提示三组间存在显著性差异,有统计学意义(x^2=84.638,P<0.01)。SBRT组和IMRT组患者s PD-L1表达水平在放射治疗后呈进行性下降趋势,其变化幅度差异有统计学意义(Z=39.379,Z=252.161;P<0.01)。Kaplan-Meier法生存率分析结果显示:SBRT两亚组间生存率差异无统计学意义(x^2=0.009,P>0.05),IMRT两亚组间生存率差异显著,有统计学意义(x^2=11.427,P<0.05)。多因素生存分析证实s PD-L1表达值降低幅度大,是一个独立预后因素(HR=0.381,P<0.05)。结论:检测s PD-L1表达对诊断NSCLC有参考意义,放射治疗前后s PD-L1表达值降低幅度大,且是独立、良好的预后因素。

内皮和造血系统特异性敲除Rictor基因对胎肝造血的影响

目的:研究Rictor基因对胚胎发育过程中胎肝造血的影响。方法:利用Cre-LoxP基因敲除系统,特异性在小鼠内皮(VEC-Cre)和造血(Vav1-Cre)系统敲除Rictor基因;通过流式细胞术分析特异敲除Rictor基因后小鼠胚胎第15 d胎肝中的各系细胞比例的变化,并进一步分析造血干细胞的变化。结果:利用VEC-Cre和Vav1-Cre小鼠敲除Rictor基因后,胎肝中各系细胞比例均有所减少,B细胞比例的减少较为明显,造血干细胞比例也明显减少。结论:Rictor基因敲除损害胎肝组织中造血干细胞的产生和各系细胞的分化。

应用OP9/OP9-DL1阐明小鼠8.5天胚胎的淋系潜能

胚胎时期淋巴细胞的发生位点一直存在争议。为明确能自主产生淋系的解剖部位,本研究选取小鼠8.5天胚胎的卵黄囊(胚外)和脏壁层(胚内体系)作为实验对象,此时血液循环尚未建立。用集落形成实验检测脏壁层和卵黄囊的造血集落,用OP9共培养检测脏壁层和卵黄囊的B淋巴细胞,用三步法检测脏壁层和卵黄囊的T细胞生成。结果表明:在标准的集落形成实验中,两者均能产生典型的造血集落,但其类型有差异。通过OP9共培养发现:脏壁层可产生B淋巴细胞,它们表达B220、CD19和IgM。采用三步法在OP9-DL1上诱导脏壁层至第16天,可产生CD44-/CD25+幼稚T细胞前体以及CD4+/CD8-单阳性T细胞。然而,上述共培养体系均不能诱导卵黄囊产生B和T淋巴细胞。结论:与卵黄囊相比,脏壁层具有较强的体外淋系分化潜能。今后,应用新的模式动物有望获得更可靠的体内证据,以解答淋系起源这一关键科学问题。

结直肠癌早期检测的基因标志物

研究表明,肿瘤的发生和发展与癌基因和抑癌基因有着密不可分的关系。随着分子生物学理论和技术的发展,对癌基因和抑癌基因的检测已成为肿瘤临床预警和诊断的重要途径。自Fearon和Vogelstein 1990年提出结直肠癌发生的分子模型以来,结直肠癌发病的分子机制不断被阐明,通过对与结直肠癌相关的基因改变的检测可以为结直肠癌早期预警提供帮助。尤其是对具有家族病史的人进行相关基因改变的检测,检出率已经达到相当高的水平。本文对近年来被认为与结直肠癌相关的基因作一综述。

小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特点

目的：系统地考察小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特征。方法：应用体外集落形成实验、脾结节形成实验、基质细胞OP9或OP9-DL1共培养体系，分别考察胚胎期10．5d（E10．5）和11．5d（E11．5）小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞和淋系祖细胞潜能。结果：小鼠胚胎循环血中含有各类髓系祖细胞，E11．5的小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞的数量显著增加；同时循环血细胞经体外诱导可产生B、T淋巴细胞。结论：小鼠E10．5-E11．5的胚胎循环血中存在丰富的具有髓系和淋系潜能的前体细胞。

循环肿瘤细胞动态变化对转移性乳腺癌患者治疗反应及预后的预测价值

目的探讨循环肿瘤细胞（CTC）动态变化对中国转移性乳腺癌患者治疗反应及预后的预测价值。方法自2010年3月至2011年1月从中国6个乳腺肿瘤中心共入选300例转移性乳腺癌患者，在转移性乳腺癌患者开始新的全身治疗前（基线）、治疗3～4周以及6～8周通过CellSearch系统进行外周血CTC检测。用Kaplan-Meier方法绘制无进展生存（PFS）曲线，通过Log-Rank检验分析CTC动态变化对PFS改善的提示作用。结果中位随访36．86周。基线CTC≥5个／7．5ml、在治疗3～4周时CTC数目降低至〈5个／7．5ml的患者的中位PFS时间比CTC持续≥5个／7．5ml的患者显著延长（30．4比14．1周，P=0．010），并且与基线CTC〈5个／7．5ml的患者差异无统计学意义（30．4比42．0周，P=0．780）。治疗6～8周时各组PFS比较结果与治疗3～4周时一致，基线CTC≥5个／7．5ml、在治疗6～8周时CTC数目降低至〈5个／7．5ml的患者的中位PFS时间比CTC持续≥5个／7．5ml的患者显著延长（33．4比8．9周，P=0．000），并且与基线CTC〈5个／7．5ml的患者差异无统计学意义（33．4比42．0周，P=0．950）。结论CTC动态变化能够预测患者疾病进展风险的改善，在治疗监测中具有重要意义。

肿瘤液体活检的进展及其在精准医疗中的应用

恶性肿瘤是异质性最明显的人类疾病，通过分子诊断指导患者个体化的精准治疗，已逐渐成为肿瘤临床治疗的共识。然而，肿瘤在时间和空间上的异质性及组织标本不易获取的现实使液体活检的作用和价值越来越凸显。可用于液体活检的材料主要有循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞及细胞外囊泡等，它们各具优缺点，可以互为补充，准确、全面地反映肿瘤的特性，更好地指导患者的个体化精准治疗。本文将详述液体活检领域的研究进展，并以此阐明液体活检在肿瘤精准医疗中的重要作用。

下调LINE-1编码蛋白ORF-1p对肺癌细胞A549生物学特征的影响

目的:探索逆转座子LINE-1编码的ORF-1p在肺癌发病过程中的分子机制。方法:利用RNAi技术,在肺癌细胞A549中下调LINE-1编码蛋白ORF-1p,随后对下调后的A549细胞的生物学特征进行细胞增殖(MTT方法)、细胞周期(流式细胞技术)以及集落形成(软琼脂克隆形成试验)等分析,观察细胞生物学特征的改变。并利用报告基因,进一步对细胞周期相关蛋白进行分析。结果:在A549细胞中,下调ORF-1p后细胞的增殖能力明显下降(P<0.05),细胞周期出现S期明显阻滞(P<0.05),肿瘤细胞的集落形成能力明显减弱(P<0.05),p15/p21报告基因表达显示,两种蛋白被显著上调。结论:下调LINE-1基因编码蛋白ORF-1p能够抑制肺癌细胞的生长以及肿瘤的形成。

不同分子亚型晚期乳腺癌患者血清HER2ECD的表达及意义

目的探讨不同分子亚型晚期乳腺癌患者血清人表皮生长因子受体2（HER2）配体结合域（ECD）的表达及意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测322例晚期乳腺癌患者的血清HER2ECD水平，分析其与临床病理特征的关系及意义。结果55．9％（19／34）LuminalA型、42．7％（44／103）LuminalB—HER2（-）型、70．6％（60／85）LuminalB—HER2（＋）型、73．8％（45／61）HER2过表达型、23．1％（9／39）三阴型患者ECD≥15μg/L，各分子亚型间的差异有统计学意义（P〈0．001）。患者的血清HER2ECD的阳性检出率与组织学HER2状态、转移器官数、内脏转移情况、CA15—3及CEA水平具有相关性。组织学HER2阳性靶向治疗有效的患者治疗后ECD检测中位值较疗前下降（P〈0．05）。结论不同分子亚型晚期乳腺癌患者的血清HER2ECD阳性检出率不同，血清HER2ECD水平除能在一定程度上反映组织学HER2状态外，同时能较好地反映不同分子亚型乳腺癌患者的肿瘤负荷，并且检测值的动态变化与靶向治疗疗效具有一定的相关性。

主动脉-性腺-中肾区、卵黄囊和循环血来源的CD41^＋细胞分化潜能比较

目的比较小鼠胚胎不同造血组织来源的CD41^＋细胞向造血、间质、内皮细胞分化的潜能。方法取小鼠胚胎孕11d主动脉-性腺-中肾（AGM）区、卵黄囊（YS）和循环血（CB）来源的造血细胞经流式细胞术分选获得CD41^＋细胞，并检测CD41^＋细胞中CD45和c．kit的表达；采用IL-3、骨形态发生蛋白4（BMP-4）预处理半固体培养法评估CD41^＋细胞造血分化潜能的差异；采用荧光免疫法检测CD41^＋细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，间质细胞标志）的表达；采用向内皮细胞分化诱导的培养条件观察其内皮分化潜能。结果在AGM区、YS、CB来源的CD4l^＋细胞中，CD45^＋细胞比例分别为51．9％、45．8％、22．2％，c-kit^＋细胞比例分别为40．0％、39．6％、36．2％。在IL-3刺激后，与未刺激组相比AGM、YS、CB来源的CD41’细胞总的造血细胞集落形成数量均显著增加[（14．1=k1．9）对（1．2＋0．2）；（32．4士1．1）对（18．4士2．2）；（41．84-0．9）对（10．44-1．8）]（P〈0．01）。BMP-4刺激后，与未刺激组相比：AGM、YS来源的CD41’细胞生成CFU-Mix的数量下降[（0．54-0．6）对（3．2士0．8）；（1．3＋0．7）对（7．4土1．7）]（P〈0．01）；但CB来源的CD41^＋细胞生成CFU．Mix的数量无明显变化[（2．54-0．5）对（3．94-1．5）]（P〉0．01）。AGM、YS来源的CD41^＋细胞高表达α-SMA，但CB来源的CD41^＋细胞低表达d-SMA。结论小鼠胚胎不同造血组织来源的CD41^＋细胞在免疫表型、造血细胞集落形成及细胞因子刺激应答方面存在明显差异。