Ⅰ群4型禽腺病毒Y17215-1株体外增殖规律及免疫原性研究

为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性,本研究以LMH细胞为模型,摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间;通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡,测定其免疫原性。结果显示:Y17215-1株0.1 MOI接种LMH细胞,培养48~72 h病毒滴度达到峰值108.625 TCID_(50)/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性,LD_(50)为103.000 TCID_(50)/0.2 mL。以10^(7.676) TCID_(50)的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡,免疫后7 d 100%试验鸡产生中和抗体,14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(10^(7.676) TCID_(50)/羽),免疫后7 d 70%试验鸡产生中和抗体,21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD_(50)的Y17215-1株进行攻毒,活毒和灭活疫苗的保护率均为100%。以上结果表明:Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性,可以作为候选疫苗毒株。

2016—2018年天津地区规模化猪场猪主要病毒性腹泻病原的调查与分析

为了确定2016—2018年天津地区规模化猪场流行的猪腹泻病主要病原,试验共采集腹泻样品1519份,应用RT-PCR的方法进行病原检测,检测病原包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),对样品的PEDV、PDCoV、TGEV和RV的阳性率进行统计,并按不同年份、不同地区、不同月份、不同季节及猪群腹泻病原混合感染和单一感染情况进行统计分析。结果表明:PEDV是导致天津地区猪群发病的主要病原,2016,2017,2018年阳性率分别为56.60%、45.44%、55.78%;其次为PDCoV,阳性率分别为25.24%、26.64%、33.33%;TGEV阳性率分别为7.46%、5.98%、7.48%;RV阳性率分别为5.54%、5.27%、5.10%。统计不同地区腹泻病毒的感染情况,发现宁河区的PEDV阳性率较高,为13.03%,静海区的TGEV阳性率是2.17%;RV和PDCoV在宝坻的阳性率较高,分别是1.38%和8.10%。PEDV和RV在春季高发,阳性率是60.06%和5.91%;TGEV在夏季阳性率较高,为7.33%;PDCoV在秋季阳性率较高,为40.06%。在被检样品中,混合感染病例占6.91%(105/1519),其中PEDV和RV混合感染率最高,为2.11%(32/1519)。说明天津地区猪腹泻病病原种类多且感染情况复杂,给该地区猪场的腹泻病防控工作带来了严峻的挑战。

天津地区猪链球菌3型菌株的致病性及耐药特性研究

试验旨在对分离自天津地区发病猪场的7株猪链球菌3型菌株(Streptococcus suis type 3,SS 3)进行致病性和耐药特性研究。应用剂量为1.0×10^7、1.0×10^8和1.0×10^9 CFU/只的细菌对小鼠进行致病力研究,用PCR方法检测7株SS 3型菌株的毒力基因mrp、ef、sly、gdh、gapdh、fbps和orf 2,并对这7株SS 3型菌株进行药物敏感试验。致病力试验结果显示,接种剂量为1.0×10^9和1.0×10^8 CFU/只时分别有6和3株SS 3型菌株可使小鼠100.0%(5/5)发病死亡,接种剂量1.0×10^7 CFU时仍有1株SS 3型菌株可使80.0%(4/5)小鼠发病死亡,这7株SS 3型菌株对小鼠的致病力依次为R15056>R15042=S15030>Y12024=Y09011>Y13125>Y13164。毒力基因检测结果表明,共有3种毒力基因型,R12024、Y13164、R15042和S15030株为gdh、gapdh、fbps和orf 2毒力基因阳性,Y13125和R15056株为sly、gdh、gapdh、fbps和orf 2毒力基因阳性,Y09011株为gdh、fbps和orf 2毒力基因阳性。药物敏感性试验结果显示,7株SS 3型对头孢喹肟相对最敏感,其次为阿莫西林、环丙沙星和磺胺间甲氧嘧啶钠,但对强力霉素100.0%耐药,且所有菌株均呈现3重以上的耐药性。本研究为进一步开展天津地区SS 3型流行特点及致病机理研究奠定了基础,可为天津地区SS 3型菌株的综合防控提供理论指导。

猪链球菌2型感染昆明小鼠模型的建立及评价

为建立稳定的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)人工发病模型,本试验以天津某发病猪场分离的SS2 Y15293株为研究对象,经腹腔注射感染昆明小鼠,测定其LD_(50),确定造模感染剂量,通过观察感染后小鼠的临床症状和病理变化,测定试验期间各组小鼠体重和采食量的变化及细菌回归等试验对模型进行评估。结果显示,SS2 Y15293株致昆明小鼠的LD_(50)为6.7×10~7 CFU/mL。以1个LD_(50)的剂量攻毒,与对照组相比,试验小鼠主要发病表现为攻菌后24 h出现精神沉郁、被毛逆立、眼睛有分泌物,72～96 h出现头颈歪斜、翻滚、震颤等神经症状,死亡高峰在48～72 h。3次重复试验中,试验组小鼠的发病率均为100%,死亡率为50%～70%,神经症状小鼠出现比率20%～30%。与对照组相比,试验组小鼠采食量和体重显著下降(P<0.05),临床症状分值显著升高(P<0.05)。组织病理检查发现,试验组小鼠心脏、肺脏组织均有不同程度出血、炎性细胞浸润;脑膜炎,脑室出血,充满炎性细胞。细菌回归试验结果表明,试验组死亡小鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有细菌定植,且形态、染色和分子生物学特性与攻毒菌一致。以上结果证实,SS2 Y15293株能感染昆明小鼠并致其发病,感染动物发病规律性强,重复性好,临床症状典型,说明SS2 Y15293株感染昆明小鼠可作为SS2的候选人工感染模型。

一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确天津市某猪场保育猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其致病力等生物学特性,将猪场一头发病猪扑杀,无菌采集病料于哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,对分离的疑似菌株进行形态学观察、生化试验、16S rDNA序列分析和血清型鉴定,确定分离菌株为猪链球菌8型,命名为TJS31。药敏试验结果显示,TJS31株对8种受试药物耐药,4种受试药物中介,1种受试药物敏感。致病性试验结果显示,TJS31株经腹腔接种昆明小鼠,24 h内可以引起小鼠出现精神萎靡、扎堆、呼吸急促、发抖、运动迟缓、死亡等,LD50为1.8×10^(8) CFU/mL。毒力基因检测发现TJS31的毒力基因型为sly^(+)/gdh^(+)/orf2^(+)/gapdh^(+),不携带mrp、epf和fbps基因。研究结果丰富了我国猪链球菌病病原的生物学资料,为猪链球菌8型的防控提供了依据,也为深入开展猪链球菌8型的致病机制和耐药机理奠定了基础。

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

为了获得在体外表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,研究其免疫原性,试验根据GenBank公布的国内PCV2-Cap蛋白基因序列特点,结合毕赤酵母密码子偏好对Cap基因进行优化,合成目的基因后,构建分泌型表达载体pPIC9K-Cap,转化毕赤酵母GS115后,经诱导表达获得重组Cap蛋白。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后检测抗体水平。结果表明:含有PCV2-Cap基因的质粒成功转化到酵母菌基因组中,重组酵母菌株在30℃,经1%甲醇诱导表达96 h后,培养液中能够检测到33 ku的重组蛋白,重组蛋白表达量为155μg/mL,占培养上清液总蛋白的9.362%,Western-blot试验结果显示重组蛋白具有良好的抗原活性。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后,能够刺激豚鼠产生特异性抗体且与接种0.3头份/只剂量的市售PCV2灭活疫苗产生的抗体水平无显著差异(P>0.05)。说明成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2-Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性。

禽腺病毒血清4型Y17215-1株对SPF鸡胚及SPF鸡的致病性研究

为了探究一株禽腺病毒血清4型(FAdV-4)天津分离株Y17215-1对SPF鸡胚及SPF鸡的致病力,试验将Y17215-1株(病毒效价为1×10^(6.5) TCID_(50)/0.1 mL)经卵黄囊和尿囊膜两种接种途径分别接种6,10日龄SPF鸡胚,经滴鼻点眼和肌肉注射两种途径分别接种7,14,21日龄的SPF鸡,观察SPF鸡胚死亡情况和病理变化情况,统计SPF鸡发病死亡情况,检测试验鸡不同组织及不同采集时间的泄殖腔中的病原,观察试验鸡的临床病变和组织病理学变化。结果表明:两种接种途径均可致鸡胚死亡,经卵黄囊途径接种致死的鸡胚可见胚体全身出血,经尿囊膜途径接种致死的鸡胚尿囊膜明显增厚;两种接种途径均可引起不同日龄SPF鸡发病和死亡,且肌肉注射组试验鸡较滴鼻点眼组试验鸡发病快、病程短,致死率高,发病鸡临床表现为精神沉郁、采食量明显下降、排黄绿色粪便。心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃等器官病原检测结果均为阳性,各试验组的泄殖腔拭子样品在感染后第2天即可检测到FAdV-4。剖检可见典型的心包积水、肝脏肿大、肾脏肿大等病变,肝细胞内有嗜酸性包涵体。说明FAdV-4天津分离株Y17215-1对鸡胚及鸡具有较高致病性。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测试剂盒的研制及应用

为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术(LFD),优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病病毒(MDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H9亚型(AIV(H9))、禽呼肠孤病毒(ARV)、FAdV标准株(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)、鸡大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(SA)、鸡白痢沙门氏菌(SP)、鸡毒支原体(MG)的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4℃条件下至少可以保存3个月,在-20℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%(21/117)。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏、准确的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)分子检测方法,根据PDCoV M基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了PDCoV M基因Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.998;敏感性好,最低可检测到10 copies/μL的PDCoV M基因标准品;特异性试验结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及大肠埃希菌K88菌株均无交叉反应;重复性试验变异系数低于2%,表明重复性良好。对121份临床样本进行检测,阳性检出率为53.7%(65/121),随机选择10份阳性样品的扩增产物进行测序分析,进一步证实扩增产物中含有PDCoV。该方法具有敏感性高、特异性强、用时短和高通量等特点,适用于PDCoV的定量检测与分子流行病学调查,为PDCoV的准确定量及进一步研究奠定了基础。

猪δ冠状病毒致病机制研究进展

猪δ冠状病毒(PDCoV)是引起猪腹泻性疾病的猪肠道主要病毒之一。PDCoV致病机制相关的研究主要集中于入侵细胞、逃逸宿主细胞天然免疫应答、诱导宿主细胞凋亡,以及影响该病毒复制的其他分子机制。目前对其致病机制的了解较少,尚无有效防治该病毒的疫苗和药物。随着相关研究进一步深入,剖析PDCoV编码蛋白结构及其影响PDCoV复制的多种途径,探索影响PDCoV复制的miRNA及相关分子机制,或可为深入认识PDCoV致病机制及研制有效防治该病毒的疫苗和药物提供重要理论依据。此外,对不同冠状病毒之间致病机制的共性与特性进行比较研究,也将对冠状病毒的抗病毒药物或疫苗的研制具有重要意义。

复合多肽制剂对肉鸡免疫功能的影响

旨在探索复合多肽制剂对于肉鸡免疫功能的影响。选取1日龄肉鸡120羽,随机分为4组(每组3个重复),于6日龄和13日龄,分别采用喷雾的方式添加0.05 mL/只(低剂量)、0.1 mL/只(中剂量)、0.15 mL/只(高剂量)的复合多肽制剂,空白对照采用生理盐水喷雾。于7、14、21、28、35、42日龄用HA/HI方法检测肉鸡新城疫病毒(NDV)抗体滴度。21、42日龄测定肉鸡免疫器官指数。采用ELISA测定7、14、21日龄肉鸡血清中细胞因子含量。复合多肽制剂能显著提高肉鸡新城疫病毒抗体水平(P<0.05),其中14日龄低剂量组和21、28日龄低剂量组和中剂量组新城疫病毒抗体滴度显著升高(P<0.05),但其对肉鸡免疫器官指数无显著影响(P>0.05)。复合多肽制剂能影响肉鸡血清细胞因子的表达水平,7日龄各试验组肉鸡血清中IL-4含量显著升高且与给药剂量正相关(P<0.05),7、14日龄试验鸡血清中IL-6含量显著降低(P<0.05),14、21日龄各剂量组IL-10含量显著下降(P<0.01)。结果表明,复合多肽制剂对肉鸡的免疫功能均具有一定的调节作用,低剂量复合多肽制剂上调新城疫病毒抗体水平效果最好。

猪葡萄球菌437-2株的分离鉴定及生物学特性

从发生渗出性皮炎的仔猪体内分离到1株细菌,根据其形态特征和生化特性,结合16S rRNA核苷酸序列分析,确定为猪葡萄球菌,并命名为437-2株。用1×10^(9)CFU/mL剂量的该菌株经皮下感染小鼠、仔猪,均能引起注射部位皮肤脱毛、破溃、有炎性渗出物、结痂等病变,病理学观察可见表皮局部上皮细胞消失、皮下小血管充血和炎症细胞浸润。应用PCR方法检测分离株携带的表皮脱落毒素相关基因并测序,结果显示该菌株携带表皮脱落毒素ExhD和ShetA基因。药敏试验结果显示该菌株对多种抗生素呈现不同程度的耐药,但对痢菌净、氟苯尼考、头孢曲松钠、阿米卡星敏感。上述结果为猪葡萄球菌引起的仔猪渗出性皮炎的病原学、发病机理及诊断靶标筛选等方面的研究提供了参考。

猪德尔塔冠状病毒感染仔猪引起肠道组织病理学变化及其对致病相关因子的影响

为了探究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染仔猪肠道引起的组织病理学变化及其在肠道中复制并导致肠道出现炎症病变的作用机制,本研究使用PDCoV天津地区分离株TJ1经口服感染10日龄仔猪,在攻毒后第4天对仔猪进行剖检,通过病理组织学观察发现,空肠、回肠、结肠、盲肠组织主要病变表现为肠黏膜间质、黏膜固有层、黏膜下层弥漫性炎症细胞浸润,局部黏膜绒毛萎缩等。通过荧光定量PCR试验,对肠道组织中PDCo V M基因、天然免疫基因IFN-α、IFN-β、DDX58、STAT2与炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA表达量进行检测,结果显示,PDCoV在4种肠组织中通过抑制宿主细胞天然免疫应答实现自身复制,且在空肠、回肠、结肠中通过增强TNF-α、IL-6的表达促进肠道炎症病变的发生。本研究结果可为猪德尔塔冠状病毒致病机制的研究提供理论依据。