数字PCR技术在动物疫苗研究中的应用前景

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术是基于“有限稀释”和“泊松分布”原理迅速发展的第三代PCR技术,无需标准品即可实现样品的绝对定量,灵敏度高、操作简单,在疫病检测、转基因鉴定、食品检测等方面得到快速发展,而在动物疫苗研究领域也被越来越多用于质控、筛查和定量。本文从动物疫苗研究的角度,阐述了数字PCR在动物疫苗基因变异检测、基因定量、效价测定、疫苗效果评价等方面的发展潜力。该技术将有助于解决动物疫苗研究过程中的病毒生长曲线和疫苗效价测定以及基因变异分析等重点难点问题,未来将成为疫苗研发的有力工具。

表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的存留时间分析

研究E0-E2基因和表达蛋白及抗体水平在小鼠体内的最长存留时间,以确定表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗(rAd-E0-E2)在小鼠体内的存留规律。本试验选用30只SPF级别的健康小鼠,随机分为A、B组,各免疫组以1×106 IFU/只剂量接种rAd-E0-E2,对照组注射生理盐水。A组20只于接种后不同特定时间(2只/次)采集血液和组织进行PCR和IFA检测E0-E2基因及表达蛋白残留情况;B组10只于接种后1、3、5、7、10、14、21、28d采集血清检测猪瘟抗体水平。PCR和IFA检测显示,在接种12、24、36h后肝、脾、肾组织和血清中E0-E2基因和蛋白检出率为100%,接种48h后小鼠肝、脾组织检出率为50%,肾组织和血清检出率为100%。接种72h以后,小鼠血液和组织检测均为阴性。接种后7d试验组体内抗体阳性率为40%,接种后10d小鼠体内抗体阳性率为100%,抗体阻断率在43%～51.2%,接种后28d,猪瘟抗体阳性率为100%,抗体阻断率在75.6%～87.5%。表明rAd-E0-E2在小鼠体内的存留时间最长72h,接种时间与E2抗体水平呈正相关。

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体(MS)活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗(MS-H株),B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示:三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示:在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。

基于VP6蛋白的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立牛轮状病毒(BRV)血清抗体的检测方法,从病料中克隆牛轮状病毒VP6基因,构建其表达载体,利用原核表达技术表达重组VP6蛋白,建立牛轮状病毒血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组VP6蛋白大小为40 ku,以包涵体形式表达,Western blot证实重组VP6蛋白有良好的反应原性;以4μg/mL浓度的抗原包被酶标板,一抗血清50倍稀释,酶标二抗稀释10000倍稀释,为最佳工作条件,阴阳临界值为0.233,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。建立的检测BRV抗体的间接ELISA可用于临床BRV感染的检测。

2022年我国部分省份猪瘟猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病流行病学调查

为了解我国不同地区不同生长阶段及不同规模猪场猪群的猪瘟CSF猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)流行情况,对2022年收集的6172份血清样品和2301份病原检测样品分别进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及伪狂犬病病毒(PRV)抗体及抗原检测。结果显示:CSFV、PRRSV、PRV-g E抗体阳性率分别为94.15%、63.06%和8.55%,病原检出率分别为0.13%、8.50%和0.80%。育肥场的PRRSV抗原检出率最高,且S/P≥2.5占比最高;5~6胎母猪的PRV-g E抗体阳性率(60.87%)显著高于其他生长阶段猪群(P<0.05)。结果表明:CSF整体免疫防控效果良好,疫情发生风险较低;PRRSV免疫抗体阳性率不高,特别要警惕育肥场13~21周龄育肥猪的PRRSV感染;高胎龄母猪的PRV带毒情况严重,建议做好后备猪的更新与高胎次母猪的淘汰工作,并大力推进PR净化。

鸡源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

为探究山东、安徽、河北、宁夏等地区育成阶段蛋鸡群出现的一种以输卵管干酪物为主要病理特征的疾病病因,该研究对临床病理样本进行细菌分离培养,并对分离菌株进行形态学、分子生物学、血清学、动物回归试验和药敏试验等方面的研究与分析。结果显示,13株分离菌株均为鸭疫里默氏杆菌,以血清型7型为主,其OmpA基因已进化为2大分支,动物回归试验可复制出相同临床症状,药敏试验显示分离菌株对氟苯尼考、多西环素、大观霉素、头孢类药物较为敏感。该研究结果为鸭疫里默氏杆菌从不同易感宿主上的分离鉴定及菌株的遗传进化分析提供了理论基础,对家禽感染鸭疫里默氏杆菌的预防与控制提供了参考依据。

表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组HVT活疫苗免疫效力评价

为在SPF鸡和商品蛋鸡上评价一株表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素基因的重组HVT(r HVT-H9)活疫苗的免疫保护效力,试验将1日龄SPF鸡分为r HVT-H9疫苗组、灭活疫苗组和空白对照组,共3组(n=60,每组20只);1日龄商品蛋鸡除上述三组外另增加r HVT-H9疫苗与禽流感灭活疫苗(H9亚型,F株)联合免疫组,共4组(n=80,每组20只)。免疫后,通过血凝抑制试验检测血清中针对H9亚型AIV的抗体效价;并于免疫后28 d,将全部试验组及空白对照组以H9亚型AIV F株进行静脉注射攻毒。攻毒后第3、5天分别采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况;并于攻毒后第10天将全部试验鸡进行剖检。结果显示:SPF鸡r HVT-H9疫苗组能达到100%免疫保护,而灭活疫苗组仅能达到80%保护;商品蛋鸡r HVT-H9疫苗组保护率为40%,灭活疫苗组保护率为70%,但联合免疫组能达到100%的免疫保护。因此,该重组病毒r HVT-H9疫苗可作为H9亚型禽流感的有效疫苗候选株,与现有商品化禽流感H9亚型灭活疫苗联合使用,效果更佳,为其防控提供一定的技术支持。

2020—2022年我国部分地区鸡传染性喉气管炎流行病学调查

为了解我国部分地区鸡传染性喉气管炎(ILT)的流行特点,2020-2022年对安徽、北京、福建等29个省级行政区部分养殖场(户)送检的47 210份疑似鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染样品进行了PCR检测,并对检测结果进行了空间、时间、群间分布统计分析。结果显示:共检出413份ILTV阳性样品,阳性检出率为0.87%;2020-2022年ILTV阳性检出率分别为1.41%、0.72%和0.56%;每月均有ILTV检出,10月-次年5月阳性检出率较高;大多数省份均有ILTV阳性检出,养鸡密集省份的阳性率较高;4种品种鸡均易感,其中黄羽鸡(1.56%)和蛋鸡(1.11%)阳性率较高;> 3~9以及> 18~24周龄鸡群阳性率较高。结果说明:我国鸡群中ILTV流行范围较广,阳性检出率呈逐年下降趋势,低温季节和小周龄鸡群感染风险相对较高,建议加强鸡群的饲养管理,并持续开展ILT流行病学监测,以期为ILT防控策略调整和研发新型疫苗奠定基础。

禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗安全性、最小免疫剂量及免疫效力试验

为确定禽脑脊髓炎(AE)、鸡痘(AP)二联活疫苗的安全性、最小免疫剂量及免疫效力,自制3批二联活疫苗进行研究。结果显示,鸡接种10倍剂量疫苗后精神、食欲及发育均正常,临床表现和剖检均无异常;AEV YBF02株的最小免疫剂量为100 EID50,鸡痘鹌鹑化弱毒株的最小免疫剂量为10 EID50;3批疫苗AEV YBF02株的病毒含量均≥103.2EID50/羽份,鸡痘鹌鹑化弱毒株的病毒含量均≥103.4EID50/羽份,攻毒后保护指数为89~100。试验表明,自制二联活疫苗安全、有效、质量可控,可用于预防禽脑脊髓炎和鸡痘。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(TJM-F92株)安全性调查及有效性和干扰性试验

为了解我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(TJM-F92株)的安全性、有效性,以便进一步优化免疫程序,利用ELISA抗体检测与现场跟踪调查的方法,进行了弱毒疫苗(TJM-F92株)安全性调查及有效性和干扰性试验。结果显示:弱毒疫苗(TJM-F92株)对母猪的采食量、体温、返情率及死胎与木乃伊胎数量均无影响,免疫后各阶段猪群的免疫抗体均达到了合格水平;弱毒疫苗(TJM-F92株)与猪瘟疫苗(脾苗)同时免疫,两种疫病的抗体水平均表现正常,与分开免疫无明显差异。结果表明,弱毒疫苗(TJM-F92株)具有良好的安全性和有效性,普免不会使母猪出现不良反应,对各阶段猪群都有良好的保护性,同时可与猪瘟脾苗联合免疫。因此,猪场可以按程序对各阶段猪群开展弱毒疫苗(TJM-F92株)免疫,同时可以尝试与猪瘟疫苗同时免疫,以优化猪场免疫程序,节省人力,减少应激。

鹅星状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2017年10月—2019年5月,本实验室从广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等广大养鹅地区采集了67份典型雏鹅痛风样品进行了实验室检测以及病原的分离鉴定,检测结果表明:所有样品中均检测到了鹅星状病毒,并且约有94.03%的样品为两个不同种的鹅星状病毒混合感染。病原分离结果表明:鹅星状病毒FLX株的变异株病毒(命名为SCCD)可以在鹅胚上稳定增殖,并且能稳定致死10日龄鹅胚,致病力较鹅星状病毒FLX增强;新型鹅星状病毒株(命名为SDPD)不能在鹅胚和SPF鸡胚上稳定增殖。病毒的基因组测序结果表明:鹅星状病毒FLX株与鹅星状病毒FLX的变异株病毒SCCD株、新型鹅星状病毒SDPD株全基因组核苷酸相似性分别为89.7%、58.1%,ORF1b基因氨基酸相似性分别为98.4%、61.0%,ORF2基因氨基酸相似性分别为81.0%、42.5%。将新分离的鹅星状病毒株接种1日龄健康雏鹅,结果表明,鹅星状病毒SCCD株和鹅星状病毒SDPD株虽然能使雏鹅发生死亡,引起肝炎、肾肿胀和增重减少等变化,但雏鹅均无典型痛风(脏器尿酸盐沉积)表现,而两种鹅星状病毒株混合攻毒能使44%的雏鹅发生典型痛风,并与临床发病症状一致。因此,临床上引起雏鹅痛风的病原可能是两种鹅星状病毒,即新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒。

基于哺乳动物细胞表达系统的猪瘟基因工程E2亚单位疫苗动物免疫效果评价

猪瘟E2基因工程亚单位疫苗能诱导机体产生抗CSFV中和抗体,被认为是最具应用前景的新型猪瘟疫苗。本研究利用稳定表达重组CSFV E2蛋白的细胞系HEK-293T-E2,制备E2亚单位疫苗并在动物体内检测其免疫原性。结果显示,制备的E2亚单位疫苗能成功诱导试验兔和仔猪产生抗CSFV抗体,相比对照组,试验动物能够抵抗猪瘟标准强毒石门株的攻击,并且没有产生体温升高及其他不良反应,证实了该疫苗的有效性和安全性。本研究为新型猪瘟亚单位疫苗的研发提供了重要线索。

表达猪瘟病毒E0-E2蛋白的重组腺病毒疫苗免疫效力研究

为研究重组猪瘟腺病毒活载体疫苗(rAd-E0-E2株)对猪的免疫保护效力,并确定其最小免疫剂量及免疫期,本研究将40头健康仔猪随机分为8组,每组5头,1~5组为最小免疫剂量测试组,分别接种rAd-E0-E2株活疫苗1/20头份、1/10头份、1/2头份、1头份(1.58×107.0IFU),另设生理盐水对照组。于免疫后7 d、14 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后14 d攻毒;6~8组为免疫期组,分别接种1头份的rAd-E0-E2株活疫苗和1头份的猪瘟活疫苗(脾淋源,C株),于免疫后7 d、14 d、21 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后7个月攻毒。所有试验组猪攻毒后监测体温变化,观察猪瘟临床症状和剖检病变。最小免疫剂量检测结果显示,1/20头份剂量组攻毒后1/5保护,4/5出现高热稽留、典型CSF症状和剖检病变;1/10头份、1/2头份和1头份剂量组攻毒后均5/5保护,体温无明显变化,无猪瘟临床症状和剖检病变。免疫期结果显示,免疫组攻毒后均为5/5保护,且r Ad-E0-E2株免疫后7个月抗体水平高于C株,阴性对照组猪攻毒后均发病。综上所述,疫苗的最小免疫剂量为1/10头份(1.58×106.0IFU),考虑到临床实际应用影响因素较多,为确保免疫效果,将疫苗的使用剂量定为最小免疫剂量的10倍,即1头份。r Ad-E0-E2株活疫苗免疫猪1头份后免疫期至少为7个月。本研究为r Ad-E0-E2株后续应用提供了参考依据。

2019—2021年江苏地区PCV3感染情况调查及其Cap基因的遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在江苏地区规模化猪场的感染及病毒演化情况,对2019—2021年收集的113份临床组织样品进行Cap基因的检测,应用DNAStar和MEGA软件对获得的序列进行遗传演化分析。结果显示:PCV3样品阳性率为37.17%(42/113),猪场阳性率为73.91%(17/23)。对29个阳性样品的PCR产物直接测序,显示核苷酸序列高度同源,同源性为97.3%~100.0%。挑取其中的12个阳性样品,扩增Cap全长序列,连接至pMD19-T平末端载体后测序,显示12条序列的核苷酸同源性为97.5%~99.8%,与国内外其他PCV3毒株Cap基因的同源性为97.0%~100%。遗传演化分析显示,3条序列与国内外PCV3亚群3a的毒株处于一个大的分支,6条序列属于3b,3条序列形成独立的分支(3c)。推导编码氨基酸后对24和27位氨基酸位点进行分析,1条序列为A^(24)K^(27),2条序列为A^(24)R^(27),9条序列为V^(24)K^(27)。本试验丰富了江苏地区PCV3感染的分子流行病学数据,为该地区PCV3感染的综合防控提供了科学依据。

3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解猫细小病毒(FPV)在国内的流行状况及其遗传变异和演化方向,本研究对采集的30份疑似感染FPV的肛拭子进行检测,利用常规方法从中分离并鉴定出3株FPV。然后扩增出3株FPV的VP2基因,利用DNAstar等软件将获得的VP2基因与国内外报道的流行株和疫苗株的VP2基因序列进行比对和遗传进化分析。研究结果显示,本文分离的3株FPV均能在猫肾细胞中良好增殖,并产生典型致细胞病变(CPE),在电子显微镜下呈现典型的细小病毒形态特征。序列比对结果显示,此3株FPV的VP2序列与国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.6%~99.8%和98.5%~99.8%;与疫苗株的VP2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%~99.4%和99.1%~99.5%;进化树分析结果显示,本研究分离的FPV与国内流行株及疫苗株均具有较近的遗传距离,并处于同一拓朴群,但是SH612株和ZZ6293株与疫苗株的距离稍微远些,处于不同的拓朴亚群。本文研究结果丰富了中国FPV的流行病学资料,为进一步研发FPV疫苗提供了参考资料。

检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA方法和HI试验方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709,R^(2)=0.9176,S/P临界值为0.32,临界滴度是1200。经验证,rVlhA-ELISA方法具有良好的特异性、重复性,最低能检出1∶2000稀释的阳性血清。选择国内MG分离株SH/2020-1作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验进行血清样品检测,IDEXX-MG方法作为对照,借助RT-qPCR方法监测MG感染情况。结果表明rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG监测的血清抗体趋势与HI复核结果均一致;rVlhA-ELISA与HI联合判定结果与IDEXX-MG符合率可达91.53%。上述结果显示,本研究建立的rVlhA-ELISA方法和HI试验具有较好的临床应用价值,可以初步应用于MG感染的临床大规模、快速筛查并对结果进行复核。

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。

诱导猪肺泡巨噬细胞CD163受体表达的细胞因子筛选

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)中的CD163受体作为明星分子不仅参与正常的生理活动,而且作为重要的病毒受体介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵宿主靶细胞,因此其表达调控的研究备受关注。为了探讨巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、白介素10(IL-10)、白介素3(IL-3)和地塞米松(dexamethasone)及其组合对PAM中CD163受体表达的促进作用,通过RT-qPCR和免疫荧光染色在原代PAM中从mRNA和蛋白水平对不同因子及其组合中CD163受体的表达情况进行检测。结果显示,M-CSF、GM-CSF、TGF-β1、IL-10、IL-3和dexamethasone都能在一定范围内促进CD163受体的表达,通过组合发现dexamethasone+IL-10对于CD163受体表达的促进作用最为显著,为进一步开展CD163的表达调控研究奠定了基础。

2020年我国部分地区禽偏肺病毒流行病学调查

为调查我国部分地区禽偏肺病毒(a MPV)的感染情况,本研究从福建、四川、广东、江苏4省的8个地区采集鸡、鸭、鹅、鸽的咽喉/泄殖腔双拭子样品共1 920份,利用四重荧光定量RT-PCR方法检测A、B、C、D亚群的aMPV。结果显示,1 920份样品中共检出aMPV阳性样品51份,其中,B亚群39份,C亚群7份,B亚群和C亚群混合感染5份。4个省aMPV的总阳性率为2.67%(51/1 920),各省aMPV阳性率为0.63%~3.96%;场点阳性率为21.21%(7/33),其中批发市场、零售市场、养殖场和屠宰场场点阳性率分别为80%(4/5)、23%(3/13)、0(0/14)和0(0/1)。鸡a MPV阳性率为3.42%(47/1 373),其中B亚群阳性率为2.78%(38/1 373),C亚群阳性率为0.29%(4/1 373),B和C亚群混合感染阳性率为0.36%(5/1 373),未检测到A和D亚群aMPV。鸽B亚群阳性率为2.63%(1/38),未检测到A、C和D亚群aMPV。鸭C亚群阳性率0.64%(3/466)。研究表明,我国鸡、鸭、鸽中存在aMPV感染,鸡为其主要宿主,B亚群aMPV为优势流行亚群,并首次发现国内鸡群存在B、C亚群aMPV的混合感染。本研究不仅丰富了a MPV的流行病学资料,也为其疫苗研制提供数据参考。

华东地区猫杯状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解猫杯状病毒(FCV)在中国华东地区的流行状况及其遗传变异和演化特征,本研究采集30份疑似感染FCV的猫眼鼻拭子,通过常规方法分离鉴定出9株FCV,经RT-PCR和测序获得了FCV VP1的基因序列,与文献报道的流行株、高致病力FCV(VS-FCV)株和疫苗株VP1基因同源性进行比对及遗传进化分析。结果显示,9株华东地区分离株VP1基因核苷酸序列同源性为70.9%~93.3%,分离株与流行株VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为66.9%~84.8%和78.0%~91.9%,且大部分分离株与国内流行株处于同一分支;与VS-FCV VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为73.9%~80.3%和82.2%~89.8%,其中只有FCV AH1分离株与VS-FCV-5株处于同一分支;与国内疫苗株VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为73.9%~80.3%和82.2%~89.8%,其中只有FCV AH1株与国内疫苗株Vaccine-FCV-D90357处于同一分支。以上结果首次表明,华东地区FCV不断发生变异,是导致传统疫苗不能达到很好免疫保护效果的原因。本研究丰富了中国FCV的流行病学资料,为FCV疫苗研发提供了参考。