Dynactin调控α-微管蛋白乙酰化和微管修饰的机制研究

目的探讨动力蛋白激活蛋白Dynactin对α-微管蛋白乙酰化水平和微管修饰的调控作用。方法利用蛋白印迹方法检测Dynactin亚基p150^(Glued)N端缺失(KO)和对照(Ctrl)小鼠原代皮质神经元和原代成纤维细胞中α-微管蛋白乙酰化水平和总蛋白水平。利用免疫荧光染色方法观察Ctrl和KO原代成纤维细胞中微管乙酰化百分比的变化情况。结果p150^(Glued)N端缺失不影响原代皮质神经元中Dynactin及乙酰化α-微管蛋白水平。与Ctrl小鼠原代成纤维细胞比,KO原代成纤维细胞中Dynactin亚基蛋白水平降低,且乙酰化α-微管蛋白水平明显升高。此外在KO原代成纤维细胞中也观察到微管乙酰化的百分比显著增多。结论Dynactin功能缺失可显著上调乙酰化α-微管蛋白水平,增加细胞微管乙酰化的百分比。

佩里综合征动物模型多巴胺转运体缺陷的超高分辨率显微成像研究

目的探讨佩里综合征模型小鼠中脑多巴胺能神经元纹状体多巴胺转运体(DAT)缺陷的亚细胞机制。方法利用免疫荧光染色法,采用Airyscan超高分辨率显微成像和三维成像技术,检测佩里综合征模型小鼠中脑多巴胺能神经元中DAT表达分布情况。结果佩里综合征模型小鼠中脑多巴胺能神经元部分树突发生病理性肿胀,而在这些肿胀中有荧光强度显著增加的异常内质网结构,以及异常增多的溶酶体。大量的DAT呈点状定位于树突异常肿胀内,且有相当数量的DAT与异常内质网结构,或异常增多的溶酶体共定位。结论佩里综合征模型小鼠中脑多巴胺能神经元中DAT潴留于树突肿胀内质网中,不能有效的输出和运送至纹状体发挥功能;同时树突肿胀中DAT降解增多,进一步加剧了纹状体DAT缺陷。

内质网应激IRE1α/XBP-1通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激1型跨膜蛋白激酶α(IRE1α)/X盒结合蛋白1(XBP-1)通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法利用内质网应激诱导剂Thapsigargin观察小鼠原代成纤维细胞中IRE1α/XBP-1通路活性。利用IRE1α抑制剂KIRA8探究IRE1α/XBP-1通路在原代中脑多巴胺能神经元变性死亡中作用。结果相比于未处理组细胞,Thapsigargin处理后原代成纤维细胞中内质网应激IRE1α/XBP-1通路明显上调。Thapsigargin处理可显著降低原代中脑多巴胺能神经元的存活率,而KIRA8处理可显著改善Thapsigargin导致的多巴胺能神经元存活率降低。结论内质网应激通过IRE1α/XBP-1通路介导多巴胺能神经元的变性死亡。

PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元死亡中作用

目的 探讨PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法 利用小鼠原代培养成纤维细胞,应用Western blot和免疫荧光染色法,观察内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin)对PERK通路的激活,利用小鼠原代培养中脑多巴胺能神经元,应用TH免疫荧光染色法对存活的中脑多巴胺能神经元进行计数,以观察PERK抑制剂GSK2606414对长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡的影响。结果 在Thapsigargin处理后的原代成纤维细胞中p-PERK、p-eIF2α、ATF4水平均显著升高,Thapsigargin诱导中脑多巴胺能神经元死亡,PERK抑制剂GSK2606414可显著减少长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡。结论 内质网应激激活PERK通路;长时程内质网应激导致中脑多巴胺能神经元死亡,抑制PERK通路的激活可以缓解长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元死亡,PERK通路参与了长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元变性死亡。

肌少症动物模型研究进展

肌少症(sarcopenia)是一种与增龄相关的,进行性、全身性的骨骼肌质量和功能衰退的疾病。年龄增加,运动减少,营养摄入不足,神经、免疫、内分泌对骨骼肌的调控异常,以及肌纤维的合成代谢障碍和程序性死亡,均与发生发展密切相关^([1])。但是目前肌少症的具体发病机制尚不清楚,临床上干预和治疗肌少症的手段还很有限,因此亟需创建肌少症动物模型,以开展有关肌少症病理生理基础、分子机制及潜在干预靶点的临床前研究。

LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体2含量及机制研究

目的探讨LRRK2的表达或功能异常对纹状体神经元多巴胺受体D2R含量的影响,以及LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体D2R含量的机制。方法利用组织免疫荧光染色法检测LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S基因敲入小鼠和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中D2R含量的改变;并利用Cathepsin D免疫荧光标记溶酶体,检测LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变对蛋白降解的影响。结果LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体中D2R荧光强度均显著下降;LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体数目和大小均显著增加,与Cathepsin D共定位的D2R显著增加。而LRRK2基因敲除小鼠纹状体神经元中溶酶体数目和大小与野生型相比差异无统计学意义。结论LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变导致纹状体D2R的含量下降;LRRK2G2019S和R1441C突变提高小鼠纹状体神经元降解,促使D2R降解加强,从而使得纹状体神经元内D2R含量下降。

p150glued对脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入的调控

目的 探讨运动神经元病相关蛋白p150glued在脊髓前角的亚细胞定位及其对小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入的调控作用。方法 通过免疫荧光染色技术观察p150glued在小鼠脊髓前角处亚细胞定位情况,以及对照组Ctrl小鼠和p150glued条件性敲除cKO小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触前标记物VGLUT1含量变化情况。结果 在小鼠脊髓前角,p150glued的强阳性信号与VGLUT1存在共定位。在6月龄cKO小鼠中进一步发现,p150glued缺失的脊髓运动神经元膜上VGLUT1阳性点状信号多于Ctrl小鼠。结论 p150glued富集于兴奋性谷氨酸能突触前,p150glued缺失可增加6月龄小鼠脊髓运动神经元上谷氨酸能突触输入。

p150glued缺失小鼠的脊髓运动神经元中NMDA受体增多

目的 探讨运动神经元病致病基因Dctn1编码蛋白p150glued对小鼠脊髓运动神经元中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的影响。方法 利用蛋白印迹法检测p150glued缺失(cKO)小鼠及对照(Ctrl)小鼠脊髓中NMDA受体亚基NR1和NR2B的含量。利用免疫荧光染色法观察Ctrl和cKO小鼠脊髓运动神经元中NRI分布的变化。结果 与Ctrl小鼠相比,6月龄cKO小鼠脊髓组织中NR1和NR2B的蛋白水平明显增加,cKO小鼠脊髓运动神经元中NR1阳性斑点数也明显增多、增大。结论 神经元中p150glued缺失可以引起6月龄小鼠脊髓运动神经元中NMDA受体亚基NR1和NR2B增多。

p150glued缺失导致小鼠脊髓白质轴突变性

目的 探讨运动神经元病相关蛋白p150glued在小鼠脊髓白质轴突变性中的作用。方法使用蛋白印迹法检测p150glued在小鼠中枢神经系统中蛋白表达水平,使用免疫荧光法检测p150glued缺失对小鼠脊髓白质中神经纤维(轴突)的影响。结果与对照组相比,实验组中p150glued在小鼠脊髓神经元中蛋白质含量显著下降;与对照组相比,实验组中小鼠脊髓(颈椎)皮质脊髓束中轴突数量变化不明显,而脊髓小脑束中直径较大轴突数量显著下降。结论p150glued缺失可导致迟发的小鼠脊髓白质中发生特异性轴突变性。

细胞骨架相关蛋白在小鼠神经系统中表达与分布

目的探讨三类主要细胞骨架相关蛋白在小鼠神经系统中表达和分布。方法以1.5个月龄C57BL/6J野生型小鼠为材料,使用蛋白印迹法检测微管、微丝和神经丝相关蛋白在小鼠眼、脑、脊髓、坐骨神经和肌肉中表达情况。以6个月龄小鼠脊髓切片为材料,使用免疫荧光和和激光共聚焦显微镜技术检测细胞骨架蛋白的表达和定位情况。结果微管、微丝和神经丝相关蛋白在小鼠神经系统中表达广泛,且具有差异性。与脊髓相比,坐骨神经中大部分细胞骨架蛋白含量相对下降(P<0.05)。结论微管、微丝和神经丝相关蛋白是神经元主要细胞骨架蛋白,在神经系统广泛表达,但具有组织和亚组织差异化表达和分布,这可能与神经元结构和功能特异性有关。

EB1在小鼠神经系统中表达和功能

目的探讨微管末端结合蛋白1(end-binding protein 1,EBl)在小鼠神经系统中表达分布以及在细胞自噬蛋白降解通路中的作用。方法以1.5月龄C57BL/6J野生型小鼠为材料,使用蛋白质印迹法检测EB1在小鼠眼、脑、脊髓和坐骨神经中的表达情况。以小鼠成纤维细胞为材料,使用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术检测EB1在小鼠成纤维细胞中表达和定位。以HEK293细胞为材料,使用siRNA转染和Western blot法检测EB1缺失对于HEK293细胞自噬通路中关键蛋白的影响。结果微管正端示踪蛋白EB1在小鼠神经系统中表达广泛,且与脊髓比较,坐骨神经中含量显著下降。小鼠成纤维细胞中EB1定位于微管正端,呈彗星样分布。HEK293细胞中敲减EB1蛋白可引起自噬通路中p62和LC3B-Ⅱ蛋白表达水平显著提高(P<0.05),而LC3B-Ⅰ蛋白含量未发生明显变化(P>0.05)。结论EB1在神经系统广泛表达,但具有组织部位差异性。EB1聚集于微管正端,其含量下降可能通过破坏自噬小体的形成和运输引起自噬通路异常。

分子马达相关蛋白在小鼠神经系统中表达和分布

目的探讨沿微管运动的驱动蛋白(kinesin)、动力蛋白(dynein)和动力蛋白激活蛋白(dynactin)在小鼠神经系统中的表达和分布。方法以1.5月龄野生型C57BL/6 J小鼠眼、脑、脊髓、坐骨神经和肌肉组织为材料,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测不同部位中分子马达相关蛋白表达分布,并进一步研究脊髓和坐骨神经中蛋白质含量差异。结果Dynein亚基DIC(dynein intermediate chain)、DLIC(dynein light intermediate chain),Dynactin亚基DCTN4、DCTN5以及Kinesin在小鼠眼、脑、脊髓、坐骨神经和肌肉中均有分布,但表达水平不同。与脊髓相比,小鼠坐骨神经中DIC、DLIC、DCTN4、DCTN5、Kinesin heavy chain含量均显著下降(P<0.05)。结论小鼠神经系统多区域均分布有分子马达相关蛋白,但与脊髓(胞体)相比,坐骨神经(轴突束)中分子马达相关蛋白的含量相对较少。而分子马达相关蛋白是调控轴突运输关键因子,因此其含量或功能改变可能更易引起轴突损伤。

p150glued功能缺失导致小鼠脊髓运动神经元高尔基体病变

目的 探讨神经元中特异性敲除运动神经元病致病基因DCTN1编码的p150glued蛋白对于小鼠脊髓运动神经元高尔基体结构的影响。方法 通过免疫荧光染色技术标记高尔基体蛋白RCAS1观察对照组(Dctn1^(LoxP/LoxP))小鼠及p150glued条件性敲除(Dctn1^(LoxP/LoxP);Thy1-Cre)小鼠脊髓前角运动神经元中高尔基体分布和结构的变化情况。结果 与Dctn1^(LoxP/LoxP)小鼠相比,6月龄Dctn1^(LoxP/LoxP);Thy1-Cre小鼠脊髓运动神经元中RCAS1阳性的高尔基体分布明显离散。18个月龄时,Dctn1^(LoxP/LoxP);Thy1-Cre小鼠脊髓运动神经元中RCAS1阳性的高尔基体分布更加离散,且连贯膜结构明显碎裂。结论 神经元中p150glued功能缺失可以引发小鼠脊髓运动神经元中早期高尔基体分散及晚期高尔基体碎裂。

运动神经元病相关蛋白p150glued在自噬通路中的功能

目的探讨运动神经元病相关蛋白p150glued在自噬通路中的作用和功能。方法以1.5个月龄C57BL/6J野生型小鼠和HEK293细胞为材料,利用转染和蛋白印迹(Western blot)法检测p150glued缺失对于Dynactin亚基表达水平以及自噬-溶酶体蛋白降解通路中关键蛋白的影响。结果p150glued在小鼠神经系统中表达广泛,且与脊髓相比,坐骨神经中其含量显著下降(P<0.05)。p150glued蛋白缺失引起动力蛋白激活蛋白Dynactin亚基DCTN4、DCTN5、p50和Arp1a蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。p150glued蛋白含量下调使自噬-溶酶体蛋白降解通路中LC3A/B-II、p62和LAMP1蛋白表达水平显著提高(P<0.05),而ATG3、ATG7和LC3A/B-I蛋白含量未发生明显变化(P>0.05)。结论运动神经元病相关蛋白p150glued含量减少可通过引起Dynactin亚基表达水平下降,使自噬小体和溶酶体运输障碍,从而导致自噬-溶酶体蛋白降解通路异常。

Clip170和Clasp1在小鼠神经系统中的表达及在自噬中作用

目的探讨微管正端示踪蛋白Clip170和Clasp1在小鼠神经系统中表达分布以及在细胞自噬蛋白降解通路中的作用。方法以1.5个月龄C57BL/6J野生型小鼠为材料,使用蛋白印迹(Western blot)检测Clip170和Clasp1在小鼠眼、脑、脊髓和坐骨神经中表达情况,以HEK293细胞为材料,使用转染和Western blot法分别检测HEK293细胞中Clip170和Clasp1缺失对于自噬通路中关键蛋白的影响。结果Clip170和Clasp1在小鼠神经系统中表达广泛,且与脊髓相比,坐骨神经中两者含量均显著下降(P<0.05)。在HEK293细胞中敲减Clip170蛋白可引起使自噬通路中p62和LC3B-Ⅱ蛋白表达水平显著提高(P<0.05),而LC3B-Ⅰ蛋白含量未发生明显变化(P>0.05)。HEK293细胞中敲减Clasp1蛋白可引起使自噬通路中p62蛋白表达水平极显著下降(P<0.05),LC3B-Ⅱ蛋白显著提高,LC3B-Ⅰ蛋白含量未发生明显变化(P>0.05)。结论微管正端示踪蛋白Clip170和Clasp1在小鼠神经系统广泛表达,但具有组织区域差异性。Clip170和Clasp1含量下降可能通过破坏自噬小体的形成或运输引起自噬通路异常。

LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体1含量及机制

目的探讨帕金森病相关蛋白LRRK2对纹状体神经元中多巴胺受体D1R含量的影响以及相关机制。方法利用组织免疫荧光染色法检测LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠纹状体神经元中D1R含量的改变。并利用cathepsin D免疫荧光标记溶酶体,检测LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变对蛋白降解的影响。结果 LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体中D1R荧光强度均显著下降。LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体数目均显著增加,LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体大小增加,LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内与溶酶体共定位的D1R显著增加。结论 LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变导致纹状体D1R的含量下降。LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变提高小鼠纹状体神经元蛋白降解水平,D1R降解加强,从而使得纹状体神经元内D1R含量下降。