AF0.3启动子调控的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异杀伤作用

背景与目的:甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子调控下的目的基因能在AFP阳性肝癌组织中特异性表达;嘌呤核苷磷酸化酶(Escherichiacolipurinenucleosidephosphorylase,PNP)/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside,MeP-dR)自杀基因系统具有强杀瘤效应。本研究旨在探讨AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法:构建甲胎蛋白启动子AF0.3调控下PNP基因表达载体pAF0.3/PNP,导入AFP阳性肝癌细胞HepG2和阴性的肝癌细胞株SMMC7721,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的HepG2/0.3-PNP及SMMC7721/0.3-PNP细胞。RT-PCR检测二者在细胞中的表达。台盼蓝拒染法检测细胞增殖效应,MTT法和流式细胞仪检测两株细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测PNP基因产物活性。结果:不论有氧还是缺氧条件,HepG2/0.3-PNP对MeP-dR均较为敏感,SMMC7721/0.3-PNP则对MeP-dR完全不敏感。在任何一种条件下,HepG2/AF0.3-PNP在混合细胞中比例达25%后,就可致明显旁观者效应;而在同样条件下,SMMC7721/0.3-PNP不导致明显的旁观者效应。HPLC结果显示,pAF0.3/PNP在HepG2细胞中可以将MeP-dR转化为6-MP,但其在SMMC7721中则不具有转化活性。结论:AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性HepG2细胞有较好的杀伤作用。

乳酸杆菌属细菌对白色念珠菌生长抑制作用的实验探讨

目的研究乳酸杆菌属细菌对白色念珠菌的生长、菌落形成的影响.方法使用多菌种混合培养技术,菌落形成单位培养技术.结果在MRS培养基上混合培养显示:乳酸杆菌属中的嗜酸乳杆菌对白色念珠菌的生长抑制作用最强,从形态观察,被抑制生长后的白色念珠菌单细胞孢子的细胞壁和细胞质都有较大的改变,加入嗜酸乳杆菌后可将白色念珠菌的菌数由原来的(11.62±2.68)×103 CFU/ml(每毫升菌落数)降低到(4.23±0.62)×103 CFU/ml.两组比较有极显著性差异(P＜0.01).结论嗜酸乳杆菌能抑制白色念珠菌的生长,破坏白色念珠菌细胞内正常结构.

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1∶105。纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验。结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具。

喷昔洛韦对单纯疱疹病毒感染小鼠的治疗作用

目的 研究喷昔洛韦 (PCV)对单纯疱疹病毒感染小鼠的疗效。方法 用病毒滴度为 10 0LD50 /0 .1mLHSV 1,HSV 2每只分别腹腔注射 0 .0 3mL ,2 4h后皮下注射给药 ,PCV剂量分别为 2 0 ,5 0 ,10 0 ,2 5 0mg·kg-1·d-1,疗程 5d。观察动物的反应 ,出现死亡时间和死亡数 ,所有动物用药后观察 15d。同时收集各组动物治疗后的标本 ,进行病毒分离 ,按常规测定病毒滴度。另设病毒对照组、0 .9%NaCl对照组、阳性药阿昔洛韦对照组 (ACV)。结果 PCV对HSV感染鼠有保护作用 ,5 0mg·kg-1·d-1时 ,HSV 1和HSV 2感染鼠的存活率分别为 6 0 %和 75 % ,平均存活天数分别为 (11.3± 3.6 )和 (12 .9± 2 .8)d ,随着药物剂量增加 ,疗效增强 ,该药还能降低组织内病毒滴度 ,阻止体内病毒复制 ,抗HSV作用类似于相同剂量的ACV。

金鱼连口服液的急性毒性及药效学实验

目的:观察金鱼连口服液的急性毒性反应和体外、体内抗菌作用。方法:给昆明种小鼠以最大给药体积(40mL·kg-1)灌胃给药,bid,观察金鱼连口服液的急性毒性反应;选用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌2个菌种,采用试管稀释法测定金鱼连口服液的最小抑菌浓度;运用动物体内抗菌实验模型,观察金鱼连口服液体内抗菌作用。结果:小鼠灌胃给药,其最大给药量相当于临床用量(按人体质量60kg计算)的250倍,14d内无异常反应,体质量正常增长。金鱼连口服液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有显著抑制作用,金黄色葡萄球菌的MIC503.2mg·L-1,MIC9012.8mg·L-1;大肠埃希菌MIC506.4mg·L-1,MIC9025.6mg·L-1。结论:金鱼连口服液无急性毒性作用,具有显著杀灭金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作用。

直接免疫荧光法检测阴道毛滴虫

目的 研究多克隆抗体直接免疫荧光法(direct immunofluorescence assay,DFA)检测阴道毛滴虫的最佳反应条件及临床应用意义。方法 确诊为阴道炎的患者取阴道分泌物,经培养收集虫体,稀释成悬液,制作抗原片。取阴道毛滴虫免疫山羊血清,按Marssall氏法用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,观察不同抗体稀释度(1:10～1:2560)、不同孵育时间(15,30,45,60,90,120 min)、不同封闭剂(1％牛血清白蛋白,10％牛血清白蛋白及10％小牛血清)对DFA检测阴道毛滴虫的影响。对102例阴道炎患者标本分别用培养法、悬滴法和DFA作临床检验。结果抗体稀释度1:160、37℃孵育45min、封闭剂1％或10％牛血清白蛋白为最佳反应条件。检测102例临床标本,3种方法均阳性的16例,均阴性的68例。有13倒悬滴法、3例DFA检测阴性,而另2法阳性。1倒悬滴法阴性,DFA阳性,培养法未能证实。以培养法为标准,DFA敏感性为87.9％,特异性为98.6％。结论 DFA可作为悬滴法的一种替代手段用于临床检验。

幽门螺杆菌对食管癌细胞凋亡及表达COXⅡ、Bax、Caspase-3的影响

目的:观察幽门螺杆菌(H.pylori,HP)作用于食管癌细胞(ECa-109)后细胞凋亡的情况以及细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochrome oxidaseⅡ,COXⅡ)、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达的变化,探讨H.pylori致癌的分子机制。方法:将H.pylori与ECa-109分别作用4、8、24 h,收集各组细胞,流式细胞术(FACS)检测凋亡情况;Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅡ、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达。结果:随着共培养时间的延长,COXⅡmRNA和蛋白的表达逐渐下降,而Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达逐渐上升,ECa-109凋亡增加。结论:H.pylori可抑制食管癌细胞线粒体编码基因COXⅡmRNA的表达,从而影响线粒体功能;H.pylori在体外可通过线粒体途径上调Bax、Caspase-3表达,从而诱导ECa-109凋亡。

幽门螺杆菌对食管癌COXⅠ表达的影响

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)作用于食管癌细胞后细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidaseⅠ,COXⅠ)mRNA及其蛋白表达的变化,探讨Hp在肿瘤发生发展中可能的作用机制。方法将Hp与食管癌细胞分别作用4、8、24 h,收集细胞,应用Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅠmRNA及其蛋白表达。结果 Hp与食管癌细胞共培养4、8、24 h后,COXⅠmRNA表达量逐渐减少,4 h的表达量显著低于对照组,其后下降速度减慢,24 h后表达量不再有明显改变。COXⅠ蛋白表达呈现相似的趋势。结论 Hp与食管癌细胞共培养后,可导致线粒体编码基因COXⅠmRNA及其蛋白表达障碍,从而影响线粒体功能。

银杏叶提取物对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和Bcl-2,Caspase-3表达的影响

目的:探讨银杏叶提取物(ginkgobilobaextract,GBE)对脑缺血后梗死体积及神经元凋亡相关蛋白Bcl-2,Caspase-3表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为缺血对照组、小剂量GBE治疗组(小剂量组)、大剂量GBE治疗组(大剂量组)。采用大鼠大脑中动脉栓塞模型,应用光镜、TTC染色、免疫组织化学染色及TUNEL染色检测方法,在不同时间点观察各组大鼠脑梗死体积的变化以及Bcl-2,Caspase-3阳性细胞表达的不同和神经细胞凋亡的情况。结果:在不同时间点各给药组大鼠的脑梗死体积小于缺血对照组,差异有显著性(P<0.01);大剂量组脑梗死体积与小剂量组脑梗死体积相比差异亦有统计学意义(P<0.05)。各给药组大鼠Bcl-2阳性细胞表达数目均高于缺血对照组,而Caspase-3阳性细胞表达数目则低于缺血对照组(P<0.01);大剂量组阳性细胞表达数目与小剂量组阳性细胞表达数目相比差异亦有显著性(P<0.05)。结论:银杏叶提取物可减少脑梗死体积,在脑缺血损伤急性期可增加Bcl-2的表达而减少Caspase-3的表达。

血吸虫合并曼氏裂头蚴双重感染1例

目的 总结血吸虫合并曼氏裂头蚴双重感染的临床特点及治疗方法。方法 回顾性分析1例血吸虫合并曼氏裂头蚴双重感染患者的临床资料,复习相关文献,总结其临床特点及治疗方法。结果 患者以发热为主要临床表现,查体数处可触及皮下结节,既往曾在疫区生活,有饮生井水、生食蛇胆及蛇肉等史;外周血细胞嗜酸性粒细胞比值增高,血清血吸虫抗体及曼氏裂头蚴抗体均为阳性,皮下包块活检可找到曼氏裂头蚴虫体。给予吡喹酮治疗3个周期后痊愈。结论 血吸虫合并曼氏裂头蚴双重感染较为罕见,单纯给予吡喹酮治疗效果好,对于反复发热、嗜酸性粒细胞明显增高且在疫区生活的患者,应给予足够重视。

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因,并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序。将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。结果成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因。DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致。含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白。结论获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础。

外排泵高表达和外膜蛋白缺失在铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药中的作用

目的探讨铜绿假单胞菌(PA)外科监护室(SICU)分离株对碳青霉烯的耐药机制。方法用W estern印迹和逆转录PCR测定外膜蛋白OprD、OprN表达水平和基因m exA的mRNA水平;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因和主动外排系统M exAB-OprM调控基因m exR,并测序。结果从SICU分离的49株PA,42株对碳青霉烯耐药,其OprD表达除PA42外均有不同程度的降低或缺失,而正常表达OprD的7株菌,均对2种碳青霉烯敏感。27株菌高表达主动外排系统M exAB-OprM,高表达组对亚胺培南耐药率81.5%(22/27)与低表达组耐药率86.4%(19/22)比较差异无统计学意义(χ2=0.005,P=0.943);而高表达组对美罗培南耐药率44.4%(12/27)与低表达组耐药率13.6%(3/22)比较差异有统计学意义(χ2=5.417,P=0.020)。14株表达了M exEF-OprN,但表达组对亚胺培南和美罗培南耐药率与未表达组耐药率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。8株高表达M exAB-OprM主动外排系统的调控基因m exR发生变异,其中7株出现氨基酸替换,1株提前出现终止密码子。未发现产IMP、VIM金属酶菌株。结论本院SICU分离的PA,对碳青霉烯耐药主要是由外膜蛋白OprD表达降低或缺失引起,与IMP、VIM金属酶无关;主动外排系统M exAB-OprM的高表达对美罗培南的耐药起重要作用;其高表达与调控基因m exR变异有关。

超短波对兔急性肺损伤肺内小动脉血管壁的保护作用

目的 通过超短波对兔急性肺损伤肺部的治疗 ,观察肺内小动脉 (SmallArtery ,SA)血管壁的变化 ,了解超短波对急性肺损伤肺内SA血管壁是否具有保护作用 ,并初步探讨其作用机制。方法 健康大白兔 18只 ,随机分为A、B、C 3组 ,每组 6只。A组为正常对照组 ;B组将大肠杆菌内毒素静脉注射 3 0min后 ,应用微热量超短波治疗 ,每天 1次 ,共治疗 7d ;C组将大肠杆菌内毒素静脉注射后不做任何治疗 ,观察 7d。各组兔分别在规定时间静脉注入空气 5 0ml处死 ,样本用 40g/L多聚甲醛固定 ,NADPH d组织化学染色 ,光镜观察。结果 A组SA血管内膜光滑 ,NADPH d组织化学染色呈深紫色强阳性反应 ,内皮细胞及平滑肌细胞分布均匀。B组血管扩张 ,管壁NADPH d组织化学染色、内皮细胞及平滑肌细胞分布与A组无明显差别。C组SA血管内膜增生 ,内膜下结缔组织水肿 ,NADPH d组织化学染色呈深紫色强阳性反应 ,中层平滑肌水肿、增生 ,血管壁厚薄不均 ,管腔变窄。图像分析结果显示 :C组一氧化氮合酶 (NOS)阳性染色细胞数明显高于A组 ,差异有极显著性意义 (P <0 .0 1) ;而经超短波治疗后的B组NOS阳性染色细胞数与A组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论 超短波能够通过调节NOS的活性 。

多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法选取25株外科监护室分离的多重耐药铜绿假单胞菌,用实时定量RT- PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况；用PCR分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机理。结果25株多重耐药铜绿假单胞菌中,14株高表达MexAB-OprM系统(56％),3株高表达MexXY-OprM系统(12％),这3株菌同时高表达2种外排泵。在8株mexA高表达的菌株中,5株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,1株mexR提前出现终止密码子,2株菌未发现mexR基因突变。2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代。结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达,是此菌多重耐药机制之一；外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关,同时存在其他调控机制。

超短波对实验性肺间质纤维化的影响

目的 观察超短波对内毒素性肺损伤所致的肺间质纤维化的影响。方法 健康大白兔 18只 ,随机分为对照组 (C组 ) 6只 ,静脉内注入生理盐水 5ml。观察组 12只 ,大肠杆菌内毒素 0 .7mg/kg体重 ,生理盐水 5ml稀释后静脉内注入。其中 6只应用超短波治疗 1周 (A组 ) ,另 6只不做任何治疗观察 1周 (B组 )。应用透射电镜和组织化学方法观察各组肺间质纤维化形成程度及肺泡一氧化氮合成酶 (NOS)阳性染色细胞数的变化。结果 肺间质纤维化程度 ,A组与C组比较无显著性差异。B组与C组比较纤维化程度明显增多 .肺泡NOS阳性染色细胞数A组与C组比较差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,B组与C组比较 ,B组NOS阳性染色细胞数明显减少 (P <0 .0 1)。结论 超短波具有明显的保护损伤肺组织减轻肺间质纤维化的作用。其调节肺组织NOS活性的作用可能是防治肺间质纤维化的重要途径之一。

TNF—α基因转染树突状细胞作为佐剂呈递肿瘤多肽诱导小鼠体内特异性抗肿瘤免疫

目的：探讨腺病毒介导TNF-α基因转染树突状细胞（DCs）诱导抗肿瘤免疫的可能性。方法：用100MOI的AdV-TNF-αm和AdV-pLpA(无外源基因)分别感染小鼠DCs，采用RNA酶保护实验检测其细胞因子的表达，同时用混合淋巴细胞试验分析其抗原提呈差异，然后将各实验组DCs分别免疫B57BL/6小鼠，10天后以不同剂量瘤细胞攻击小鼠以观察其保护效力。结果：DCTNF-α组TNF-αm、IL-12、IL-18以及GM-CSF表达量较对应组增高；体外混合淋巴细胞试验表明DCTNF-αm组抗原提呈功能增强；体外、体内特异性抗肿瘤实验均显示该型瘤苗具有良好的抗瘤作用。结论：该基因工程DCs可应用于肿瘤的免疫治疗。

土拨鼠肝炎病毒和乙型肝炎病毒的核心蛋白存在共同线性B淋巴细胞表位

目的寻找并证实土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和HBcAg存在共同的B淋巴细胞表位。方法用变性重组WHcAg和HBcAg免疫Balb/c小鼠以制备单克隆抗体；用单克隆抗体对WHcAg和HBcAg进行ELISA、Western blot及免疫组织化学对比分析,同时用该抗体对WHcAg和HBcAg进行表位分析,并在氨基酸水平进行比对。结果经过ELISA、Western blot、免疫组织化学对比分析,制备的单克隆抗体中有2株与HBcAg和WHcAg有交叉反应,而且灵敏度和特异性相似；针对的抗原表位分别位于HBcAg和WHcAg的1～8位氨基酸和125～140位氨基酸。结论WHcAg和HBcAg存在2个共同的线性B淋巴细胞表位,分别位于1～8位和125～140位氨基酸。