雷公藤内酯醇对脂多糖诱导黑质多巴胺能神经元变性的保护作用

目的观察雷公藤内酯醇(triptolide,Tri)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导黑质多巴胺能(dopamine,DA)神经元变性的保护作用。方法40只大鼠随机分为4组,每组10只,即:假手术对照组,LPS模型组,LPS加Tri组,LPS加生理盐水组。14天后观察LPS和雷公藤内酯醇对阿朴吗啡诱发的旋转行为、大鼠毁损侧纹状体DA及其代谢产物的含量和DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)阳性细胞数及小胶质细胞激活情况的影响。结果黑质注射LPS后可以模拟脑部免疫炎症反应异常现象,导致DA能神经元变性;黑质注射LPS后引起大鼠向注射侧出现旋转,雷公藤内酯醇能抑制这一作用;并能明显保护纹状体DA及其代谢产物的含量的降低及TH阳性细胞数的减少,抑制小胶质细胞的激活(P<0.01)。结论雷公藤内酯醇可以通过抑制小胶质细胞激活,保护炎性介导的DA能神经元变性。

左旋多巴诱发异动症大鼠模型纹状体神经元可塑性的研究

目的 研究左旋多巴诱发异动症 (LID)大鼠模型纹状体区FosB和特异性神经肽基因表达的变化 ,探讨LID时纹状体神经元的可塑性。方法 分别用免疫组织化学方法和逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)检测大鼠纹状体区FosB和前脑啡肽原 (PPE)及前强啡肽原 (PDyn)基因的表达情况。用辣根过氧化物酶 (HRP)逆行示踪与免疫组织化学相结合的双重反应技术观测FosB的细胞分布状况。 结果 帕金森病 (PD)大鼠较正常大鼠损毁侧纹状体PPEmRNA表达明显增多而PDynmRNA表达减少。LID大鼠较PD大鼠PPEmRNA无明显增多 ,但PDynmRNA显著性增多。LID大鼠损毁侧纹状体区FosB阳性神经元明显增多 ,并且主要分布于纹状体黑质神经元内。结论 纹状体黑质神经元内即早基因FosB及其下游靶基因强啡肽的表达异常与大鼠LID的发生有关 ,表明LID的发生与直接通路的活动异常密切相关。

脂多糖诱导黑质多巴胺能神经元变性中小胶质细胞的反应

目的 探讨小胶质细胞活化规律与脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)诱导黑质多巴胺 (DA)能神经元变性的关系。方法 脑立体定位注射LPS入大鼠脑黑质后 ,采用特异性抗体OX 4 2标记不同时间点小胶质细胞的激活情况 ;酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase ,TH)免疫组织化学观察DA能神经元损害变化。结果 小胶质细胞在LPS注入黑质 6h后开始出现部分激活。 12h大部分激活 ,为“灌木丛样”小胶质细胞 ;2 4h已完全激活 ,呈现“阿米巴样” ,在随后的 30d内 ,基本维持在此形态。而TH阳性细胞数在第 3d开始出现下降 ,与对照组相比下降达 4 5 % ,14d时下降至 5～ 10 % ,至30d时几乎完全消失。结论 小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性 ,其激活介导的炎症反应在PD发病中具有重要的神经破坏作用。

泛素蛋白酶体抑制剂诱发多巴胺能神经元内质网应激反应及其凋亡的作用

目的 探讨泛素蛋白酶体(ubiquitin proteasome,UP)功能失调诱发的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response,ERS)机制在多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡中的作用.方法 通过MTT及流式细胞仪检测UPS抑制剂Lactacystin对NGF诱导的PC12细胞的神经毒性作用,应用RT-PCR和Western blot技术观察Lactacystin处理后ERS通路中XBP1、Grp78、CHOP表达水平的变化及利血平耗竭胞内DA水平后的影响.结果 不同浓度的Lactacystin 5～20μmol/L处理PC12细胞后,细胞活力呈浓度依赖性下降,其中Lactacystin 10μmo1/L作用24h使细胞活力下降51%.在相同浓度条件下(10μmol/L)流式细胞仪显示的细胞凋亡率在4h、8h、1 6h、24h内逐渐增高(6.1%、14.1%、24.9%、30.9%)(P＜0.01).RT-PCR及免疫印迹检测显示UPS抑制剂处理后XBP1、Grp78和CHOP的基因及蛋白表达水平明显增加,分别在8h、16～24h达到高峰(P＜0.05).Caspase-12基因水平也在Lactacystin诱导后16h显著升高(P＜0.05).利血平预处理则使CHOP、caspase-12基因表达减弱(P＜0.05).结论 UPS功能抑制诱发的内质网应激和相关凋亡途径机制是DA能神经元选择性变性死亡的内在环节之一.

格尔德霉素通过诱导热休克蛋白反应抑制DA能神经元蛋白水解应激的研究

目的探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)通过诱导热休克蛋白(HSP)反应抑制α-突触核蛋白(α-syn)异常表达,加强泛素蛋白酶体降解功能的神经保护作用。方法鱼藤酮作用于NGF诱导的PC12细胞建立α-syn胞质内过表达细胞模型,MTT法检测GA不同浓度及用药时程条件下的细胞活力,应用Western blot技术及共聚焦免疫荧光双标染色观察GA预处理后细胞内HSP70和α-syn的表达。荧光分光光度计测量各组细胞内蛋白酶体水解酶活性的变化。结果MTT示GA20～300nmol·L-1预处理使细胞活力呈浓度依赖性上升,吸光度分别上升至正常的65%、76%、85%和94%(鱼藤酮组为59%,P<0·01),而GA与鱼藤酮同时给药或作用于其后20h细胞活力无明显变化。Western blot结果提示GA预处理使HSP70表达上升至正常的3倍左右。共聚焦显微镜观察显示α-syn过表达现象得以抑制,并证实两者的共定位现象。酶活性测定提示GA预处理使类胰蛋白酶,类糜蛋白酶活性明显增强,荧光指数分别上升至10·4±1·61和96·0±4·77(鱼藤酮组为7·9±0·90和82·4±3·51,P<0·05),PgH水解酶活性也轻度上升。结论格尔德霉素可诱发热休克蛋白反应,主要通过HSP70的作用抑制α-syn的异常表达,促进泛素蛋白酶体降解功能,减轻蛋白水解应激反应,发挥神经保护效应。

3-硝基丙酸预处理对黑质多巴胺神经元能量代谢的影响

目的 观察 3 -硝基丙酸(3- nitropropionic acid,3 NP)预处理对黑质腺苷酸及腺苷含量的影响,探讨能量代谢及腺苷含量改变在3- NP预处理保护多巴胺(dopamine,DA)神经元中的作用。方法 64 只雄性 SD大鼠随机分为对照组、3 -NP组、PD组及3- NP预处理组。3 -NP预处理组于6 羟基多巴胺(6 -OHDA)损毁前 24 h经腹腔注射3 NP (按体重20 mg/kg),采用高效液相色谱法(HPLC)测定术后2 h和1、3、5 d时间点损毁侧黑质腺苷酸及腺苷含量。结果 3- NP组2 h,帕金森病(PD)组3、5 d及3- NP预处理组各时间点较对照组ATP含量明显降低,腺苷酸ADP、-AMP等增高(P<0 .05或P<0. 01),3- NP预处理组3、5 d较PD组同时间点相比ATP水平增高(P<0. 05);3- NP预处理组各时间点腺苷持续在较高水平,与PD组同时间点相比显著增高(P<0 .01)。结论 3 -NP轻度抑制氧化磷酸化使能量代谢水平降低,有利于细胞能量储备和增强对后续抑制的耐受能力。腺苷水平增高在3 NP预处理保护神经元过程中可能具有重要作用。

帕金森病发病机制与神经元保护性治疗的研究进展

尽管帕金森病长期使用以左旋多巴为主的药物替代治疗作为目前治疗的金标准 ,但是现有的治疗措施均不能有效阻止乃至减慢疾病的进展。对帕金森病的发病机制和神经元保护性治疗的深入研究 ,必将为选择合适的神经元保护剂、制定合理的治疗方案进而阻止病情的恶化奠定理论基础。

黑质内注射脂多糖对多巴胺能神经元和小胶质细胞活性的影响

目的:观察脂多糖(LPS)对黑质多巴胺能神经元的损毁作用以及对小胶质细胞活性的影响。方法:60只雌性SD大鼠随机分为正常组、1d组、1周组、2周组和2个月组各12只,除正常组外,其余各组采用立体定向技术向大鼠单侧黑质内注入LPS,于注药后1d、1周、2周和2个月时分别经腹腔注射阿朴吗啡诱发动物旋转行为为造模成功;按各组不同时间点观察大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数变化和小胶质细胞活化过程、纹状体和黑质部位多巴胺(DA)及其代谢产物含量及黑质变性神经元。结果:单侧黑质内注入LPS后的各组黑质TH+细胞数分别较对侧减少12%～71.5%;其损伤侧纹状体和黑质DA及其代谢物含量降低28.2%～65.7%(均P<0.05～0.01);1周组Fluoro-JadeB染色可见染色阳性神经元;LPS注射的各组黑质均可见活化的小胶质细胞。结论:黑质注入LPS可诱导小胶质细胞活化和黑质多巴胺能神经元变性死亡。

烟草成份保护多巴胺神经元作用的研究

目的 :探讨烟草成份保护多巴胺神经元对抗 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)的神经毒性作用。方法 :采用大鼠脑内立体注射 6 OHDA建立帕金森病模型 ,连续观察术前 4周开始分别给予被动吸烟和腹腔注射尼古丁 (每次 0 .1mg/kg或 0 .4mg/kg,bid ,持续 6周 )对阿朴吗啡诱发的旋转行为、纹状体多巴胺 (dopamine,DA)的含量和黑质酪氨酸羟化酶 (TyrosineHydroxylase ,TH)阳性神经细胞数目的影响。结果 :被动吸烟和腹腔注射尼古丁的大鼠旋转行为明显减少 ,受损侧纹状体DA含量和黑质TH阳性神经元的数目较对照组增高 (P <0 .0 1) ,高剂量尼古丁作用更为显著。结论 :烟草成份可减轻 6

^(99m)Tc-Annexin V检测早期凋亡多巴胺能神经元的实验研究

目的研究放射性核素标记的膜联蛋白V(Annexin V)与凋亡的多巴胺能神经元的结合特性,探讨使用凋亡显像剂99mTc-Annexin V早期活体显像诊断帕金森病的可行性。方法采用不同浓度的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)以诱导其凋亡(PC120~200μm/L,SH-SY5Y0~500μm/L),FITC-Annexin V及碘化吡啶(pro-pidiumiodide,PI)双染进行流式细胞仪凋亡检测。以99mTc-Annexin V与凋亡的细胞进行饱和结合实验及细胞摄取实验,研究凋亡细胞与Annexin V的亲和力及其摄取99mTc-Annexin V的动力学。结果MPP+可诱导PC12细胞及SH-SY5Y细胞发生凋亡,并有明显的量效关系。凋亡细胞可特异性与99mTc-Annexin V结合,亲和力可达(7.16±1.78)nmol/L,每个凋亡的多巴胺能神经元表面的结合位点可达到(179±33)f mol/106cells(PC12)及(220±26)f mol/106cells(SH-SY5Y),且神经元的凋亡水平与其膜结合的99mTc-Annexin V放射性强度有相关性(P<0.001)。结论凋亡的多巴胺能神经元与99mTc-Annexin V有高度亲和力,其所结合的99mTc-Annexin V放射性强度与细胞的凋亡水平相关,99mTc-Annexin V可用于检测多巴胺能神经元的早期凋亡。

自主神经功能障碍型多系统萎缩临床诊断及治疗

目的:通过对自主神经功能障碍型多系统萎缩(Shy-Drager综合征,SDS)的临床和影像学特征、治疗方法和预后的研究,从而探讨SDS的早期诊断和治疗。方法:采用回顾性分析方法,收集我院神经科2005-06至2010-07诊断为SDS患者37例,男性22例(59.5%),女性15例(40.5%)。对37例SDS的特点及其他临床和影像学特征进行综合分析,尤其是直立性低血压的血压变化和伴发症状。结果:37例SDS患者临床以直立性低血压(30例,81.1%)、头昏或晕厥(29例,78.4%)、睡眠呼吸暂停综合征(28例,75.7%)常见。头颅计算机断层摄影术(27例,73.0%)和核磁共振成像(29例,78.4%)异常阳性率高。经药物等治疗均有不同程度改善。发病后4年无1例死亡,5年3例死于睡眠呼吸暂停综合征,2例死于肺部感染所致呼吸衰竭。结论:SDS临床以自主神经功能障碍为主要表现,早期诊断和针对性的治疗能够降低患者死亡率、提高生存时间和生活质量。

p38 MAPK信号通路在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元变性中的作用研究

目的:研究p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)在脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞激活介导多巴胺(DA)能神经元变性中的作用。方法:脑立体定位注射LPS于大鼠脑黑质,Western blot印记法检测不同时间点(0、0.5h、1h、6h、12h)黑质p38磷酸化水平。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色观察蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂SB203580预处理后LPS对DA能神经元变性的影响。结果:黑质注射LPS后,Western blot结果显示p38MAPK总体蛋白水平在各组均存在表达,无显著性差异(P>0.05),而其磷酸化p-p38MAPK却发生了明显变化。正常对照组和PBS注射侧几乎无p-p38的表达,LPS注射后30min,p-p38即有少量的表达;1h表达量增加;6h表达量达高峰;12h后表达量逐渐下降。与PBS对照侧相比,LPS注入黑质导致TH阳性细胞数下降至38%;SB203580预处理可以显著增加TH+细胞数达63%(P<0.05)。结论:p38MAPK信号通路参与了LPS诱导小胶质细胞激活介导DA能神经元变性,可通过阻断信号通路来减轻LPS诱导DA能神经元变性,为PD治疗提供新的思路。

脂多糖诱发大鼠黑质多巴胺能神经元变性

目的 :观察脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS)对黑质多巴胺 (DA)能神经元的毒性作用 ,探讨帕金森病 (PD)发病机制。方法 :脑立体定位注射LPS入大鼠脑黑质后 ,采用酪氨酸羟化酶 (Tyrosinehydroxylase,TH)免疫组织化学染色 ,观察不同剂量LPS和 5 μgLPS注射后不同时间点黑质DA能神经元的损伤状况。结果 :0 1～ 10 μgLPS注射后14d ,导致TH+ 细胞数下降分别为 5 %、15 %、2 0 %、4 5 %、96 %和 99% ;5 μgLPS注射后与对照组相比 ,TH+ 细胞数3d后开始下降 ,14d明显减少 ,仅为 5 % ,30d后基本消失。结论 :LPS能诱导黑质DA能神经元变性 ,呈剂量和时间依赖性。

姜黄素对脑缺血再灌注模型大鼠的神经保护作用及其机制

目的:观察姜黄素对脑缺血再灌注大鼠模型的神经保护作用及其机制。方法:雄性SD大鼠随机分为3组:模型组、姜黄素组和假手术组,模型组采用血管内线栓阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,姜黄素组在缺血前1h腹腔注射姜黄素200mg/kg,随后每12h腹腔注射姜黄素60mg/kg(共5次)。再灌注后3h、24h和72h测定脑组织含水量、伊文斯蓝(EB)含量(反映血脑屏障破坏情况),免疫印迹法测定脑组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平。结果:脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量及EB含量增加,MMP-9高表达。姜黄素治疗能够减轻神经功能损伤,降低脑组织含水量和EB含量,并降低MMP-9表达水平(P<0.01)。结论:姜黄素通过降低脑缺血再灌注大鼠MMP-9表达水平及血脑屏障通透性,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

3-硝基丙酸多次预处理抑制N-myc表达保护多巴胺能神经元

目的 研究 3 硝基丙酸 (3 NPA)多次预处理对多巴胺能神经元的保护及即早基因N myc在其中的作用。方法 选择C5 7BL小鼠 ,应用 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (1 methy 4 phenyl 1,2 ,3,6 tetrahydropyridine,MPTP)制造帕金森病小鼠模型 ,应用免疫组织化学方法观察 3 NPA单次与多次预处理后小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶 (TH)阳性细胞数量的改变 ;应用免疫组织化学及蛋白印迹 (WesternBlot)方法观察即早基因N myc在中脑黑质中的表达及蛋白水平的变化。 结果 3 NPA单次预处理后 ,中脑黑质酪氨酸羟化酶 (TH)阳性细胞数量由MPTP组的 2 7.3± 5 .6上升到 5 9.3± 11.2 (P <0 .0 5 ) ,而 3 NPA多次预处理后 ,阳性细胞数量上升至 88.6± 14 .8(P <0 .0 1) ,单次预处理与多次预处理也有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;在空白对照组 ,中脑黑质几乎看不见N myc阳性细胞 (4 .1± 0 .5 ) ,经MPTP处理后 ,N myc阳性细胞数量明显增加 (89.3± 12 .7,P <0 .0 1) ,蛋白水平增加 ;3 NPA单次预处理后 ,中脑黑质N myc阳性细胞数量与MPTP组比较无明显变化 (81.8± 13.6 ,P >0 .0 5 ) ;3 NPA多次预处理后 ,N myc阳性细胞数量明显减少 4 7.9± 11.8(P <0 .0 5 ) ,N myc蛋白水平也有相同的变化。 结论 3

S-甲基异硫脲对脂多糖诱导多巴胺能神经元变性的保护作用

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)抑制剂S 甲基异硫脲 (S methylisourea ,SMT)对脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)诱导多巴胺 (DA)能神经元变性的保护作用及其机制。 方法 4 8只大鼠随机分成 4组(n =12 ) :磷酸缓冲液 (PBS)对照组、LPS组、生理盐水治疗对照组和SMT治疗组 ;此 4组又各分成 1,7d两个亚组。立体定向注射 5 μgLPS致大鼠脑黑质建立PD炎症模型 ,采用化学比色法检测 1d亚组黑质内NO释放量以及iNOS活性改变 ;RT PCR检测iNOSmRNA的表达 ;酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase ,TH)免疫组织化学染色观察 7d亚组黑质DA能神经元的损伤情况。结果 与PBS对照组相比 ,LPS注入黑质导致TH阳性细胞数下降至 35 % (P <0 .0 5 ) ;同时黑质内NO含量 ,iNOS活性及iNOSmRNA表达明显增高 ;SMT治疗组NO释放量 ,iN OS活性及iNOSmRNA表达显著降低 (P <0 .0 1) ;TH阳性细胞数亦明显增多 ,达 70 % (P <0 .0 5 ) ,生理盐水治疗组对此无明显改善。结论 iNOS上调是LPS诱导DA能神经元变性机制中重要的因素之一 。

大鼠骨髓间质多潜能成年祖细胞体外培养和神经分化潜能的研究

目的:探讨大鼠骨髓间质中多潜能成年祖细胞(muhipotent adult progenitoi-cells or MAPCs)的体外培养与神经分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:采用Ficoll-Paque液(1.077g/L)和免疫微磁珠从大鼠双侧股骨和胫骨骨髓中分离与纯化出多潜能成年祖细胞,体外扩增,分别采用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维生长因子-8(FGF-8)等试剂的无血清L-DMEM诱导MAPC分化为神经元。应用免疫荧光化学技术和RT-PCR等方法对分化细胞进行鉴定。结果:多潜能成年祖细胞在休外扩增可超过50代,细胞形态和神经分化能力没有发生变化。在碱性成纤维生长因子的诱导下,MAPC形态转变为典型的神经样细胞,神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。继续用BDNF、FGF-8持续诱导,MAPC可分化为更加成熟的神经样细胞,微管相关蛋白-2(MAP-2)表达阳性;RT-PCR显示诱导出的神经样细胞,酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺β-羟化酶(DBH)mRNA表达水平明显升高。结论:建立了多潜能成年祖细胞体外分离、培养的条件,探索了多潜能成年祖细胞部分生物学特性,多潜能成年祖细胞在体外可以持续增殖并可诱导分化为较成熟的神经元样细胞,它可为多潜能成年祖细胞的临床应用提供材料。

肌酸对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元保护作用的研究

目的:观察肌酸对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用及其机制。方法:30只雄性SD大鼠随机分成3组:对照组(A组),6-羟多巴胺(6-OHDA)组(B组),肌酸+6-OHDA组(C组),每组各10只。A组不注射6-OHDA,B组进行6-OHDA造模,C组在造模前5天每天给予肌酸(100 mg/kg)灌胃,连续两周,B组给予生理盐水4 ml灌胃。分别观察各组动物行为学、黑质多巴胺能神经元数量及氧化应激指标谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平变化。结果:6-OHDA立体定向注射后,实验大鼠出现阿朴吗啡诱导的旋转行为,黑质致密部多巴胺能神经元显著减少,GSH含量降低、MDA水平升高;肌酸能够减轻动物行为学异常(P<0.01)、显著增加黑质致密部多巴胺神经元数量(P<0.01),拮抗6-OHDA诱导的氧化应激水平升高(P<0.01)。结论:肌酸对6-OHDA诱导的多巴胺神经元损伤具有明显保护作用,其机制与抑制氧化应激损伤有关。

3-硝基丙酸预处理保护多巴胺神经元机制研究

目的研究3-硝基丙酸(3-NPA)多次预处理保护多巴胺神经元的作用及其可能机制。方法使用MPP+在分泌多巴胺的人神经纤维瘤细胞SH-SY5Y上制作帕金森病细胞模型,在模型制作前分别1或5次加入3-NPA(0.2 mmol.L-1)进行预处理,分别应用液闪烁仪检测[3H]DA摄取率,双波长分光光度仪检测细胞内游离钙离子(Ca2+)浓度的改变,观察3-NPA预处理保护多巴胺神经元的作用。结果MPP+可降低[3H]DA摄取率,升高细胞内游离钙离子浓度,3-NPA预处理可提高[3H]DA摄取率,降低胞内游离钙离子浓度,3-NPA多次预处理较3-NPA单次预处理的作用更好。结论3-NPA预处理对多巴胺神经元有明显的保护作用,可能与其降低胞内游离钙离子浓度有关。