基于不同位点的广东省柑橘黄龙病菌种群分子多样性分析

【目的】探究广东省不同地区柑橘黄龙病菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)的种内遗传结构及遗传多样性情况;评价用多基因位点分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的科学性。【方法】基于原噬菌体区域(SC1、SC2和PJXGC)、转座子位点(CLIBASIA_05620~CLIBASIA_05625)和短串联重复序列STR1(CLIBASIA_03080)、STR12(CLIBASIA_01215)6个基因位点的多态性,对来自广东省10个市(县)的176个黄龙病样品进行病原菌遗传多样性分析。【结果】基于噬菌体类型鉴定出6组菌株,其中携带Type II类型原噬菌体的菌株为优势种群(85.23%);基于转座子位点鉴定出4种类型菌株,含有缺失MCLas-A类型转座子的B350片段的菌株为优势种群(76.70%);基于短串联重复序列STR1和STR12分别鉴定出9和10类菌株,且STR1位点上含有3个“CAGT”串联重复的菌株为优势种群(56.82%);STR12位点上多态性条带分布不集中,没有优势条带类型。聚类分析结果表明湛江、茂名和深圳的种群与其他地区种群的差异较大,而清远和梅州的黄龙病菌种群关系较近。【结论】基于不同位点和基于所有位点所得的聚类结果不尽相同,说明利用单个或单种基因位点对黄龙病菌进行种群遗传结构分析具有较大的局限性。

荔枝果皮多酚对荔枝霜疫霉生物学特性的影响

【目的】探讨荔枝多酚对荔枝霜疫霉生长发育的影响。【方法】溶剂浸提法提取荔枝果皮中的总多酚,采用常规植物病理学手段研究荔枝多酚质量浓度对荔枝霜疫霉菌落形态、生物量、孢子囊萌发方式、游动孢子萌发及卵孢子数量的影响。【结果】荔枝多酚质量浓度为150~300μg·mL^-1时,荔枝霜疫霉菌落致密,菌丝生长量和产孢量显著减少,孢子囊以释放游动孢子的方式萌发;培养基中荔枝多酚为100~300μg·mL^-1时,可显著促进游动孢子的萌发,抑制孢子囊的萌发;在无荔枝多酚的PDA培养基上荔枝霜疫霉不易产生卵孢子,当培养基中荔枝多酚质量浓度达到100μg·mL^-1时,荔枝霜疫霉产生卵孢子为10.8 mm^-2。【结论】荔枝多酚类物质参与荔枝霜疫霉生长发育的调控,抑制霜疫霉生长和产生孢子囊,具有开发新型安全性生物源杀菌剂的潜力。

阿维菌素对修长蠊螨的亚致死效应以及不同方式释放该螨对根结线虫的防控效果

本研究测定了阿维菌素对修长蠊螨的亚致死浓度及其对修长蠊螨生存、繁殖发育和捕食能力的影响,并通过盆栽试验研究了以不同方式释放修长蠊螨对空心菜根结线虫病的控制效果。阿维菌素对修长蠊螨的3个亚致死浓度LC50、LC30和LC10分别是2%的阿维菌素稀释2082倍、3760倍和8831倍。这3个亚致死剂量的阿维菌素均使修长蠊螨的生存能力、总产卵量和捕食线虫能力显著下降。修长蠊螨被LC50、LC30和LC103个亚致死浓度药液处理后,从幼螨发育至成螨时的存活率分别为对照的32.00%、46.00%和72.00%;总产卵量分别是对照的6.23%、17.58%和34.24%;处理2 d后的捕食线虫能力分别是对照的34.70%、53.06%和62.59%;但对卵的孵化率无显著影响。修长蠊螨控缓速释放和直接释放均能减少空心菜根系的根结数量和根结线虫卵囊数量,有效控制空心菜根结线虫的发生。各项防治处理30 d后,修长蠊螨直接释放处理、控缓速释放处理、修长蠊螨和阿维菌素联合施用处理以及仅施用阿维菌素处理的空心菜根际根结数量和线虫卵囊数量,分别比未防治对照处理减少28.97%和64.38%、49.97%和74.43%、81.92%和92.24%以及80.15%和92.69%。所以修长蠊螨控缓速释放的控制效果显著好于直接释放,但是修长蠊螨与阿维菌素联合施用不能提高防效。

西藏作物根际垫刃科线虫3个新记录种

在对西藏农区的植物线虫种类进行调查期间,采集了多种作物的根系组织和根际土壤样品,采用改良贝曼漏斗法对样品中的线虫进行分离,根据形态学特征,从分离的线虫样品中鉴定出3种垫刃科线虫,分别为微针垫刃线虫(Tylenchus stylolus Xie&Feng, 1995)、双绢丝尾垫刃线虫(Filenchus ditissimus(Brzeski, 1963)Siddiqi, 1986)和伊朗平滑垫刃线虫(Psilenchus iranicus Kheiri, 1970),本文对其进行了描述。这3种线虫均为西藏地区新记录种,其中垫刃属和平滑垫刃属为西藏地区新记录属,微针垫刃线虫为首次在梨树上发现。

鱼腥草次生代谢产物及其抗细菌活性

【目的】为了分析和鉴定鱼腥草挥发油的化学组成,测定鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物对7种供试细菌的抑制活性。【方法】本文采用水蒸汽蒸馏法和甲醇冷浸提取法分别提取鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物,通过GC-MS对提取得到的挥发油进行化学成分分析,采用抑菌圈法和TIC-MTT-生物自显影法分别测定挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物对供试细菌的抑制活性。【结果】鱼腥草挥发油的得率为0.09%,从鱼腥草挥发油中共鉴定出49个组分,占总相对含量的93.35%,主要成分是β-蒎烯(23.65%)、2-十三烷酮(12.38%)、甲基正壬酮(8.55%)、乙酸冰片酯(4.08%)、月桂酸(3.77%)、1-十三烯(3.51%)、氧化石竹烯(2.97%)和香附烯(2.59%)等。鱼腥草挥发油对7种供试细菌均表现出一定的抑菌作用,其中对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强,抑菌圈直径为(20.0±2.0)mm,而对溶血葡萄球菌的抑制活性最弱,抑菌圈直径仅为(8.7±0.6)mm;对桉树青枯病菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性要强于硫酸链霉素。鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物未表现出任何抗菌活性。【结论】鱼腥草中含有丰富的挥发性成分,且抗菌活性物质主要分布于挥发油中;鱼腥草挥发油对桉树青枯病菌和黄瓜角斑病菌表现出较好的抑制活性,对革兰氏阴性菌的抑制活性要强于革兰氏阳性菌。

一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法

为开展水稻纹枯病菌蛋白质组学的研究,采用TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法对水稻纹枯病菌蛋白质提取质量进行比较,并建立了双向电泳体系。对电泳后的图谱用Quantity One软件进行分析,结果发现:TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法所获得的蛋白质双向电泳图谱中,分别记录得到557、309和877个蛋白质点。SDS法提取的蛋白质样品杂质较多,存在盐离子和小分子物质干扰,得到的蛋白点较少;TCA-丙酮法提取的蛋白质样品呈黄色,有色素残留;而在TCA-丙酮法的基础上,增加酚/SDS抽提步骤,能够有效地去除样品中的盐离子和色素等杂质,获得背景清晰、分辨率高的蛋白图谱。结果表明,本研究建立了一种优化的TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法,该法适用于水稻纹枯病菌蛋白质双向电泳的提取。

香蕉枯萎病菌4个生理小种核糖体DNA内转录间隔区的RFLP分析

【目的】明确香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4个生理小种的系统发育关系。【方法】利用PCR扩增该病菌4个生理小种的核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS),利用AIu I、Hpa II和Taq I 3种限制性内切酶对这些小种的ITS产物进行RFLP分析。【结果】PCR扩增结果表明:来自4个生理小种的8个菌株均可扩增得到568 bp的ITS单一片段,但这些生理小种间的片段没有明显的多态性;对这些生理小种ITS产物进行RFLP分析发现,不同生理小种之间的差异很小。【结论】PCR-RFLP技术不适用香蕉枯萎病菌生理小种的分析鉴定。

温度和露时对荔枝霜疫霉侵染发病的影响

【目的】研究不同温度和露时条件下荔枝霜疫霉Peronophythora litchi病菌孢子囊的萌发和侵染动态,并以此为变量构建数学模型,以期为病害精准预测预报及防控提供参考和依据。【方法】在人工控温、控湿条件下,研究温度(15~30℃)和露时(2~24 h)对荔枝霜疫霉孢子囊萌发和侵染的影响;选用韦布尔模型的修正式,在SAS软件中拟合得到准确度较好的孢子囊萌发和发病严重度模型,进而绘制其对应的等高线风险预测图。【结果】温度、露时及其交互作用可显著影响荔枝霜疫霉孢子囊的萌发及寄主发病的严重度。荔枝霜疫霉孢子囊萌发率和寄主发病严重度随着露时的延长而逐渐升高。在温度为25℃时,所有露时处理条件下的孢子囊萌发率达到最高;露时相同的条件下,当温度为25℃时,孢子囊侵染荔枝果实发病严重度最强。当温度为22~30℃、露时为3~24 h时,叶片的病害严重度超过0.2;孢子囊侵染果实发病迅速且严重,当温度为15~30℃、露时约2~3 h时,果实发病的严重度高于0.6。荔枝霜疫霉侵染叶片和果实发病严重度模型分别为f(t,θ)={1−exp[−(0.1943×t)2]}/cosh[(θ−27.7696)×0.9277/2]和f(t,θ)={1−exp[−(0.4693×t)2]}/cosh[(θ−24.556)×0.1709/2]。【结论】荔枝霜疫病发生依赖于温度和露时,本研究建立的模型可以用于指导生产上防治该病害的施药时间和次数。

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。

水稻纹枯病菌RsCat基因的克隆及其表达分析

为阐明水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)过氧化氢酶基因(RsCat)的功能,采用常规PCR和RT-PCR技术克隆得到RsCat基因。生物信息学分析表明,RsCat基因DNA和cDNA的全长序列分别为1814bp和1 395bp,开放阅读框(ORF)编码464个氨基酸。保守结构域分析显示,RsCat蛋白具有过氧化氢酶超家族结构域和过氧化氢酶相关免疫反应结构域。系统进化分析显示:水稻纹枯病菌不同融合群的RsCat基因具有较高的序列同源性。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:RsCat基因的表达受儿茶酚的诱导,随着儿茶酚质量浓度增大,表达量上调,而随着儿茶酚质量浓度增大,CAT活性降低。说明RsCat基因的转录表达和CAT酶活不存在对应性。推测RsCat基因可能存在转录后或表达产物翻译后修饰。

南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

由可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)引致的溃疡病是目前威胁南洋楹健康生产和品质的重要病害。快速、准确检测病原菌是进行病害有效防控的基础。本研究用南洋楹溃疡病菌翻译延伸因子(EF 1-α)编码基因上保守靶基因区域的序列设计特异性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR组合进行巢式PCR扩增,获得264 bp的单一条带,灵敏度检测最低限度为1 fg/μL。利用建立的巢式PCR方法对林间疑似溃疡病的病样进行检测,能够特异性地检测到L.theobromae。本研究建立的巢式PCR检测方法准确、特异且灵敏性高,可为南洋楹溃疡病的早期诊断和及时防控提供基础的理论和实践依据。

儿茶酚和莨菪碱对水稻纹枯病菌氨基酸合成和分泌的影响

【目的】为明确水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG 1-IA)黑色素形成前体物质酪氨酸等氨基酸成份在不同培养处理中的差异。【方法】利用氨基酸分析仪对水稻纹枯病菌在3种培养处理(PDB对照,添加了300μg/mL质量浓度莨菪碱的PDB和50μg/mL质量浓度儿茶酚的PDB)后菌丝体和发酵液的氨基酸成份进行了分析。【结果】水稻纹枯病菌菌丝体中谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富,而谷氨酸的含量最高,达到总氨基酸的15.49%;水稻纹枯病菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量最为丰富,分别达到了总氨基酸的17.83%和58.21%;在3种处理中,不管是菌丝体还是发酵液中,都是谷氨酸和天冬氨酸最为丰富。影响水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成的前体物质酪氨酸的含量在3种处理的菌丝体中没有显著差异;但300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组中的苯丙氨酸含量都存在显著差异,而对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组的苯丙氨酸含量差异不显著。水稻纹枯病菌发酵液中对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组酪氨酸含量没有显著差异,但是300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组酪氨酸含量都存在显著差异,而苯丙氨酸在发酵液中差异不显著。【结论】影响水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液黑色素形成的氨基酸不同,苯丙氨酸对水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成更加重要,而酪氨酸对水稻纹枯病菌发酵液黑色素形成更加重要,以上结果为氨基酸对水稻纹枯病菌黑色素形成的影响提供了参考依据。

化学物质对水稻纹枯病菌黑色素形成的影响

【目的】水稻纹枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1 IA融合群引起的真菌病害,本研究旨在明确外界培养条件与水稻纹枯病菌黑色素形成的关系。【方法】采用菌丝生长速率法和紫外分光光度法,测定化学肥料[500μg/mL K2SO4、NaH2PO4、CO(NH2)2]、金属离子(5μg/mL CuSO4、FeSO4、ZnSO4)、抗氧化剂(5μg/mL槲皮素、桑色素、抗坏血酸)和对照(300μg/mL莨菪碱、50μg/mL儿茶酚、水)对水稻纹枯病菌菌丝生长速率、菌核数量、菌核鲜质量和干质量以及黑色素含量的影响。【结果】500μg/mL K2SO4、NaH2PO4和CO(NH2)2,5μg/mL CuSO4和ZnSO4,5μg/mL槲皮素、桑色素和抗坏血酸以及50μg/mL儿茶酚溶液对水稻纹枯病菌黑色素的形成均有促进作用。其中,500μg/mL的CO(NH2)2处理下,水稻纹枯病菌产生黑色素最多,为113.2 mg;而300μg/mL的莨菪碱处理下,水稻纹枯病菌产生黑色素最少,为37.4 mg。【结论】水稻纹枯病菌黑色素的产生与菌丝生长速率和菌核发育没有必然的联系,即抑制菌丝生长和菌核发育的化学物质,不一定能够抑制黑色素的形成。本研究结果可为水稻纹枯病防控机理的研究提供依据。

轮作和高温闷地在克服蔬菜连作障碍上的应用

连作障碍已成为当前蔬菜生产上的一个重要问题,为改善土壤理化性质和增加微生物量以克服蔬菜连作障碍,在深圳福田郊区的农科推广中心同乐蔬菜基地选择了蔬菜连作多年的田块,分别采用了水稻蔬菜轮作和利用夏季高温在地面短期覆盖塑料薄膜进行高温闷地技术,通过观测土壤中微生物含量和土壤理化性质的变化,分析这2种措施对蔬菜连作地的改良效果。结果显示:水旱轮作和夏季短期高温闷地均能改善土壤养分含量,尤其是提高土壤中速效钾的含量,并降低土传病原微生物的含量;高温闷地措施能显著提高土壤微生物的含量,其中细菌和放线菌的含量增幅明显,而水旱轮作措施对土壤微生物的影响较小。该研究表明水旱轮作和高温闷地措施在不同程度上改善了土壤微生物种群及土壤理化性质,在探索克服蔬菜连作障碍方法的方面具有较好的示范和推广应用价值。

细胞自噬相关基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的定量分析

在前期研究中,采用RNA-seq技术获得了在水稻纹枯病菌菌核发育过程中差异表达的6个自噬相关基因,为阐明这些基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的表达模式,提取了菌核发育过程中3个阶段的RNA,根据特异基因的序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术分析这些基因的表达谱。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶和ssp1、ATG13和Vam6基因的表达量在白色菌核形成阶段的表达量显著升高,而在菌核发育成熟阶段的表达量明显下降。而丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶基因和丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白基因的表达量在菌核发育阶段呈现出连续下降的趋势。研究发现这6个与细胞自噬有关的基因的表达谱与转录组测序的结果一致,表明转录组测序的结果可靠;同时也表明了这些基因高度响应了菌核的发育过程。

添加化肥和覆膜提高土温对土壤中香蕉穿孔线虫的灭除效果

【目的】研究化肥和阳光照射作用对土壤中香蕉穿孔线虫的灭除效果。【方法】利用在感染香蕉穿孔线虫的病土中添加化肥并覆盖塑料薄膜的方法。【结果】采用添加石灰氮或尿素并覆盖白膜或黑膜的处理方法均促使了土壤温度升高;在当地晴日平均气温最高值达到38.8℃以上,并保证晴日数在31 d以上,采用添加石灰氮或尿素并覆膜处理5周以上的时间,可有效灭除土壤中香蕉穿孔线虫;在当地晴日平均气温最高值达到37.6℃以上,并保证晴日数在38 d以上,采用添加石灰氮或尿素并覆膜处理6周以上的时间,同样可灭除土壤中香蕉穿孔线虫;在各处理方法中,1 L土壤加石灰氮10 g并覆盖白色薄膜处理的土壤温度提升效果最好。【结论】在高温季节,在土壤中添加石灰氮或尿素并覆盖塑料薄膜的方法均能灭除病土中的香蕉穿孔线虫。

水稻橙叶病分子检测及其在华南地区的发生与分布研究

对华南地区水稻橙叶病(rice orange leaf disease)进行病原菌分子检测和病情发生与分布调查。结果表明,该病是一种由电光叶蝉(Inazuma dorsalis)和黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps)传播的植原体(Phytoplasma)引起的病害,早期感病植株在分蘖期全株叶片表现为橙黄色,不久干枯死亡,对水稻生产造成严重为害。电镜下观察,病株幼叶叶脉筛管细胞中存在大量植原体。巢式PCR可从来源于水稻病株及介体电光叶蝉和黑尾叶蝉DNA抽提物中获得单一扩增产物,PCR产物核苷酸序列与文献报道的水稻橙叶植原体16S r DNA序列(Gen Bank登录号:KR061356)同一率均为99.8%以上。2015年广东各主要稻区及海南中部和广西东南部均有该病发生与分布。