非洲猪瘟病毒细胞传代致弱株研究进展

目前非洲猪瘟(African swine fever,ASF)仍无疫苗可用,使得该病防控难度较高。早期非洲猪瘟病毒(ASFV)的弱毒株研制主要通过细胞传代方式。经过国外多年研究积累,现已经在多种细胞上获得毒力致弱毒株。细胞传代致弱株是ASF疫苗研究的候选方向之一,且对于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指导借鉴作用。国内目前尚无这方面的调查研究,为此对国际上ASFV细胞传代致弱毒株相关研究进行整理,分析其传代致弱规律,以期为我国ASFV细胞适应株研究及新型疫苗研制提供参考。

非洲猪瘟自然弱毒株演变进程

自2018年非洲猪瘟(African swine fever,ASF)传入中国以来疫情得到了有效控制。但2021年以后,我国的ASF流行情况出现了新的变化,临床中出现了“自然变异株”。这些毒株可能导致感染后临床症状不典型,容易与其他疫病混淆等问题。这与国外的流行演变规律一致,即当ASF在一个国家或地区流行较长时间后,其临床表现将由急性发病转变为缓慢发病或出现新的临床表现。经过多年的观察积累,国外已经对该病毒的流行规律特别是自然弱毒株的演变进程有了大量记载,但国内目前尚无这方面的描述。为此,就ASF自然弱毒株的演变进程进行综述,从而提出加强血清学诊断产品研发、加快产业化报批进程、适时开展血清学监测追溯等建议,以期为我国ASF科学防控提供参考。

补偿生长对湖羊肝脏组织中Hippo信号通路相关基因表达的影响

[目的]本试验旨在探究早期能量限饲与后期能量补偿对湖羊生长性能、肝脏组织中Hippo信号通路核心基因和AMPK蛋白表达的影响。[方法]选择32只系谱背景清楚、体质量相近的3月龄雄性湖羊羔羊,随机均分为对照组和补偿生长组。试验分为能量限饲(60 d)和补偿(90 d)2个阶段,能量限饲阶段对照组和试验组饲喂日粮的代谢能分别为11.64和6.84 MJ·kg^-1,在能量补偿阶段日粮的代谢能均为12.86 MJ·kg^-1。饲养结束后屠宰,测定,再通过RT-qPCR和Western blot检测肝脏组织中Hippo通路核心基因和AMPK蛋白的表达变化。[结果]在能量限饲阶段,与对照组相比,能量限饲显著降低了补偿组湖羊的肝脏质量和体质量(P<0.05),湖羊肝脏组织中Hippo通路核心基因和YAP1蛋白的表达量显著降低(P<0.05),而AMPK的mRNA和蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。在能量补偿阶段,补偿组湖羊的肝脏质量和体质量、湖羊肝脏组织中Hippo通路核心基因(除YAP1外)的表达量和AMPK蛋白的磷酸化水平均与对照组差异不显著。[结论]湖羊在适当水平的能量限饲后进行补偿处理具有补偿生长现象,Hippo通路和AMPK蛋白可能共同参与不同营养水平下对湖羊肝脏发育的调节。

霍乱弧菌荧光RAA快速检测方法的建立和应用

为了建立一种快速检测霍乱弧菌的方法,试验采用重组酶介导的等温扩增(Recombinase-aided amplification, RAA)方法对霍乱弧菌进行检测,并进行了特异性试验、灵敏度试验、模拟样品12 h增菌培养前后的检测、100份水产品的实际检测。结果表明:副溶血性弧菌、创伤弧菌等12株非霍乱弧菌的标准菌株DNA扩增结果为阴性;对霍乱弧菌分离株的检测限为6.7×10^(2)cfu/mL;增菌培养前,模拟样品中的霍乱弧菌最低检测限为6.7×10^(2)cfu/mL,增菌培养12 h后最低检测限为6.7×10^(-2)cfu/mL;荧光RAA方法与细菌分离划线方法对100份水产品的检测结果一致,30 min即可得到检测结果且仪器便携度高。说明试验建立的荧光RAA方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,适用于现场大批量样品检测。

副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统1内杆状蛋白基因vscI的功能分析

[目的]Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion systems,T3SS)在副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)致病过程中发挥重要作用。本试验旨在探讨T3SS1内杆状蛋白基因vscI的功能。[方法]以副溶血弧菌POR-1菌株为研究对象,构建vscI缺失株ΔvscI与回补株CΔvscI,检测野生株、缺失株与回补株的细胞毒性、细胞黏附等生物学特性,分析vscI缺失对副溶血弧菌感染细胞能力的影响;通过Western blot与ELISA检测HeLa细胞内效应蛋白的易位量。[结果]与POR-1菌株相比,缺失菌株ΔvscI在生长速度上并无显著差异,但对HeLa细胞的黏附能力下降85%。细胞毒性检测结果显示:与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscI感染细胞组释放LDH量显著下降60%。同时与野生株POR-1感染HeLa细胞组相比,ΔvscI感染HeLa细胞组发生凋亡的细胞数量显著下降了85%。腺苷酸环化酶报告系统研究结果显示:与POR-1菌株感染组相比,ΔvscI菌株感染HeLa细胞内的cAMP含量显著下降,CyaA融合蛋白的易位量显著下降,而在回补株CΔvscI中上述生物性状均恢复。[结论]vscI提高了副溶血弧菌对细胞的黏附能力和毒力,促进细胞凋亡,同时对于T3SS1效应子的易位是必需的。

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1∶256000;Western blotting和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别DTMUV感染细胞样品的Capsid蛋白。【结论】本研究成功制备小鼠抗Capsid蛋白多克隆抗体,为深入研究DTMUV Capsid蛋白的结构和功能提供了试验材料,为进一步阐明DTMUV的致病机制奠定基础。

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及Ⅲ型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有两套Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白VopR的分泌差异不显著,ΔvcrV菌株侵染HeLa细胞的过程中,VopR的易位量显著下降。【结论】vcrV基因参与T3SS1介导的细胞毒性过程,对于副溶血弧菌T3SS1效应蛋白易位是必需的,具有过表达载体的ΔvcrV仍能分泌效应蛋白VopR。