南京地区西花蓟马发生调查及其分子检测

以西花蓟马和烟蓟马的线粒体DNA的COI基因设计特异性引物,建立了西花蓟马PCR快速检测方法,该方法可以检测1/120单头成虫,对各种虫态均可进行特异性检测。对南京54种植物花器中蓟马种类进行了调查,通过形态特征和线粒体DNA的COI基因分子检测,均证明西花蓟马已在其中25种植物上发生,西花蓟马种群数量达蓟马总量20%的有11种植物,超过30%的有5种。

Ⅲ型分泌装置蛋白HrcJ决定条斑病菌在植物上的过敏反应和致病性的研究

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因编码形成的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS),将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ蛋白C端跨膜结构域可与HrcV互作,提示HrcJ蛋白联接于T3SS装置的内膜和外膜之间。功能互补结果显示,缺失脂蛋白结构域和跨膜结构域的hrcJ基因均不能恢复hrcJ突变体在烟草上的HR激发能力和在水稻上的致病性。RT-PCR结果显示,hrcJ的表达受hrpX基因调控,hrcJ基因突变后不影响效应分子hpa1的表达。【结论】hrcJ基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发HR的关键因子,其基因产物参与了T3SS装置的形成。

广聚萤叶甲幼虫取食植物对产卵选择行为的影响

产卵选择性是衡量植食性昆虫寄主专一性的主要性状之一。为揭示广聚萤叶甲幼虫取食的植物是否影响其成虫产卵植物选择性，于室外网室中采用重复观测设计开展试验，研究幼虫期取食靶标豚草或非靶标苍耳对成虫在这2种植物上的产卵选择性。在非选择性试验中，广聚萤叶甲幼虫取食豚草和苍耳后的产卵数量没有显著差异；但成虫在2种植物上的产卵数量存在显著差异，如幼虫分别在豚草和苍耳上取食，其成虫在豚草上分别产18.94和21.90粒卵，而在苍耳上分别产24.39和25.12粒卵。对卵粒大小（用体积表示）的分析表明，产卵植物之间及其与幼虫取食植物互作对卵粒大小均无显著影响，但幼虫取食不同植物的成虫所产卵粒大小存在显著差异，幼虫取食豚草的成虫产卵粒显著大于取食苍耳的产卵粒。卵孵化率为60%～70%，在各处理之间没有显著差异。在选择性试验中，对产卵选择频次的分析未发现幼虫取食不同植物以及成虫产卵测试植物等处理影响产卵选择偏好。本研究结果说明，广聚萤叶甲雌成虫产卵数量决策行为受幼虫取食植物的影响不大。

水稻白叶枯病菌致病性分子遗传学基础

水稻-白叶枯病原菌互作符合基因对基因关系,是研究禾本科植物-病原菌互作的理想模式系统。目前已鉴定和克隆出许多白叶枯病菌致病相关基因。其它革兰氏阴性植物病原细菌致病性分子遗传学和基因组学研究,为揭示水稻白叶枯病菌致病性分子机理提供了丰富的背景知识,其中以发掘TTSS效应分子的研究备受关注。本文将对白叶枯病菌致病性分子机理进行综述,以期为研究水稻-白叶枯病菌互作的功能基因组学提供科学线索。

枯草芽孢杆菌生防菌株NJ-18的发酵条件优化

通过单因子试验筛选到了适合枯草芽孢杆菌NJ-18生防菌株生长及其拮抗物质产生的最佳碳源为玉米粉和麦芽糖,最佳氮源为豆粕,最佳金属离子是Ca2+。用正交试验法确定了该培养基各组分的最佳含量为:玉米粉10g.L-1、麦芽糖30g.L-1、豆粕30g.L-1、CaCO31.5g.L-1;在确定适合该菌株的培养基组分基础上,对其培养条件进行优化试验,结果表明:初始pH为6.8、培养温度为28℃、250mL摇瓶装液量为90mL、接种量为2%(体积分数)、培养时间为36h、转速为180r.min-1时为该菌株的最佳培养条件。

西藏低温适生芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌和促生作用

从西藏拉萨色拉寺杂草根围土壤中分离到1株低温适生芽孢杆菌LSSC3,对该菌株进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定及抗菌和促生作用研究。菌株LSSC3细胞短杆状,芽孢圆形,10℃条件下生长良好。生理生化特征显示,该菌株与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium特征一致,但ERIC-PCR指纹图谱分析表明其与B. megaterium模式菌株存在显著差异。16SrRNA基因序列分析结果显示,菌株LSSC3与B. subtilis和B. atrophaeus的系统发育相似性均很高。进一步通过gyrB基因测序和比对,其同源性与B. atrophaeus达到100%,没有找到与B. subtilis的同源性关系。据此,将其鉴定为B. atrophaeus。菌株LSSC3对植物病原真菌和细菌均具有很强的抑制作用,同时对拟南芥有良好的促生长作用。该菌具有耐低温和生防的双重特点,具有在农业生产上应用的潜力。

彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

近几年南京种植的彩色马蹄莲软腐病发生严重,从不同品种的彩色马蹄莲不同部位病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorasubsp.carotovora,P.c.c)。信号分子检测结果表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子。利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌中的attM基因,其编码的AttM解酯酶可以显著降解AHLs,在离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,这为有效控制彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径。

2007年江浙地区二化螟抗药性检测

【目的】2007年测定江苏、浙江地区二化螟对杀虫单、三唑磷、氟虫腈、阿维菌素及拟除虫菊酯类等9种杀虫剂的抗性,以及6类20种杀虫剂对东海二化螟的毒力,为指导用药提供科学依据。【方法】采用4龄幼虫点滴法测定。【结果】(1)瑞安、苍南、高淳种群对杀虫单具有极高水平抗性(164.8～248.1倍),连云港和东海种群具有中等水平抗性(18.1和25.1倍)。(2)5个种群对三唑磷的敏感性变化很大,其中瑞安、苍南、高淳种群为极高水平抗性(204.8～1395.2倍),连云港和东海种群未检测到明显的抗性(1.8和3.1倍)。(3)瑞安、苍南种群对氟虫腈为中等水平抗性(12.3和26.8倍),其它3个种群为敏感水平(1.3～2.9倍)。(4)苍南种群对阿维菌素产生低水平的抗性(7.6倍),其它种群尚处于敏感水平(0.9～2.0倍)。(5)瑞安、苍南种群对氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯及溴氰菊酯为中～高水平的抗性,其它3个种群对除氰戊菊酯以外的4种拟除虫菊酯为低～中水平的抗性(5.3～31.2倍)。(6)测试的20种药剂对东海种群二化螟的毒力次序为:阿维菌素、甲氨基阿维菌素>伊维菌素、高效氟氯氰菊酯>丁烯氟虫腈、氟虫腈、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、虫酰肼≥辛硫磷、喹硫磷、呋喃虫酰肼、三唑磷、哒嗪硫磷>马拉硫磷、毒死蜱、氟硅菊酯>杀虫单。【结论】不同地区二化螟种群对药剂的抗性存在差异,应根据当地的抗性水平有针对性地进行抗性治理。

中国水稻条斑病细菌avrBs3/PthA家族基因的克隆和序列分析

水稻条斑病细菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xooc)和水稻白叶枯病菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)是稻黄单胞菌种下的致病变种,是水稻上的模式病原菌。用Xoo无毒基因avrXa3对应的NLS和AD区域的DNA片段构建探针,筛选Xooc基因文库,再通过酶切归类和Southern杂交分析,从Xooc中获得2个avBs3r/PthA家族基因克隆,分别被命名为avr/Pth13和avr/Pth14。序列测定结果显示,它们与avrBs3PthA家族成员,几乎一样的5′端和3′端、1个亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ)、3个核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS)和1个酸性转录活化域(acidictranscriptionalactivationdomain,AD),不同的只是102bp重复单元的重复次数不等:avr/Pth13基因102bp重复5.5次,avr/Pth14基因为19.5次。蛋白质水平上同列比较发现,AvrBs3/PthA家族成员34aa重复单元的第12和第13位氨基酸为HD的至少需要3个,才可能满足毒性或无毒性功能。将avr/Pth13和avr/Pth14基因分别导入Xoo菌株PXO99A中之后,在抗水稻白叶枯病近等基因系上测定其致病性,发现avr/Pth13基因增强了PXO99A的致病能力,而avr/Pth14基因则减弱了PXO99A的致病力。以上结果提示,Xooc与Xoo一样,都存在avrBs3/PthA基因家族的无毒基因。从Xooc中克隆avr/Pth13和avr/Pth14基因在国内外尚属首次,?

油菜田日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗药性的研究

【目的】明确油菜田日本看麦娘(Alopecurus japonicus Steud.)对高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-R-methyl)的抗药性及对其它药剂的交互抗性水平。【方法】利用种子生物测定法和整株测定法测定了江苏、安徽11个点油菜田日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗药性,并用同样方法进行了相关药剂的交互抗性测定。【结果】两种方法测定结果基本相符。种子生物测定结果显示,江苏句容点日本看麦娘对此药剂的相对抗性倍数达61.13,整株测定结果为1331.68,说明句容点的日本看麦娘对此药剂已产生明显抗性。交互抗性测定结果显示,日本看麦娘对芳氧基苯氧基丙酸酯类(aryloxyphenoxypropionates,简称AOPP)其它药剂已产生了不同程度的抗性,抗性水平依次为精吡氟禾草灵>精喹禾灵>精噁唑禾草灵;对具相同作用靶标的环已烯酮类(cyclohexanediones,简称CHD)除草剂烯禾啶的抗性水平相对较低。室内测定结果与田间实际反映情况相吻合。【结论】种子生物测定法可作为杂草抗性水平测定的方法之一。油菜田日本看麦娘对AOPP类高效氟吡甲禾灵已产生不同程度的抗药性,其中句容点抗性最高,对同类产品精吡氟禾草灵的交互抗性水平也最高;对与AOPP类除草剂具有不同结构、相同作用机制的CHD类烯禾啶交互抗性水平较低。

水稻黄单胞菌avrBs3/PthA家族基因研究进展

水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和稻生致病变种(X.oryzaepv.oryzicola,Xooc)分别引起水稻白叶枯病(bacterialblight,BB)和水稻细菌性条斑病(bacterialleafstreak,BLS),对中国和世界水稻产量造成较大损失。基因组学揭示,Xoo和Xooc不同小种中存在15～30个数量不等的avrBs3/PthA(avr/pth)家族基因。新近研究结果表明,avr/pth基因既是毒性基因,又是寄主植物先天免疫的抑制因子,还是与抗病基因(R)匹配的无毒基因。Xooc中虽然存在avr/pth基因,但因存在能够抑制avr/pth无毒基因功能的抑制因子,故而未在水稻中发现抗BLS的R基因。除结构上的共有特征外,avr/pth基因间的差异主要表现在102bp重复单元在每个avr/pth基因中的重复数多少上。avr/pth基因的进化可能由简单进化为复杂,这可能是Xoo和Xooc致病性变异的主要原因。

转harpin_(Xooc)蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。

复合免疫制备3种有机磷农药单克隆抗体的技术研究

以α-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱3种有机磷农药人工半抗原(H1、H2和H3);通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备免疫原和包被原。以等体积混合的H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA复合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体获4株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中甲基对硫磷1株(H9/A3),杀螟硫磷2株(H9/B3、C8/H6),甲基毒死蜱1株(G7/F5)。所获4株抗体的类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链,间接ELISA法测定腹水效价均高达1×106。间接竞争ELISA法测定H9/A3、C8/H6和G7/F5细胞株的抑制中浓度(I50)分别为107.0、40.4和75.2μg.L-1,且与类似物无交叉反应。本研究建立了一种可在较短的研制周期内,通过单次细胞融合获得多种不同农药的单克隆抗体的有效方法。

西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测

【目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的分子检测技术,为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【方法】根据GeneBank中Colletotrichum属的24个种ITS序列,比较设计出1对引物CY1/CY2(CY1:5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′;CY2:5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′);进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌C.orbiculare和菜豆炭疽菌C.lindemuthianum,找出在C.orbiculare中的特异性条带,经过克隆、测序后,设计出1对SCAR引物RB/RC。【结果】引物CY1/CY2可以特异的从C.orbiculare和C.lindemuthianum菌株中扩增到1条442 bp的条带,将这2个种的炭疽菌和其它炭疽菌种以及其它真菌种分开。引物RB/RC可以特异地在C.orbiculare中扩增出1条216 bp条带,将C.orbiculare和C.lindemuthianum分开。采用2对引物组成双重PCR,将C.orbiculare进行特异性扩增,可获得442 bp和216 bp的2条特异性条带。【结论】利用上述2对引物组成双重PCR检测体系,快速鉴定C.orbiculare,并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽菌C.orbiculare检测出来,灵敏度可以达到1pg.μl-1。

水稻条斑病细菌中新发现的avrBs3/PthA家族新成员avr/pth13基因

用水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)无毒基因avrXa3对应的核定位信号(Nuclearlocali-zationsignal,NLS)和酸性转录活化域(Acidictranscriptionalactivationdomain,AD)的DNA片段构建探针,筛选水稻条斑病细菌(X.o.pv.oryzicola,Xooc)基因文库,获得avrBs3/PthA家族基因阳性克隆p13。序列测定和分析结果显示,avr/pth13基因长度为2268bp,编码755氨基酸,与avrBs3/PthA家族其他成员一样,具有几乎一样的5’端和3’端、1个亮氨酸拉链(Leucinezipper,LZ)、3个NLS和1个AD区域,不同的是102bp重复单元的重复数为5.5。蛋白质水平上同列比较发现,Avr/Pth13中第3、4和5个34氨基酸重复单元的第12和第13位氨基酸均为HD(组氨酸和天冬氨酸),蛋白质的C-端没有SGSVGGTI残基。目前avr/pth13基因是该家族的最小成员。将avr/pth13基因导入Xoo菌株PXO99A中,在水稻近等基因系上致病性测定结果显示,avr/pth13基因增强了Xoo的致病能力。以上结果证实,水稻条斑病细菌与水稻白叶枯病菌一样,都存在avrBs3/PthA家族基因,决定着Xooc的毒性或/和无毒性。

亚致死剂量吡虫啉和吡蚜酮对褐飞虱生物适合度的影响

全面评价了亚致死剂量吡虫啉和吡蚜酮对褐飞虱繁殖力和生存力的长期影响。毒力测定结果显示,吡虫啉和吡蚜酮对褐飞虱3龄若虫的LC50分别为42.41mg/L和396.46mg/L,吡虫啉毒力约是吡蚜酮毒力的9.35倍。通过建立褐飞虱在吡虫啉和吡蚜酮亚致死剂量(LC30)作用下的生命表,发现褐飞虱在两种药剂处理下生物适合度都有所下降,分别为对照试虫的83.8%和8.4%。吡虫啉处理试虫仅羽化率明显低于对照,而吡蚜酮处理试虫的羽化率、雌虫比例、雌成虫寿命和卵孵化率各参数都明显下降。亚致死剂量的吡蚜酮使褐飞虱日产卵节律和卵孵化高峰都有所推迟,这可能是吡蚜酮对褐飞虱产生取食抑制作用进而导致其生殖器官发育缓慢造成的。

中国主要稻区稻瘟病菌交配型分布及其育性能力的差异

用4 个稻瘟病菌的标准交配型菌株,对1998～2003 年中国13个省(区)、市,670个稻瘟病菌单孢分离菌株的可育性和交配型进行了测定。结果表明,中国稻瘟病菌广泛存在MAT1-1、MAT1-2两种交配型菌株。可育菌株占测试菌株的40.3%,MAT1-1和MAT1-2菌株分别为21.9%、18.4%。不同稻区稻瘟病菌有性世代的形成能力有很大差异。用PCR技术对中国稻瘟病菌交配型进行快速分子测定,发现MAT1-1和MAT1-2菌株分别占62.5%和37.5%,绝大多数稻区同时存在两种交配型菌株。结果提示,尽管在自然界中很难发现稻瘟病菌的有性世代,有性杂交导致的稻瘟病菌的遗传变异仍然是稻瘟病菌遗传多样性的一种潜在的原因。

水稻白叶枯病菌内源过氧化氢的产生及定位

采用辣根过氧化物酶-酚红法定量检测病原菌细胞内源过氧化氢的产生,并通过组织化学法观察细胞中过氧化氢积累的亚细胞定位。结果表明:辣根过氧化物酶-酚红法及组织化学染色法均检测到水稻白叶枯病菌内源过氧化氢的产生。透射电子显微镜观察结果和辣根过氧化物酶-酚红法定量检测结果均显示,过氧化氢在水稻白叶枯病菌细胞中普遍存在,不同病原菌内源过氧化氢的水平有极显著差异。病原菌细胞中过氧化氢的积累主要定位在细胞壁。

基于分子证据探讨松材线虫在中国的传播途径

采用11个随机引物对来自中国最早发病的5个省和日本疫区的松材线虫共10个居群进行遗传多样性分析和系统发育分析，拟从分子水平探讨松材线虫病在中国蔓延的可能途径。结果表明：中国松材线虫居群间 存在明显的遗传差异，遗传距离为0．066—0．262；除了安徽明光的居群自成一支外，其他居群均与南京居群聚成一支，其中安徽皖南和浙江岱山居群与南京中山陵居群遗传距离最近，为0．066；安徽明光居群与南京居群的遗传距离最大，为0．262。表明发生在安徽皖南和浙江岱山等地的松材线虫病可能是由最早发病的南京地区扩散的；而发生在毗邻南京的安徽明光的松材线虫病不是由南京地区扩散的。该结果揭示，松木制品的调运等人为远距离传播是松材线虫在我国蔓延的主要途径之一。

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8 a基因。将该基因导入菲律宾小种6的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8 a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori(携有成株期抗性基因Xa17)的毒性,暗示avr/pthC8 a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8 a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8 a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8 a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。