GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞(neural stem cell,NSC)PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法:取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白(Nestin)的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果:成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为BetaⅢTubulin阳性的神经元细胞。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。

WFS1突变致聋家系的鉴定及斑马鱼同源基因时空表达谱分析

目的:对2个遗传性耳聋家系进行分子病因学鉴定,并应用斑马鱼对致聋基因WFS1进行初步功能分析。方法:利用靶向捕获测序技术,对2个家系进行外显子测序分析,确定候选致病基因。生物信息学预测人WFS1基因的功能以及模式生物斑马鱼与人类WFS1基因的同源性;采用整胚原位杂交和定量PCR法分析斑马鱼wfs1a和wfs1b的时空表达特征。结果:外显子测序及家系遗传共分离分析确定WFS1基因c.2036~2038delAGG(p.680delE)和c.1957C>T(p.653R>C)突变分别是2个家系的分子病因。定量PCR和全胚原位杂交结果显示斑马鱼wfs1a和wfs1b在胚胎发育不同时期呈现不同的时空表达特征。生物信息学分析提示wfs1b与人WFS1基因的进化距离更近,同源性更高。结论:2个遗传性耳聋家系均由WFS1突变所致,拓展了遗传性耳聋的基因突变谱。斑马鱼胚胎发育过程中wfs1a和wfs1b具有明显的时空表达特异性,wfs1b是人类WFS1的直系同源基因。研究结果既为耳聋分子诊断提供了支持,也为后续深入研究WFS1的突变致聋机制奠定了基础。

mfat-1转基因小鼠通过促进神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤

目的:验证mfat-1转基因小鼠是否通过促进成体神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤。方法:在体外实验中,分离并培养mfat-1转基因小鼠和同窝阴性鼠的成体神经干细胞,进行氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)造模,检测神经干细胞增殖情况;在体内实验中,对mfat-1转基因小鼠及其同窝阴性对照小鼠进行缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)造模,检测成体神经干细胞的增殖能力。结果:成功构建HIBD小鼠模型和神经干细胞体外培养体系。mfat-1转基因小鼠来源的成体神经干细胞的增殖能力较野生型小鼠来源的成体神经干细胞更强;与野生型小鼠比较,mfat-1转基因小鼠神经干细胞增殖能力显著增强且行为学改善。结论:mfat-1转基因小鼠通过促进神经干细胞增殖修复小鼠HIBD。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白功能特征与相关疾病研究进展

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)作为最大的一类膜蛋白受体家族,可被多种配体激活并发挥相应的信号转导功能,参与生物体内重要的生理过程。G蛋白偶联受体相关分选蛋白(G protein-coupled receptors associated sorting proteins,GASPs)则对内吞后的GPCRs分选过程发挥着重要的作用,并介导受体进入降解或再循环途径,进而调控细胞的信号转导等过程。研究发现GASPs的功能缺陷与多种疾病相关,包括神经系统疾病、肿瘤和耳聋等。本文重点介绍了G蛋白偶联受体相关分选蛋白的功能特征及其相关信号通路,描述了GASPs功能缺陷与疾病的关联性及家族蛋白与GPCRs的相互作用、GASPs分选途径的发现、参与的信号通路及对基因转录调控,以期为GASPs相关多种疾病的治疗提供新的思路和策略。

甲状腺功能血清学指标结合超声检查在鉴别儿童毒性弥漫性甲状腺肿与慢性淋巴细胞性甲状腺炎中的价值

目的:分析毒性弥漫性甲状腺肿[又称格雷夫斯病(Graves disease,GD)]和慢性淋巴细胞性甲状腺炎[又称桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)]患儿的甲状腺功能血清学指标和超声检查表现,为临床鉴别儿童GD与HT甲状腺功能亢进(甲亢)期提供依据。方法:选取2016年1月至2019年12月间南京医科大学附属儿童医院内分泌科确诊的GD和HT患儿共226例(年龄为7~14岁),其中GD组患儿124例,HT甲亢组患儿38例,HT甲状腺功能减退(甲减)组患儿64例。另选200名同期且年龄匹配的健康体检儿童作为对照组。用电化学发光免疫测定检测患者及对照者的甲状腺功能血清学指标,包括游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、抗甲状腺过氧化物酶自身抗体(anti-thyroid peroxidase autoantibody,anti-TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody,anti-TGAb)、促甲状腺激素受体抗体(thyroid stimulating hormone receptor antibody,TRAb)。同时记录患者及对照者的甲状腺超声检查指标,包括甲状腺左右叶横径及前后径、峡部前后径和彩色多普勒血流成像(color Doppler flow imaging,CDFI),比较GD组与HT甲亢组间上述临床数据的差异。结果:与HT甲亢组比较,GD组患儿TRAb水平升高[(18.98±20.11)IU/L比(0.33±0.41)IU/L],anti-TPOAb[(176.10±188.84)IU/mL比(219.65±203.66)IU/mL]和anti-TGAb[(242.40±632.15)IU/mL比(471.56±361.12)IU/m]水平降低。进一步分析3种甲状腺自身抗体的阳性率,结果发现,GD组的TRAb阳性率(93%)高于HT甲亢组(33%),HT甲亢组的anti-TPOAb(93%)和anti-TGAb(84%)阳性率高于GD组(52%和49%)(P均<0.05)。与HT甲亢组(35%)相比,GD组CDFI报告血流丰富率高(94%)(P<0.05),余超声指标无差异。结论:儿童GD与HT甲亢期的临床表现相近,超声检查提示肿大甲状腺体积相近;患儿的TRAb水平升高和CDFI报告血流丰富时,多提示为GD;当anti-TPOAb、anti-TGAb水平升高和CDFI报告血流不丰富时,则多提示患儿为HT甲亢期。鉴别二者时,超声CDFI检测血流可提供鉴别GD与HT甲亢期的参考信息。

组蛋白去乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎发育及胚层分化的影响

目的:探讨组蛋白乙酰化修饰对非洲爪蛙胚胎早期发育以及三胚层分化的影响。方法:用400 nmol/L的曲古抑菌素A(trichostation A,TSA)处理2细胞时期的胚胎,观察胚胎发育的情况,并通过整体原位杂交的方法检测胚层标记基因的表达;通过显微注射组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)特异性的反义寡核苷酸(HDAC1MO)实现HDAC1基因的敲降,利用整体原位杂交检测胚层标记基因的表达。结果:TSA处理造成胚胎发育异常,TSA处理和敲降HDAC1影响胚层标记基因的表达。结论:组蛋白去乙酰化酶在胚胎早期发育的过程中参与胚层的分化。

卵巢癌中抑癌因子SUFU的表达变化及意义

目的:探讨卵巢癌中抑癌因子SUFU(suppressor of Fused)表达变化及其意义。方法:通过免疫组化检测人卵巢癌和癌旁组织样本中SUFU的表达量,并在数据库大样本和细胞水平上进行验证。同时在人正常卵巢上皮细胞系IOSE80和卵巢癌细胞系SKOV3分别抑制和过表达SUFU后,运用MTT、EdU、流式细胞术、Western blot、Transwell、平板克隆形成实验等方法分别检测细胞的增殖、凋亡、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、迁移与侵袭的情况,并随后用Western blot和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)检测Sonic Hedgehog(SHH)信号通路的下游靶基因GLI1蛋白和m RNA水平。结果:在3例卵巢癌组织样本中,相比于癌旁组织,癌组织中SUFU蛋白表达有一定下调,而这个结果在TCGA数据库大样本中也得到验证;此外在细胞水平上,人正常卵巢上皮细胞IOSE80中SUFU蛋白和m RNA表达水平明显高于卵巢癌细胞SKOV3。进一步在SKOV3细胞中过表达SUFU能够有效抑制其增殖、EMT、克隆形成、迁移和侵袭,促进凋亡;相反,在IOSE80细胞中下调SUFU则能够促进细胞EMT、迁移和侵袭能力。同时,相比正常卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞中GLI1 mRNA和蛋白水平明显上升;当在卵巢癌细胞中上调SUFU时,SHH信号通路的下游靶基因GLI1的表达则明显下调。结论:SUFU能够抑制卵巢癌的发生发展,其作用机制与SHH信号通路相关。

磷酸化修饰增强Sufu对髓母细胞瘤的抑癌作用

目的:探讨在髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)中磷酸化修饰对Suppressor of fused(Sufu)抑癌活性的调节和潜在机制。方法:免疫组化分析MB组织芯片中Sufu的表达及磷酸化水平。在MB细胞系DAOY中转染野生型Sufu或其磷酸化位点突变质粒,分别通过细胞免疫化学染色、Western blot、CCK8、EdU标记、细胞流式检测等分析Sufu的核浆分布以及转染细胞的增殖、凋亡等指标,通过荧光素酶报告基因实验检测转染细胞Hedgehog(Hh)信号通路下游胶质瘤相关癌基因同源物(hlioma-associated oncogene homologue,Gli)的转录活性,Western blot检测鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC1)的表达水平。结果:Sufu在MB组织的表达明显高于正常小脑,并呈现磷酸化的修饰状态。磷酸化Sufu主要聚集在细胞核。Sufu能抑制DAOY细胞的增殖及克隆形成,促进细胞凋亡。非磷酸化的Sufu突变体抑癌作用明显减弱。已知在Hh通路下游,Gli介导的转录活化以及ODC1介导的多胺合成增加均可以促进MB细胞的生长。磷酸化Sufu抑制Gli介导的转录活化,非磷酸化Sufu对Gli的抑制作用减弱,并促进ODC1的表达。结论:Sufu发生磷酸化修饰后,对MB的抑制作用增强,其机制可能与抑制Hh信号下游的Gli转导活性和细胞的多胺代谢有关。

OSBPL2基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关特征的分析

目的:分析氧化固醇结合样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关的表型特征和可能机制。方法:将3月龄野生型(wild type,WT)和OSBPL2缺陷型(mutant type,MT)巴马小型猪饲喂高脂饲料(high fat diet,HFD)。喂食9个月后检测体重、皮下脂肪厚度,HE染色观察肝脏脂肪变性,电镜观察肝脏组织亚细胞结构,检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等生化指标,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肝脏脂肪合成分化相关基因的变化,Western blot及免疫组织化学法检测脂肪酸结合蛋白4(adipocyte fatty acid binding protein 4,FABP4)及酰基辅酶A氧化酶1(acylcoenzyme A oxidase 1,ACOX1)蛋白表达水平。结果:MT-HFD组体重、皮下脂肪厚度明显高于WT-HFD组(P<0.05);HE染色结果显示,MT-HFD组脂肪细胞显著增大(P<0.001);MT-HFD组肝脏脂肪空泡变性明显多于WT-HFD组。qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色结果发现,MT-HFD组肝组织中FABP4蛋白含量明显增加,ACOX1蛋白明显减少;电镜结果显示MT-HFD组肝脏线粒体相关内质网膜长度变短。结论:OSBPL2缺陷引起巴马小型猪肥胖相关表型特征,可能与抑制脂肪酸β-氧化、影响能量代谢平衡及促进脂肪分化有关。

IGFBP7促进人脐带间充质干细胞的软骨分化

目的:探究胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor-binding protein 7,IGFBP7)对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)软骨分化的影响。方法:用软骨诱导培养基高密度成球培养hUC-MSCs,诱导成软骨分化,通过real-time PCR和Western blot检测软骨分化标志基因Sox9的表达,甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖的表达,以反映细胞外基质沉积情况;real-time PCR和Western blot检测IGFBP7在hUC-MSCs软骨分化过程中的表达情况;在hUC-MSCs中分别瞬时转染IGFBP7的表达质粒和siRNA以改变内源性IGFBP7表达水平,然后成软骨诱导,采用甲苯胺蓝染色,real-time PCR和Western blot检测IGFBP7表达变化对于hUC-MSCs成软骨分化的影响。结果:在hUC-MSCs成软骨分化过程中,IGFBP7 mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高。与对照组相比,过表达IGFBP7的hUC-MSCs经成软骨诱导后,Sox9表达量显著升高,甲苯胺蓝染色更深,软骨分化能力更强。反之,敲低IGFBP7表达后,hUC-MSCs的软骨分化能力降低。结论:IGFBP7促进人脐带间充质干细胞成软骨分化。

USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究

目的:研究泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific peptidase 14,USP14)通过调控氧化固醇结合样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)的泛素化水平稳定OSBPL2表达的分子机制。方法:以HeLa细胞为工具细胞,通过对USP14过表达、敲降以及活性抑制,检测OSBPL2的表达水平;采用体外过表达实验考察USP14对OSBPL2的泛素信号和泛素化水平的调控;采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)阐明USP14与OSBPL2相互作用的具体结构域、不同结构域在蛋白相互作用中的作用以及OSBPL2的关键泛素化位点。结果:USP14与OSBPL2存在相互作用关系并稳定OSBPL2的表达而不改变其转录水平;体外过表达和Co-IP实验结果表明,USP14催化(catalytic,CAT)结构域与OSBPL2氧固醇结合蛋白相关结构域(OSBP-related domain,ORD)的相互作用降低OSBPL2的泛素化水平;类泛素(ubiquitin-like,UBL)结构域在USP14与OSBPL2相互作用中起到了促进作用;Lys209和Lys361是OSBPL2泛素化和去泛素化的关键位点。结论:USP14通过调控OSBPL2蛋白Lys209和Lys361两个位点的泛素化进而调控其泛素化水平,稳定OSBPL2蛋白的表达。

浆细胞性乳腺炎的病因与诊断的研究进展

浆细胞性乳腺炎(PCM)临床表现复杂,有多种描述性名称,如乳管周围型乳腺炎、乳管导管扩张症等。该疾病是一种以乳房红、肿、热、痛,乳头溢液、凹陷为主要症状,以导管扩张,可见大量浆细胞浸润为病理特征的非哺乳期良性乳腺疾病。PCM的病因包括自身免疫系统紊乱、细菌感染、乳腺结构异常、吸烟、年龄、药物等。诊断PCM的方法主要依靠临床表现、穿刺活检及影像技术等。目前发现PCM患者体内存在的异于健康人的生物学标志物主要涉及乳头溢液与血清中的肿瘤标志物、细胞间黏附分子、细胞因子等。

OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架

目的:探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法:采用OSBPL2基因敲除(Osbpl2-KO)HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能的影响;扫描电镜观察Osbpl2-KO小鼠毛细胞静纤毛形态;Western blot实验检测HEI-OC1细胞和耳蜗内Rho/ROCK信号通路关键效应因子Rho激酶2(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 2,ROCK2)、Lim激酶1(LIM domain kinase 1,LIMK1)、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1(actin depolymerizing factor/cofilin 1,ADF/CFL-1)的表达水平。结果:Osbpl2-KO HEI-OC1细胞微丝骨架中纤维肌动蛋白(F-actin)的分布明显减少,细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少,细胞迁移能力明显减弱;扫描电镜下观察发现Osbpl2敲除导致小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛变短且排列紊乱;Western blot检测结果表明,在HEI-OC1细胞和小鼠耳蜗中OSBPL2-KO均导致RhoA/ROCK2信号通路的抑制。结论:在听觉细胞中OSBPL2介导的RhoA/ROCK2信号通路在维持肌动蛋白细胞骨架形态和功能的过程中发挥重要的调控作用。

ApoE敲除导致小鼠耳蜗螺旋神经元功能损伤

目的:探究载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因缺陷引起小鼠耳蜗螺旋神经节处听神经损伤的可能机制。方法:对ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠进行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测,并分析波群振幅及延迟期。免疫荧光及HE染色分析耳蜗螺旋神经节内听神经及带状突触的病理损伤情况。蛋白质印迹、q RT-PCR等实验检测Lim激酶1(LIM domain kinase 1,Limk1)、丝切蛋白1(cofilin1)蛋白表达及磷酸化水平,并检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)通路激活情况。结果:ApoE-/-小鼠ABR检测中波Ⅰ的振幅缩短,延迟期延长。螺旋神经节处染色结果显示ApoE-/-小鼠带状突触及听神经纤维数量减少,并伴随结构受损。Western blot、qRT-PCR及免疫荧光染色发现Limk1与cofilin1在ApoE敲除后蛋白磷酸化水平出现显著性下降,同时PI3K通路激活被抑制。结论:ApoE基因缺陷会引起耳蜗螺旋神经节处带状突触及听神经损伤,并可能与神经元肌动蛋白细胞骨架密切相关。

DNA甲基化修饰对非洲爪蛙胚层分化的影响

目的:探讨DNA甲基化修饰对非洲爪蛙三个胚层分化的影响。方法:用30μmol/L的5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AZACdR)处理胚胎,抑制早期胚胎细胞内DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的活性,观察胚胎的表型,并收集原肠期胚胎通过原位杂交检测三胚层标记基因的表达情况;显微注射DNMT1特异的反义寡核苷酸(DNMT1MO)以敲降胚胎细胞内DNMT1的表达,然后通过原位杂交检测胚层标记基因的表达情况。结果:5-AZA-CdR处理导致胚胎早期发育异常,抑制中胚层标记基因Xbra的表达。敲降DNMT1促进背部中胚层标记基因GSC和Chordin的表达,抑制腹部中胚层标记基因Wnt8的表达。结论:DNA甲基化转移酶参与调节非洲爪蛙三胚层分化形成的过程。

CRISPR/Cas9介导下构建FN1敲除的DLD1细胞系及初步功能学研究

[目的]利用CRISPR/Cas9技术构建FN1基因敲除的人结直肠腺癌DLD1细胞系,并初步探讨FN1基因敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[方法]根据CRISPR/Cas9技术原理,设计针对FN1基因的crRNA,体外混合crRNA、tracrRNA、Cas9酶,形成核糖核蛋白(即RNP复合物)后转染至DLD1细胞,实现基因编辑。采用二维梯度稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术(Western Blotting)检测FN1基因敲除情况,通过CCK8、Transwell及划痕实验检测FN1敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[结果]测序结果表明,8号单克隆细胞系在靶点附近缺失1 366个碱基,造成FN1编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞的增殖及迁移能力明显降低。[结论]成功构建DLD1FN1-KO细胞系。初步证实,与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞在第5d增殖水平减慢约40%(P <0.001)、迁移水平减慢约27%(P <0.001)。

YBX1截短体抑制髓母细胞瘤DAOY的迁移和干性增殖能力

[目的]利用CRISPR/Cas9技术构建YBX1基因截短的SHH型髓母细胞瘤DAOY细胞系,探讨截短的YBX1对DAOY细胞迁移和干性增殖的影响。[方法]设计针对YBX1基因的sgRNA序列,并将其插入pX330载体构建sgYBX1表达质粒。DAOY细胞经pX330-sgYBX1和耐青霉素质粒转染,药筛后采用极限稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术检测YBX1基因编辑的情况,利用免疫荧光实验检测YBX1截短体在DAOY细胞内的定位情况,并通过CCK8、Transwell、克隆形成实验、低黏附板成球实验检测YBX1截短体对DAOY细胞增殖、迁移及干性的影响。[结果]测序结果表明,在DAOYYBX1-trunc细胞系中,YBX1基因编码区缺失144个碱基,导致合成肽段的第21~68氨基酸(位于A/P domain和CSD结构域)缺失。免疫荧光实验结果表明截短的YBX1蛋白定位富集在细胞核内。与未编辑细胞相比,DAOYYBX1-trunc细胞的增殖能力基本不变,但迁移能力减弱了50%,克隆形成能力削减了54%,细胞成球能力削减了68%。[结论]成功构建YBX1蛋白在21~68氨基酸截短的DAOY细胞系,其削弱了DAOY细胞的迁移及干性增殖能力。

非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及时空表达谱分析

[目的]克隆非洲爪蛙prmt5.L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5.L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5.L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5.L重组质粒。将p CS2+prmt5.L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5.L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5.L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5.L基因,原位杂交检测了prmt5.L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5.L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5.L重组质粒。prmt5.L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5.L蛋白在进化中非常保守。