PCR技术与病原染色法检测大鼠卡氏肺孢子虫的比较

目的：注射和口服氢化醋酸泼尼松龙诱导建立大鼠卡氏肺孢子虫肺炎动物模型。并比较不同检测方法的敏感性。方法：将20只雌性SD大鼠随机分为两组，一组皮下注射氢化醋酸泼尼松龙，另一组口服该药。观察两组大鼠卡氏肺孢子虫肺炎发病情况。取死亡大鼠的肺组织做印片进行病原学检查及提取DNA进行PCR检测。结果：20只实验大鼠的肺印片卡氏肺孢子虫检出率为：吉氏染色80％(16／20)，快速银染50％(10／20)，统计学分析显示二者之间差异显著(X^2=4．17,P<0．05)：PCR检出率为95％(19／20)，与吉氏染色比较无显著性差异(x^2=0．8，P>0．05)，与快速银染比较差异极显著(x^2=7.11，P<0.01)。结论：氢化醋酸泼尼松龙诱导下可成功建立卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型，检测方法以PCR最敏感，吉氏染色次之，快速银染较差。

IL-10在系统性红斑狼疮发病机制中的角色

系统性红斑狼疮的B细胞过度活化 ,细胞介导的免疫应答受损。而IL 10既是有效的B细胞刺激因子 ,又能抑制T细胞和抗原递呈细胞的功能 ,在SLE发病机制的免疫调节紊乱中扮演重要角色 :IL 10的基因与SLE易感性有关 ,在SLE病人的健康亲属体内IL 10也呈高表达 ,该因子还参与疾病状态下的细胞因子谱偏移及细胞调亡异常。IL

系统性红斑狼疮中的树突状细胞相关研究进展

系统性红斑狼疮中T细胞的过度活化可能与树突状细胞功能失调有关。发现其前体单核细胞和浆细胞样细胞功能紊乱 ,SLE的血清中含有IFN α的诱导物 ,可以促进正常单核细胞向树突状细胞的分化 ,髓样和淋巴样树突状细胞有异常迁移行为。

BAFF及其受体BAFF-R与SLE的关系

BAFF(BcellactivativingfactorbelongingtotheTNFfamily)即属TNF家族的B细胞活化因子 ,是新近发现的一个TNF家族成员。众多研究发现BAFF与B细胞的生存、增殖有密切关系 ,BAFF转基因鼠具有明显的SLE样症状。SLE病人血清中BAFF含量明显增高。本文就这方面的研究进展作一综述。

淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因克隆和序列分析

目的 获取淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因。 方法 通过正、反向抑制性差减杂交获取对溴氰菊酯抗药性和敏感性淡色库蚊的差异表达基因 ,并以基因芯片和逆 Northern对所获基因进行杂交鉴定。 结果 正、反向抑制性差减杂交各获得 5 2 3和 2 86个克隆 ,经芯片鉴定后在抗性品系高表达的基因分别有15 5个 (2～ 3倍 )和 42个 (3倍以上 ) ,在敏感品系中高表达的基因分别有 15个 (2～ 3倍 )和 9个 (3倍以上 )。对 3倍以上差异表达和特异表达基因进行单向测序 ,根据最高同源性比对结果 ,线粒体 r RNA基因、6 0 S核糖体蛋白基因、40 S核糖体蛋白 S4基因、胰蛋白酶前体基因、糜蛋白酶 A前体基因、视蛋白基因等在抗性品系中高表达 ;而 40 S核糖体蛋白 S2 9基因和肌球蛋白调控轻链 2在敏感品系中高表达 ;另外 ,1,4- α-葡聚糖分支酶和核糖体蛋白 46基因在抗性品系中特异表达。 结论 所获得的 13个差异表达基因和

淡色库蚊细胞色素P450抗性相关基因克隆与初步鉴定

[目的 ]探讨淡色库蚊细胞色素P45 0与溴氰菊酯抗药性的关系。 [方法 ]采用一对昆虫细胞色素P45 0简并引物 ,以反转录 聚合酶链反应从淡色库蚊扩增特异片段 ,T/A直接克隆法筛选阳性克隆 ,对新序列进行cDNA芯片和逆Northern分析。 [结果 ]从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系获得 112个阳性克隆 ,其中 2 4个阳性克隆测序后显示为细胞色素P45 0新序列 ,由GenBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等 4个亚家族 ;2 4个CYP4cDNA片段中 ,来自敏感品系的 2个片段(NYDS3和NYDS5 )和来自抗性品系的 4个片段 (NYDR6、NYDR9、NYDR15和NYDR17)在两品系间存在差别 ,cDNA芯片信号亮度值均是抗性品系大于敏感品系 ,倍数在 3 .1～ 9.7范围内 ;NYDR17仅与抗性探针杂交 ;逆Northern再鉴定 ,获得了与cDNA芯片一致的结果。 [结论 ]淡色库蚊CYP4与溴氰菊酯抗性相关 ;在淡色库蚊溴氰菊酯抗性机理中 ,可能存在P45 0基因点突变而导致的特异表达。

卫氏并殖吸虫基因片段的克隆与鉴定

目的 从卫氏并殖吸虫成虫cDDA文库中筛选并鉴定可用于免疫诊断和免疫预防的基因克隆。方法采用预吸收成虫抗原免疫兔血清(IRS,多抗)筛选阳性克隆,经PCR扩增后测定其插入片段的大小。序列分析后,对筛选的重组子进行双酶切,亚克隆入表达载体pRESETB,并转化大肠杆菌BL-21细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果 所筛选的阳性克隆插入片段约800bp。DNA序列分析显示其为编码半胱氨酸蛋白酶族组织蛋白酶L的基因序列。Pw-2重组子特异性表达产物约为32kDa,可被卫氏并殖吸虫免疫兔血清特异地识别。结论 从卫氏并殖吸虫成虫cDNA文库筛选的重组质粒Pw-2编码属于半胱氨酸蛋白酶族组织蛋白酶L。

卫氏肺吸虫成虫cDNA文库的多抗筛选

目的 :从卫氏肺吸虫成虫 c DNA文库中筛选并鉴定可用于免疫诊断和免疫预防的基因克隆。方法 :采用预吸收成虫抗原免疫兔血清 ( IRS,多抗 )筛选阳性克隆 ,经 PCR扩增后测定其插入片段的大小。用辅助噬菌体做体内剪切 ,以抗生素平板筛选含重组质粒的阳性菌落。选取插入片段不同的两个克隆测定其 DNA序列 ,用 BL AST软件对所得 DNA序列进行同源性比较。结果 :得到 P.w- 2 ,P.w- 4两个阳性克隆 ,长度分别为 80 1bp和 10 5 3 bp,分别与卫氏肺吸虫原组织蛋白酶 L和卫氏肺吸虫半胱氨酸蛋白酶基因同源 ,同源程度分别为 99%、86%。结论 :用卫氏肺吸虫成虫多抗筛选成虫 c DNA文库 ,所获 P.w- 2和 P.w-

用随机引物多态性DNA聚合酶链反应鉴别新的裂体吸虫X

目的 鉴定新的裂体吸虫χ的基因组 DNA。方法 应用随机引物多态性 DNA聚合酶链反应 (RAPD- PCR)对裂体吸虫χ(S.χ)和日本血吸虫 (S.j)的基因组 DNA进行分析鉴别。感染了S.χ和 S.j尾蚴的兔 4 5 d后杀死 ,各取成虫 5 0条 ,磨碎 ,用苯酚—氯仿抽提法提取基因组 DNA。反应在 PCR扩增仪上进行 ,应用 2 9个随机引物 ,1.4 %琼脂糖凝胶电泳后观察、照相。结果 2 9个引物中 2个引物 ,J0 1 碱基 CCCGGCATAA和 L1 2 碱基 GGGCGGTACT的扩增产物在两者间显示出明显的差异带。引物 J0 1 S.χ特异性条带 1条 ,S.j特异性条带 1条。引物 L1 2 S.χ特异性条带 3条 ,S.j特异性条带 1条。结论 S.χ和 S.j的基因组 DNA在 J0 1 和 L1 2 的 6个位点的序列有所不同 ,出现了差异带 ,这在种间进化方面有鉴别价值。

卫氏并殖吸虫基因片段的亚克隆及其表达的研究

目的:获得诊断肺吸虫病的特异性重组抗原,以了解其作为免疫诊断抗原的价值。方法:将免疫筛选获得的卫氏并殖吸虫基因克隆双酶切,所得cDNA片段亚克隆入表达载体pRESETB,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。结果:成功地将文库中2个大小不同的卫氏并殖吸虫基因片段连接到载体中。其中Pw-2重组子特异性表达产物是分子质量约为32ku的蛋白带,可被卫氏并殖吸虫免疫兔血清特异性识别。结论:成功构建了编码卫氏并殖吸虫特异性抗原的重组克隆Pw-2。

一种裂体吸虫与日本血吸虫蛋白质差异研究

目的 探讨裂体吸虫 x(S.x)和日本血吸虫 (S.j)的蛋白质有无差异。方法 采用 SDS-PAGE法。感染了 S.x和 S.j尾蚴的兔 45 d后剖杀 ,从肠系膜静脉血管中取出成虫 ,各 2 0对 ,匀浆 ,高速离心后取上清液 ,电泳 ,分离胶和浓缩胶分别为 10 %和 4%。电泳完成后以考马斯兰 R2 50 染色。应用分子分析软件系统 Gel Doc10 0 0 (BIO-RAD)进行分析 ,并计算出 S.x与 S.j的比值 (S.x/ S.j)。结果 S.x和 S.j蛋白带各有 2 6条 ,其中 3 5 .0 k Da和 10 9.8k Da为 S.x和 S.j分别特有的蛋白带 ,它们之间存在明显的差异 ;S.x和 S.j的 87.3 k Da,40 .9k Da和 3 2 .2 k Da蛋白质量差异达 2倍。 15 .2 k Da蛋白质量差异 1.9倍 ,73 .2 k Da蛋白质量差异 1.7倍。结论 S.x和 S.j成虫可溶性蛋白所分出的带数经定性、定量分析 。

用核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性

目的 用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。方法 用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中胰蛋白酶的表达差异 ,用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northernblot检测淡色库蚊的抗药性。结果 逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的 4 33倍。以其为探针Northernblot检测显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达 ,抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的 3 90倍。结论 作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法 。

多发性硬化发病机制中异常T细胞迁徙的研究进展

多发性硬化 (multiplesclrosis ,MS)是中枢神经系统一种广泛脱髓鞘性自身免疫性疾病。它的发病机制是遗传、免疫和环境共同作用的结果 ,其机制涉及自身髓磷脂蛋白 (MBP)反应性T细胞异常活化后 ,对中枢神经组织的浸润和破坏。近年来 ,MS病程中外周血淋巴细胞的异常迁徙使人们对其细胞表面趋化因子、趋化因子受体和粘附分子的表达情况产生了兴趣。

M-CSF、IL-10对单核细胞IL-12、IL-18产生及HLA-DR和CD80表达的影响

目的 :探讨巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和白细胞介素 10(IL 10 )对人外周血单核细胞分泌IL 12、IL 18及细胞表面HLA DR和CD80表达的影响。方法 :从健康献血员血液中分离单核细胞并进行体外培养 ,分别以M CSF和IL 10单独及共同作用 ,收集上清 ,用ELISA法检测单核细胞IL 12和IL 18的分泌 ,用流式细胞术检测细胞表面HLA DR及CD80的表达。结果 :①M CSF能诱导单核细胞分泌IL 18(P <0 .0 5 ) ;IL 10则能抑制IL 18的产生 (P <0 .0 5 ) ,并拮抗M CSF增强LPS诱生IL 18的作用 (P <0 .0 5 )。M CSF和IL 10均能抑制单核细胞分泌IL 12 p4 0 (P <0 .0 5 ) ,并具有协同效应 (P <0 .0 5 )。②M CSF能诱导单核细胞表面HLA DR的表达 (P <0 .0 5 ) ;IL 10则可抑制HLA DR的表达 ,并拮抗M CSF对HLA DR的诱导作用。M CSF对CD80表达的影响不大 ,IL 10能促进CD80的表达。结论 :M CSF和IL - 10可通过对单核细胞分泌IL 12、IL 18及HLA DR和CD80表达的调节 ,影响T细胞的活化。

巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-10对人外周血单核巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-8的相互作用

目的:研究巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素(IL)-10对人外周血单核细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-8的诱生作用及相互影响。方法:自健康献血员血液中分离单核细胞进行体外培养,并以M-CSF、IL-10单独及共同作用,然后收集上清,以双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法和生物活性法测TNF-α,以ELISA法检测IL-8。结果:①M-CSF能诱导单核细胞分泌TNF-α(P<0.05),与脂多糖(LPS)具有诱生TNF-α的协同效应(P<0.05);IL-10则能抑制TNF-α的产生(P<0.05),并拮抗M-CSF增强LPS诱生TNF-α的作用(P<0.05);②M-CSF能诱导单核细胞分泌IL-8(P<0.05),IL-10则能抑制IL-8的分泌(P<0.01),并拮抗M-CSF对IL-8的诱生效应(P<0.05)。结论:M-CSF可以促进单核细胞释放炎性细胞因子,是体内重要的炎症性因子之一,而IL-10则是体内重要的炎症抑制因子,能拮抗M-CSF的致炎作用。

抗肝吸虫成虫单抗的制备及其在感染豚鼠血、尿循环抗原检测中的初步应用

目的 :制备抗肝吸虫成虫单抗 ,用于检测肝吸虫宿主血、尿中肝吸虫循环抗原 ( CAg)。方法 :采用杂交瘤技术 ,制备抗肝吸虫成虫单抗 ,经鉴定、筛选后 ,以特异性、敏感性均高的单抗做双抗体夹心 EL ISA,检测肝吸虫动物宿主——感染豚鼠血、尿中的肝吸虫CAg。结果 :获得 4株稳定分泌抗肝吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株 D2 G8、D2 E1 1 、E1 1 H8和 H3B4 ,其 Ig类型鉴定结果均为 Ig G1,κ( kappa)型 ;其腹水单抗效价分别为 1∶ 640 0 0、1∶ 12 80 0 0、1∶ 3 2 0 0 0及 1∶ 2 0 0 0 ;其中 D2 G8、D2 E1 1 和 E1 1 H8的免疫组化显示均定位于肝吸虫成虫的皮层。其中 ,D2 G8、D2 E1 1 和 E1 1 H8与血吸虫、肺吸虫、姜片虫、牛丝虫成虫抗原和棘球蚴囊液、囊虫抗原均无交叉反应 ,H3B4 则仅与血吸虫成虫抗原有弱阳性交叉反应。以混合 D2 E1 1 、E1 1 H8株单抗作包被抗体 ,以 D2 G8株单抗作酶标抗体 ,建立 EL ISA夹心法进行检测。感染豚鼠血、尿中肝吸虫 CAg检出率分别为 95 .4 %和 90 .9% ,CAg平均检出量分别为 0 .3 3 7μg/ml和 0 .13 4 μg/ml。血、尿 CAg联合检测检出率则可达 10 0 %。结论 :抗肝吸虫单抗 D2 E1 1 、E1 1 H8及酶标 D2 G8联合 EL ISA检测肝吸虫宿主血、尿中肝吸虫CAg具有高度的敏感性和特异性 ,对?

树突状细胞的发育、亚群及其对T细胞应答类型的调控

树突状细胞 (DC )的发育可分为未成熟和成熟两个阶段 ,未成熟DC在捕捉抗原后向外周淋巴组织的T细胞区迁移并成熟 ,成熟DC能表达丰富的MHC分子和协同刺激分子。未成熟DC通过诱导无能的和调节性T细胞导致免疫耐受 ,而成熟DC具有超强的激活初始T细胞能力。DC至少可分为三个亚群 ,不同亚群的DC在激活Th1/Th2、CTL应答方面存在差异 ,但最近的研究显示DC对T细胞应答类型的调控受多种因素的综合影响 :包括微生物的产物或佐剂、DC表面的信号受体、DC亚群、局部的微环境和附近T细胞及其他细胞产生的细胞因子。因此 。

M-CSF和IL-10对人单核细胞表面分子表达的影响

本文采用流式细胞术检测人外周血单核细胞表面CD14、CD2 3、CD6 4、CD11b、CD18、CD2 9表达 ,研究巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF )和白细胞介素 (IL ) 10对单核细胞炎症效应和免疫效应功能的影响。结果显示 ,(1)M CSF诱导单核细胞表面CD14及CD2 3分子的表达 (P <0 0 5 )。IL 10抑制CD2 3的表达 ,促进CD6 4的表达 ,并协同M CSF诱导单核细胞CD14的表达 ,拮抗M CSF对CD2 3的诱导作用。M CSF能协同IL 10对单核细胞CD6 4的诱导作用 ;(2 )M CSF能诱导单核细胞表面CD11b及CD18的表达 (P <0 0 5 )。结论 :M CSF通过促进单核细胞表面CD11b、CD18、CD14、CD2 3的表达及协同促进CD6 4的表达而促进单核细胞粘附、炎性渗出、IgG及IgE依赖的细胞杀伤和吞噬功能 ,促进单核 巨噬细胞在炎症反应、体液免疫应答效应阶段发挥效应细胞功能。IL 10通过促进CD6 4的表达 ,增强体液免疫应答效应阶段单核 巨噬细胞的免疫效应功能 ,但通过抑制CD2 3的表达 ,下调IgE介导的体液免疫效应。